綿羊Follistatin基因表達(dá)及其結(jié)構(gòu)域的功能分析

張寧，張雪梅，劉明軍，譚立新

1 新疆維吾爾自治區(qū)動(dòng)物生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830000

2 新疆畜牧科學(xué)院 農(nóng)業(yè)部草食家畜繁育生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830000

動(dòng)物及獸醫(yī)生物技術(shù)

綿羊Follistatin基因表達(dá)及其結(jié)構(gòu)域的功能分析

張寧1,2，張雪梅1,2，劉明軍1,2，譚立新1,2

1 新疆維吾爾自治區(qū)動(dòng)物生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830000

2 新疆畜牧科學(xué)院 農(nóng)業(yè)部草食家畜繁育生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830000

為研究羊Follistatin基因的功能，提取了綿羊卵巢總RNA，通過(guò)RT-PCR方法獲得羊Follistatin cDNA的完整開放閱讀框 (1 038 bp)。去除信號(hào)肽序列后與原核表達(dá)載體pET41a連接，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pFSsig?，經(jīng)大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)獲得FS sig?蛋白 (66 kDa)。通過(guò)RT-PCR克隆了包含N端和結(jié)構(gòu)域1的Follistatin突變體 (FS N+D1)，將FS N+D1片段插入慢病毒載體 (pLEX-MCS) 構(gòu)建了pFS-N+D1慢病毒重組表達(dá)質(zhì)粒。在293T細(xì)胞中進(jìn)行慢病毒的包裝，再感染綿羊肌肉原代細(xì)胞，得到穩(wěn)定表達(dá)FS N+D1的肌肉細(xì)胞系，通過(guò)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線結(jié)果顯示穩(wěn)定表達(dá)FS N+D1的肌肉細(xì)胞明顯比正常肌肉細(xì)胞增殖快，且差異極顯著 (P＜0.01)，表明綿羊FS N+D1結(jié)構(gòu)域有促進(jìn)肌肉細(xì)胞生長(zhǎng)的功能。

綿羊Follistatin基因，原核表達(dá)，慢病毒，細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

Abstract:In order to study ovine follistatin function, we amplified the total of 1 038 base pair of ovine complete follistatin cDNA and cloned into pGEM-T vector by RT-PCR from ovine ovary RNA. After removal of the signal peptide it was subcloned into the pET41a to construct the prokaryotic expression vector, named pFSsig?. SDS-PAGE and Western blotting identified the 66 kDa product of the expression of follistatin cDNA. Based on the complete CDS sequence, we cloned follistatin N-terminal domain and domain 1 with PCR and inserted into pLEX-MCS lentiviral vector, named pFS-N+D1. After package and passage of lentivirus in 293T cells, and then infected sheep primary muscle cells (SPMC). The expression of FS N+D1 in SPMC was assayed by Western blotting. The cell growth curve of the infected SPMC and noninfected control cells displayed that FS N+D1 stablly transfected SPMC proliferated significantly faster than the control cells (P<0.01). Our data inferred that ovine FS N+D1 domain had the function to stimulate sheep muscle cell growth.

Keywords:ovineFollistatingene, prokaryotes expression, lentivirus, cell growth curve

卵泡抑素 (Follistatin，F(xiàn)S) 是1987年自卵泡液 中分離的一種前垂體細(xì)胞分泌的對(duì)卵泡刺激素(Follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH) 起拮抗作用的單鏈多肽，富含半胱氨酸，又名垂體促卵泡素抑制蛋白 (FsH-suppressing protein，F(xiàn)sP)，隨后發(fā)現(xiàn)FS能與激活素 (Activin) 結(jié)合，對(duì)卵母細(xì)胞的成熟和卵泡的發(fā)育[1]、精子的生成[2]、胚胎發(fā)育與分化、催產(chǎn)素的釋放等起著重要的調(diào)節(jié)作用。FS基因敲除小鼠研究表明FS基因的缺失能引起肌肉、皮膚等生長(zhǎng)發(fā)育的異常[3]。FS對(duì)TGF-β超家族許多成員具有拮抗作用，因此對(duì)不同細(xì)胞如神經(jīng)細(xì)胞[4]、成骨細(xì)胞[5]、肌肉細(xì)胞、紅細(xì)胞生成[6]等有廣泛的調(diào)節(jié)作用，具有多方面的生物學(xué)功能[7]。肌肉抑制素基因(Myostatin，簡(jiǎn)稱MSTN) 屬轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β超家族(Transforming growth factor-β super family，TGF-β)成員，是一種抑制肌肉細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的負(fù)調(diào)控基因[8]，也是目前已知的最強(qiáng)的骨骼肌生長(zhǎng)抑制物[9-10]。該基因的突變失活，能阻斷MSTN對(duì)肌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的抑制作用，引起所謂的“雙肌性狀”。最近研究表明 FS與畜禽骨骼肌發(fā)育有密切的關(guān)系。FS能與MSTN C-端競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，抑制MSTN跟受體結(jié)合，阻斷下游信號(hào)傳導(dǎo)，減弱MSTN對(duì)肌肉生長(zhǎng)的抑制作用，引起轉(zhuǎn)基因小鼠肌肉異常增生肥大，肌纖維的直徑增長(zhǎng)28%，單位面積肌纖維數(shù)量增長(zhǎng)66%[10]。

對(duì)人FS晶體結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)FS由3個(gè)結(jié)構(gòu)域、N端及C端區(qū)組成，1～63位氨基酸為N端區(qū)，64～136位氨基酸為結(jié)構(gòu)域1 (D1)，137～211位氨基酸為結(jié)構(gòu)域 2 (D2)，212～288位氨基酸為結(jié)構(gòu)域 3 (D3)，288～315位氨基酸為C端區(qū)[11]。FS的每個(gè)結(jié)構(gòu)域都有不同的配體結(jié)合活性，F(xiàn)S結(jié)構(gòu)域2與Activin結(jié)合能力強(qiáng)，結(jié)構(gòu)域1是與MSTN結(jié)合的最小區(qū)域，且結(jié)合能力在3個(gè)結(jié)構(gòu)域中最強(qiáng)，刪除FSD2或用D1替代D2后仍然表現(xiàn)出與MSTN強(qiáng)有力的結(jié)合能力[12]。目前對(duì)人及小鼠FS各結(jié)構(gòu)域功能的研究已有很多，但在家畜方面的研究還未見(jiàn)詳細(xì)報(bào)道，為進(jìn)一步研究綿羊FS對(duì)肌肉細(xì)胞生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)作用，本研究克隆了綿羊 FS全長(zhǎng) ORF，并在大腸桿菌中進(jìn)行了表達(dá)，在此基礎(chǔ)上克隆了N端及結(jié)構(gòu)域1 (N+D1)片段并構(gòu)建了慢病毒表達(dá)載體。通過(guò)慢病毒載體轉(zhuǎn)化綿羊肌肉細(xì)胞在綿羊肌肉細(xì)胞上研究了FS N+D1結(jié)構(gòu)域?qū)d羊肌肉細(xì)胞生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)功能，為今后研制促肌肉生長(zhǎng)制劑及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物打下了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌種、試劑、質(zhì)粒

載體 pET41a為本實(shí)驗(yàn)室保存；pLEX-MCS由美國(guó)克羅拉多大學(xué)李川源教授實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送；TRIzol、大腸桿菌感受態(tài)菌株 BL21 (DE3)、DH5α、鼠抗HIS、HA單抗均購(gòu)自北京天根公司；IRDye?800CW 標(biāo)記的羊抗鼠 IgG抗體購(gòu)自美國(guó) LI-COR Biosciences公司；限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、IPTG等試劑均購(gòu)自大連TaKaRa公司；反轉(zhuǎn)錄酶、小量質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒購(gòu)自杭州博日公司；中量質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自 QIAGEN公司；LipofectamineTM2000購(gòu)自 Invitrogen公司；高糖DMEM、Opti-MEM購(gòu)自GIBCO公司；胎牛血清購(gòu)自HYCLONE公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.1.2動(dòng)物材料

實(shí)驗(yàn)中所用的綿羊卵巢取自天鷹屠宰廠；293T細(xì)胞、綿羊肌肉原代細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1RNA的提取、全長(zhǎng)cDNA及N+D1結(jié)構(gòu)域的克隆

取新鮮綿羊卵巢置于液氮中冷凍并進(jìn)行研磨后提取總 RNA，按反轉(zhuǎn)錄酶說(shuō)明書進(jìn)行 RT-PCR。參照牛 (GenBank Accession No. NM_175801)、羊FS基因序列 (GenBank Accession No. M63123) 進(jìn)行特異性引物設(shè)計(jì)。去除信號(hào)肽的FS (FS sig?) 上游引物為：5′-GTAAGCTTTAGGAAATTGCTGGCTCCG-3′，下游引物為5′-GGCTCGAGAGGGTTTACCACTCTA GAATG-3′，分別引入了Hind Ⅲ、XhoⅠ酶切位點(diǎn)。FS N+D1結(jié)構(gòu)域上游引物為：5′-AAGGATCCCTCA GGATGGCCCGTCCTA-3′，下游引物為：5′-TTCTCGAGTTAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAT TTACATTTGCCCTGGT-3′，分別引入了BamH I、XhoI酶切位點(diǎn)，下劃線部分為血球凝集素 (HA) 序列。去除信號(hào)肽后的FS PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min；95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸80s，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5 min。FS N+D1結(jié)構(gòu)域PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min；95℃變性30s，57℃退火40s，72℃延伸60s，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳并觀察結(jié)果。

1.2.2原核及慢病毒表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

FS全長(zhǎng)片段PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收后，用Hind III/XhoI酶切，與同樣酶切處理的pET41a載體進(jìn)行連接，F(xiàn)S N+D1片段PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收用BamH I/XhoI酶切，與同樣酶切處理的pLEX慢病毒載體進(jìn)行連接，熱擊法轉(zhuǎn)化 DH5α，挑選克隆進(jìn)行 PCR、酶切鑒定，挑選陽(yáng)性克隆送上海生工生物有限公司進(jìn)行DNA測(cè)序分析。重組質(zhì)粒分別命名為pFSsig?、pFS-N+D1。

1.2.3Fs sig?的原核表達(dá)及鑒定

將鑒定后的原核重組表達(dá)質(zhì)粒 pFSsig?和空載體質(zhì)粒pET41a分別轉(zhuǎn)化宿主菌大腸桿菌BL21。分別挑選單菌落接種到3 mL含Kan+的LB培養(yǎng)基中，于37℃劇烈搖動(dòng)培養(yǎng)12 h，取上述培養(yǎng)物按1∶100的比例接種到2個(gè)5 mL含Kan+的新鮮LB培養(yǎng)基中，37℃劇烈搖動(dòng)培養(yǎng)1.5 h，使菌液的OD600達(dá)到0.6～0.8。取1 mL作為誘導(dǎo)前對(duì)照，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h。收集培養(yǎng)液，6 000 r/min離心10 min，棄上清。用PBS漂洗菌體沉淀，加入適量PBS重懸菌體沉淀，再加入2×SDS上樣緩沖液混勻，煮沸10 min后，按常規(guī)方法進(jìn)行SDS-PAGE電泳并以考馬斯亮藍(lán)染色。同時(shí)進(jìn)行Western blotting免疫印跡，使用的His標(biāo)簽為載體自帶，具體方法如下：將凝膠放入電轉(zhuǎn)緩沖液中，濕轉(zhuǎn)法35 V轉(zhuǎn)印110 min后5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，一抗為鼠抗HIS單抗1∶8 000稀釋，4℃過(guò)夜孵育，PBST洗滌5次，每次10 min，二抗為IRDye?800CW標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體1∶12 000稀釋，室溫孵育50 min，PBST洗滌5次，每次10 min，最后用PBS洗滌1次，Odyssey近紅外雙色激光成像系統(tǒng) (Li-COR Biosciences) 掃描成像。

1.2.4綿羊原代肌肉細(xì)胞培養(yǎng)

將2月齡胎羊用Hanks液清洗3次，剪開皮膚用攝子剪下肌肉組織，去除結(jié)締組織及脂肪，剪碎至2～3 mm3的小塊，加入0.2%的Ⅱ型膠原酶8 mL，移至15 mL離心管中，37℃消化1.5 h，每隔20 min取出用吸管吹打，取出消化液鏡下觀察至消化成單個(gè)細(xì)胞，用不銹鋼網(wǎng)過(guò)濾消化液至15 mL離心管中，1 000 r/min離心10 min，棄上清，用含10%血清及1%雙抗的DMEM 8 mL重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至1.5×105個(gè)/mL，放入細(xì)胞瓶中37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h，按常規(guī)方法傳代培養(yǎng)。

1.2.5FS N+D1重組慢病毒的包裝及穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的建立

用DMEM (含10% FCS) 培養(yǎng)液培養(yǎng)293T細(xì)胞，待匯合度達(dá)到90%時(shí)用0.05%胰蛋白酶消化傳代，取5×105個(gè)細(xì)胞鋪入6孔培養(yǎng)板中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合度達(dá)到70%～80%時(shí)將pFS-N+D1 重組質(zhì)粒 2 μg，包裝質(zhì)粒 pSPAX2 1.5 μg，包膜質(zhì)粒pMD2.G 0.5 μg，按 LipofectamineTM2000說(shuō)明書進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育3 h后換為正常DMEM (含10% FCS) 培養(yǎng)液，次日上午移至 32℃、5% CO2培養(yǎng)箱，同時(shí)正常細(xì)胞作對(duì)照。48 h后收集上清液，用0.45 μm過(guò)濾器過(guò)濾，收集濾過(guò)液保存于?70℃。

將培養(yǎng)好的綿羊肌肉原代細(xì)胞用 0.05%胰蛋白酶消化后取5×105個(gè)細(xì)胞鋪入6孔培養(yǎng)板中，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后進(jìn)行病毒感染，移出正常培養(yǎng)液，加入解凍的病毒液 1 mL，按終濃度為10 μg/mL加入聚凝胺 (Polybrene)，細(xì)胞置于32℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育過(guò)夜，次日上午移回37℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育，8 h后更換正常培養(yǎng)液，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。病毒感染48 h后，按常規(guī)方法將細(xì)胞轉(zhuǎn)入10 cm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞貼壁后加入600 ng/mL的puromycin進(jìn)行加壓篩選，3 d后更換含同樣濃度的 puromycin選擇性培養(yǎng)液，同時(shí)設(shè)置正常細(xì)胞對(duì)照組，待 7 d后即可得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的綿羊肌肉細(xì)胞在10 cm培養(yǎng)皿中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，取細(xì)胞裂解物后進(jìn)行 Western blotting免疫印跡檢測(cè)。

1.2.6綿羊肌肉細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的繪制

將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞更換正常培養(yǎng)液后，培養(yǎng)至90%匯合，消化計(jì)數(shù)鋪入24孔培養(yǎng)板，每孔細(xì)胞數(shù)為 1×104個(gè)，分 7組，每組 3孔，同時(shí)設(shè)置正常細(xì)胞對(duì)照組。培養(yǎng)1周，期間3 d換液1次，逐日檢測(cè)一組，計(jì)數(shù)。最后把7 d的細(xì)胞數(shù)值繪成圖，即為細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，上述實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3次后獲得數(shù)據(jù)用SPSS12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 FS sig?及FS N+D1結(jié)構(gòu)域的克隆

通過(guò)RT-PCR及PCR擴(kuò)增，獲得1 038 bp的FS ORF序列及948 bp的去除信號(hào)肽的FS序列 (圖1)，經(jīng)PCR、酶切及測(cè)序鑒定，與GenBank中牛FS cDNA進(jìn)行 Blast比對(duì)，結(jié)果表明序列一致性為 98%。在此基礎(chǔ)上擴(kuò)增的FS N+D1結(jié)構(gòu)域，獲得495 bp的DNA片段，大小與預(yù)期結(jié)果一致 (圖2)。

圖1 Follistatin ORF及sig?的PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR products of Follistatin ORF and Follistatin sig?. 1:PCR products of FS sig?; 2: PCR products of FS ORF; M:100 bp marker.

圖2 FS N+D1的PCR擴(kuò)增Fig.2 PCR products of Follistatin N+D1. 1: PCR products of FS N+D1; M: 150 bp marker.

2.2 Fs sig?在大腸桿菌中的表達(dá)及鑒定

從SDS-PAGE結(jié)果 (圖3) 可以看出，誘導(dǎo)后的樣品有明顯的蛋白表達(dá)條帶，其表達(dá)產(chǎn)物的分子量約為66 kDa，與理論推算值一致。Western blotting免疫印記實(shí)驗(yàn)顯示：經(jīng)誘導(dǎo)后的表達(dá)產(chǎn)物在66 kDa處呈現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果 (圖4)，說(shuō)明克隆的FS sig?在大腸桿菌得到了高效表達(dá)。

圖3 pFS sig?的SDS-PAGE檢測(cè)Fig.3 SDS-PAGE analysis of FS sig?expression products inE. coli. M: prestained protein ladder; 1: pET41a after IPTG induction; 2: pFS sig?His before IPTG induction; 3: pFSsig?His after IPTG induction.

圖4 pFSsig?的Western blotting檢測(cè)Fig.4 Western blotting analysis of FS sig?expression products inE. coli. M: prestained protein ladder; 1: pET41a after IPTG induction; 2: pFSsig?His before IPTG induction; 3:pFSsig?His after IPTG induction.

2.3 綿羊原代肌肉細(xì)胞培養(yǎng)、重組慢病毒的包裝及穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的建立

37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h后傳代培養(yǎng)的綿羊原代肌肉細(xì)胞在鏡下觀察可見(jiàn)形態(tài)為長(zhǎng)梭形均勻生長(zhǎng)，狀態(tài)良好 (圖 5)。重組質(zhì)粒 pFS-N+D1轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞48 h后，收集并裂解細(xì)胞后用HA單克隆抗體做Western blotting免疫印跡檢測(cè)，可見(jiàn)在18 kDa處有特異性條帶出現(xiàn)，說(shuō)明病毒包裝成功并能表達(dá)FS N+D1重組蛋白，且與預(yù)期大小一致 (圖6)。用包裝病毒感染綿羊肌肉原代細(xì)胞加壓篩選7 d后，正常細(xì)胞對(duì)照組全部死亡，而經(jīng)感染的綿羊肌肉原代細(xì)胞生長(zhǎng)良好；收集并裂解細(xì)胞進(jìn)行Western blotting免疫印跡檢測(cè)，結(jié)果顯示在18 kDa處有特異性條帶出現(xiàn)，說(shuō)明在綿羊肌肉原代細(xì)胞中可以穩(wěn)定表達(dá)FS N+D1重組蛋白，即得到穩(wěn)定表達(dá)的綿羊肌肉細(xì)胞系 (圖7)。

圖5 綿羊原代肌肉細(xì)胞 (100×)Fig.5 Sheep primary muscle cells (100×).

圖6 pFS-N+D1轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞Western blotting檢測(cè)Fig.6 Western blotting analysis of 293T cell by pFS-N+D1 transfection. 1: 293T cell; 2: pLEX-MCS transfected 293T cell;3: pFS-N+D1 transfected 293T cell; M: prestained protein ladder.

圖7 pFS-N+D1感染綿羊原代肌肉細(xì)胞Western blotting檢測(cè)Fig.7 Western blotting analysis of sheep primary muscle cell by pFS-N+D1 infection. 1: pFS-N+D1 infected sheep primary muscle cell; 2: pLEX-MCS infected sheep primary muscle cell;3: sheep primary muscle cell; M: prestained protein ladder.

2.4 綿羊肌肉細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的繪制

將穩(wěn)定表達(dá)肌肉細(xì)胞系與正常肌肉細(xì)胞傳至24孔培養(yǎng)板，其起始細(xì)胞數(shù)量一致，將 7 d的計(jì)數(shù)結(jié)果繪制成圖，細(xì)胞生長(zhǎng)曲線結(jié)果顯示表達(dá)了 FS N+D1蛋白的肌肉細(xì)胞在第 3～7天增殖較正常肌肉細(xì)胞快，在細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中第3天差異顯著 (P＜0.05)，第 4～7天均差異極顯著 (P＜0.01)，說(shuō)明在FS N+D1過(guò)量表達(dá)的情況下能顯著促進(jìn)綿羊肌肉細(xì)胞生長(zhǎng)(圖8)。

圖8 綿羊肌肉細(xì)胞生長(zhǎng)曲線Fig.8 Growth curve of sheep primary muscle cell.

3 討論

MSTN是目前已知的最強(qiáng)的骨骼肌生長(zhǎng)抑制物[10]，通過(guò)生物技術(shù)手段阻斷MSTN對(duì)肌細(xì)胞的抑制作用來(lái)促進(jìn)肌肉的生長(zhǎng)、減少脂肪的生成已成為目前動(dòng)物生物技術(shù)的研究熱點(diǎn)，國(guó)內(nèi)目前只對(duì)豬、牛等動(dòng)物的FS進(jìn)行了克隆，何新等[13]克隆了全長(zhǎng)1 038 bp豬FS cDNA的完整開放閱讀框，在大腸桿菌表達(dá)了63 kDa的GST-FS融合蛋白，該表達(dá)產(chǎn)物可作為飼料添加劑，以期達(dá)到促進(jìn)豬肌肉持續(xù)增長(zhǎng)的目的。趙振春等[14]克隆了牛FS cDNA并在大腸桿菌中表達(dá)44 kDa的HIS-FS融合蛋白，為促進(jìn)家畜肌肉的生長(zhǎng)提供了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)首次克隆了綿羊FS cDNA，與人、牛、鼠的標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對(duì)，同源性分別為93%、98%、90%。信號(hào)肽去除后構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒 pFSsig?進(jìn)行原核表達(dá)得到了66 kDa的融合蛋白，并以包涵體形式存在，為后續(xù)在體外研究FS各結(jié)構(gòu)域的功能做好前期準(zhǔn)備。

本研究為在短時(shí)間內(nèi)篩選到穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系，選擇使用的pLEX慢病毒載體是第2代慢病毒表達(dá)系統(tǒng)，該載體系統(tǒng)由包裝質(zhì)粒、包膜質(zhì)粒及載體質(zhì)粒組成。將慢病毒載體分成 3個(gè)質(zhì)粒，使其共同重疊序列最小化，降低了產(chǎn)生具有復(fù)制能力病毒的可能性，同時(shí)可獲得較高滴度的慢病毒[15]，因其缺乏HIV-1增強(qiáng)子及啟動(dòng)子序列，即使存在所有的病毒蛋白也不能轉(zhuǎn)錄出病毒RNA，因此該載體系統(tǒng)比第一代載體更安全可靠。慢病毒顆粒感染細(xì)胞快速、穩(wěn)定并且效率可高達(dá) 90%以上，篩選時(shí)間一般在7～10 d左右，可保證細(xì)胞的穩(wěn)定表達(dá)及良好狀態(tài)?；谝陨下《鞠到y(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)將FS N+D1片段克隆至 pLEX載體的多克隆位點(diǎn)上，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒與其包裝質(zhì)粒、包膜質(zhì)粒一起共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞48 h，得到病毒顆粒。因?yàn)樵?xì)胞不能無(wú)限傳代，篩選時(shí)間長(zhǎng)短決定細(xì)胞狀態(tài)的好壞，細(xì)胞代次高會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞核型發(fā)生改變，無(wú)法進(jìn)行后續(xù)轉(zhuǎn)基因研究，因此我們用病毒顆粒感染綿羊原代肌肉細(xì)胞，篩選7 d即得到了穩(wěn)定表達(dá)的綿羊肌肉細(xì)胞系，大大縮短篩選時(shí)間，提高篩選效率，避免細(xì)胞核型變化及細(xì)胞老化。

國(guó)外對(duì) FS的研究開始于 20世紀(jì) 90年代，用FS進(jìn)行了小鼠的轉(zhuǎn)基因研究，Lee[16]于2007年在肌肉專一性啟動(dòng)子的調(diào)控下將 FLRG (Follistatin related protein)及FS分別進(jìn)行小鼠轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)，在轉(zhuǎn)基因小鼠肌肉組織都能檢測(cè)到 FLRG或 FS的表達(dá)，而在非肌肉組織中無(wú)表達(dá)，且肌肉明顯增重，說(shuō)明FS或FLRG都有抑制MSTN的功能。由于FS有多種多樣的生物學(xué)功能，為了避免FS對(duì)其他生物學(xué)功能和繁育能力的影響，國(guó)外大多學(xué)者開始了FS結(jié)構(gòu)域的功能研究。Nakatani等[17]克隆了小鼠 FS的各個(gè)結(jié)構(gòu)域，比較了FS結(jié)合Activin和MSTN的活性，根據(jù)FS的晶體結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)結(jié)合MSTN最小結(jié)構(gòu)域?yàn)?FSD1。而 Schneyer等[12]分析 FS-ACT復(fù)合體，發(fā)現(xiàn) FSD2與 ACT結(jié)合力強(qiáng)，另外還證實(shí)了FSD1與 MSTN結(jié)合能力強(qiáng)。而在牛、羊等大動(dòng)物上至今仍沒(méi)有對(duì)FS的各個(gè)結(jié)構(gòu)域進(jìn)行研究的報(bào)道，因此本實(shí)驗(yàn)利用慢病毒系統(tǒng)建立了穩(wěn)定表達(dá) FS N+D1綿羊原代肌肉細(xì)胞系，在此基礎(chǔ)上繪制了正常細(xì)胞與穩(wěn)定表達(dá)FS N+D1細(xì)胞系的生長(zhǎng)曲線，根據(jù)生長(zhǎng)曲線，第1、2天細(xì)胞增殖緩慢，第3天開始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期并快速增殖，第 5天后趨于穩(wěn)定，符合細(xì)胞生長(zhǎng)規(guī)律。比較FS N+D1穩(wěn)定表達(dá)肌肉細(xì)胞系與正常肌肉細(xì)胞，結(jié)果顯示第1天與第2天沒(méi)有明顯差異。在細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，轉(zhuǎn)化細(xì)胞系的細(xì)胞增殖速度比正常肌肉細(xì)胞明顯加快，從第3天開始差異顯著 (P＜0.05)，到第 4～7天差異變?yōu)闃O顯著(P＜0.01)，說(shuō)明FS N+D1的表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖有明顯的促進(jìn)作用，證明了綿羊FSD1的功能與小鼠FSD1功能相似，能與MSTN結(jié)合并對(duì)細(xì)胞增殖起到促進(jìn)作用。但對(duì)于結(jié)合能力的強(qiáng)弱沒(méi)有與其他結(jié)構(gòu)域進(jìn)行比較，有待于進(jìn)一步研究。本項(xiàng)研究為下一步在綿羊上分析 FS各結(jié)構(gòu)域的功能和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的研究打下了基礎(chǔ)。

REFERENCES

[1] Silva CC, Knight PG. Modulatory action of activin A and follistatin on the developmental competence ofin vitromatured bovine oocytes.Biol Reprod, 1998, 58: 558–565.

[2] Boitani C, Tefanini M, Fragale A,et al. Activin stimulates sertoli cell proliferation in a defined period of rattestis development.Endocrinol, 1995, 136: 5438–5444.

[3] Matzuk MM, Lu N, Vogel H,et al. Multiple defects and perinatal death in mice deficient in follistatin.Nature,1995, 374: 360–363.

[4] Hashimoto M, Nakamura T, lnoue S,et al. Follistatin is developmentally regulated cytokine in neural differentiation.J Biol Chem, 1992, 267: 7203–7206.

[5] Hashimoto M, Shoda A, Inous S,et al. Functional regulation of osteobalastic cells by the interaction of activin-A with follistatin.J Biol Chem, 1991, 267:4999–5004.

[6] Shiozaki M, Sakai R, Tabuchi M,et al. Evidence for the participation of endogenous activin-A/erythroid differentiation factor in the regulation of erythro-poiesis.Proc Natl Acad Sci USA, 1992, 82:1553–1556.

[7] DePaoloLV, Biasak TA, Eriskson GF,et al. Follistatin and activin: a potent intrinsic regulatory system within diverse tissue.Prco Sco Exp Biol Med, 1991, 198: 500–512.

[8] Nakatani M, Takehara Y, Sugino H,et al.Transgenic expression of a myostatin inhibitor derived from follistatinincreases skeletal muscle mass and ameliorates dystrophic pathology in mdx mice.FASEB J, 2008, 22: 477–487.

[9] Wehling M, Cai B, Tidball JG. Modulation of myostatin expression during modified muscle use.FASEB J, 2000,14: 103–110.

[10] Lee SJ, McPherron AC. Regulation of myostatin activity and muscle growth.Proc Natl Acad Sci USA, 2001, 98:9306–9311.

[11] Keutmann HT, Schneyer AL, Sidis Y. The role of follistatin domains in follistatin biological action.Mol Endocrinol, 2004, 18(1): 228–240.

[12] Schneyer AL, Sidis Y, Gulati A. Differential antagonism of activin, myostatin and growth and differentiation factor 11 by wild-type and mutant follistatin.Endocrinology,2008, 149: 4589–4595.

[13] He X, Qi B, He LQ,et al. Porcine Follistatin cDNA cloning and expression inEscherichia coli.Chin JBiotech, 2006, 22: 677–681.

何新, 齊冰, 何立千, 等. 豬Follistatin cDNA克隆及在大腸桿菌中的表達(dá). 生物工程學(xué)報(bào), 2006, 22: 677–681.

[14] Zhao ZC. Cloning and prokaryotic expression of the bovine follistatin cDNA gene [D]. Beijing: China Agricultural University, 2004.

趙振春. 牛卵泡抑素 cDNA的克隆及其原核表達(dá)[D].北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué), 2004.

[15] Higashikawa F, Chang L. Kinetic analyses of stability of simple and complex retroviral vectors.Virology, 2001,280: 124–131.

[16] Lee SJ. Quadrupling muscle mass in mice by targeting TGF-? signaling pathways.PLoS ONE, 2007(8): e789.

[17] Nakatani M, Takehara Y, Sugino H,et al. Transgenic expression of a myostatin inhibitor derived from follistatin increases skeletal muscle mass and ameliorates dystrophic pathology in mdx mice.FASEB J, 2008, 22: 477–487.

OvineFollistatingene expression and functional analysis of follistatin domains

Ning Zhang1,2, Xuemei Zhang1,2, Mingjun Liu1,2, and Lixin Tan1,2

1Key Laboratory of Animal Biotechnology of Xinjiang,Urumqi830000,China
2Key Laboratory of Livestock Reproduction & Biotechnology of Ministry of Agriculture,Xinjiang Academy of Animal Science,Urumqi830000,China

Received:February 9, 2010;Accepted:May 13, 2010

Supported by:Project of High Technology Research and Development of Xinjiang (No. 200611106).

Corresponding author:Mingjun Liu. Tel: +86-991-4813258; Fax: +86-991-4841417; E-mail: xjlmj2004@yahoo.com.cn

新疆維吾爾自治區(qū)高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃 (No. 200611106) 資助。