利用大腸桿菌工程菌廉價(jià)高效生產(chǎn)聚羥基丁酸酯

魏國(guó)清，陳泉，康振，祁慶生

1 山東大學(xué) 微生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250100

2 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，南昌 330045

代謝工程

利用大腸桿菌工程菌廉價(jià)高效生產(chǎn)聚羥基丁酸酯

魏國(guó)清1,2，陳泉1，康振1，祁慶生1

1 山東大學(xué) 微生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250100

2 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，南昌 330045

利用大腸桿菌生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯是近來(lái)國(guó)際上生物可降解塑料的研究熱點(diǎn)，本研究通過(guò)對(duì)適宜于聚羥基脂肪酸酯生產(chǎn)的大腸桿菌菌株的選擇和碳源利用試驗(yàn)，初步確立了大腸桿菌代謝工程改造生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯的基礎(chǔ)。并在此基礎(chǔ)上，通過(guò)對(duì)大腸桿菌磷酸烯醇式丙酮酸葡萄糖轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)的改造和工程菌環(huán)境誘導(dǎo)系統(tǒng)的應(yīng)用，解決了大腸桿菌工程菌無(wú)法同時(shí)利用多種碳源合成聚羥基脂肪酸酯的難題。發(fā)酵試驗(yàn)證明，工程化改造的大腸桿菌利用廉價(jià)底物在5 L 發(fā)酵罐中分批培養(yǎng)32 h后，菌體終濃度能夠達(dá)到8.24 g/L，聚羥基脂肪酸酯占細(xì)胞干重的84.6%。

大腸桿菌，聚羥基脂肪酸酯，可降解塑料，發(fā)酵

Abstract:Based on the fermentation analysis ofEscherichia colistrains and cheap renewable resources suitable for polyhydroxybutyrate (PHB) production, we constructed aptsGmutant ofEscherichia coliDH5α. Application ofE. coliDH5α mutant together with stress-induced system, we could produce PHB efficiently from cheap renewable sugar mixture by the simultaneous consumption of different sugars. Batch fermentation at lab scale (5 liter) showed thatE. coliDH5α ΔptsG/pQKZ103 produced PHB from sugar mixture up to 84.6% of cell dry weight in 32 hours; meanwhile, the cell dry weight reached 8.24 g/L.

Keywords:Escherichia coli, PHB, biodegradable plastics, fermentation

聚羥基脂肪酸酯 (Polyhydroxyalkanoates，PHA)是微生物在不平衡生長(zhǎng)條件下形成的一類功能性生物聚酯。由于PHA具有生物可降解性、生物相容性、氣體阻隔性、壓電性、非線性光學(xué)活性以及由官能團(tuán)引起的其他特殊性能，因此它是一種優(yōu)良的生物可降解塑料，具有廣泛的應(yīng)用前景，受到國(guó)際上的普遍關(guān)注[1]。目前，由于石化原料的缺乏和環(huán)境問(wèn)題，生物可降解塑料領(lǐng)域已經(jīng)吸引了越來(lái)越多的關(guān)注，成為國(guó)際上研究的熱點(diǎn)。

利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)聚酯類可降解塑料是目前生產(chǎn)生物可降解塑料的主要途徑之一。自然界中許多屬、種的細(xì)菌在細(xì)胞內(nèi)都能積累 PHA作為能量和碳源的儲(chǔ)備，如產(chǎn)堿桿菌、甲基營(yíng)養(yǎng)菌及鞘細(xì)菌等[2-3]。微生物合成的 PHA含量可以達(dá)到細(xì)胞干重的 70%～80%，因此微生物是生產(chǎn)生物可降解塑料的良好宿主。但是，自然微生物中PHA的合成都是在碳源過(guò)量，限制氮、磷等生長(zhǎng)條件下產(chǎn)生的。在這種培養(yǎng)條件下，微生物的生長(zhǎng)不均衡影響了細(xì)胞的代謝和生長(zhǎng)，使得最終的產(chǎn)物產(chǎn)率并不高。而大腸桿菌作為一種研究得最為清楚的微生物，具有生長(zhǎng)快、培養(yǎng)簡(jiǎn)單、可以利用木糖等多種碳源、遺傳操作體系清楚等特點(diǎn)[4]，非常適合于用作微生物的細(xì)胞工廠生產(chǎn)能源和生物基化學(xué)品。并且，大腸桿菌不含有聚酯的降解酶，合成的PHB不會(huì)被降解；易于破碎，有利于PHA的提取純化[5]。

但是，野生大腸桿菌在利用混合糖生長(zhǎng)的時(shí)候會(huì)出現(xiàn)碳源代謝阻遏現(xiàn)象 (Carbon catabolite repression，CCR)，在生長(zhǎng)曲線上表現(xiàn)為菌體的二次生長(zhǎng)[6-7]。本課題組在前期的研究中通過(guò)改造編碼磷酸烯醇式丙酮酸葡萄糖轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng) (Carbohydrate phosphotransferase system，PTS) 中的葡萄糖轉(zhuǎn)移酶的ptsG基因，消除了CCR的影響，提高了大腸桿菌糖代謝的效率，為大腸桿菌同時(shí)利用多種糖的混合物提供了基礎(chǔ)[8]。另外，在傳統(tǒng)的基因工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)中都使用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG) 作為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)外源蛋白的表達(dá)。該方法具有一定的局限性：1) IPTG價(jià)格昂貴，生產(chǎn)成本高；2) IPTG對(duì)細(xì)胞具有一定毒性，會(huì)抑制菌體生長(zhǎng)；3) 加入誘導(dǎo)劑的時(shí)機(jī)不好掌握[9-10]。本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的一種依靠外界環(huán)境自發(fā)誘導(dǎo)的質(zhì)?？朔松鲜鋈秉c(diǎn)，能夠用于工業(yè)生產(chǎn)[11]。

因此，在以上分析和研究的基礎(chǔ)上，試圖建立一種適宜于工業(yè)化生產(chǎn)聚酯類生物可降解塑料的微生物菌株和方法，為生物可降解塑料的生產(chǎn)提供基礎(chǔ)。本研究以聚羥基丁酸酯 (PHB) 作為前期目標(biāo)，以工業(yè)生產(chǎn)木糖醇的廢液濃縮得到的“糖蜜”作為廉價(jià)的混合碳源，初步進(jìn)行了PHB的發(fā)酵試驗(yàn)?！疤敲邸笔怯衩仔舅庖涸谏a(chǎn)木糖醇之后的廢液經(jīng)濃縮后得到的，其總糖含量約為 60%。糖蜜中主要成分為木糖，約占總糖含量的65%以上，其次是葡萄糖，占總糖含量25%左右，另外還有少量的阿拉伯糖等。

1 材料與方法

1.1 菌種與質(zhì)粒

本研究中用到的菌種和質(zhì)粒見(jiàn)表1。

表1 菌種與質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids

1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：蛋白胨 10 g，酵母粉5 g，NaCl 10 g，加水定容至1 000 mL，調(diào)pH為7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基：Na2HPO4·12H2O 17.1 g，KH2PO43 g，NaCl 0.5 g，NH4Cl 1 g，1 mol/L 的 MgSO42 mL，0.1 mol/L的CaCl21 mL，10 mmol/L的硫胺素 5 mL，加水至1 000 mL，調(diào)pH為7.2。

1.3 主要儀器和試劑

生物反應(yīng)搖瓶柜 (上海欣蕊自動(dòng)化設(shè)備有限公司)，Gene Pulser Xcell 電穿孔系統(tǒng) (Bio-Rad)，高效液相色譜儀 LC-VP (Shimadzu)，氣相色譜儀GC2010 (Shimadzu)，5 L玻璃發(fā)酵罐 (上海保興生物設(shè)備工程有限公司)，PCR儀 (Bio-Rad)。DNA工具酶購(gòu)自 Fermentas公司，實(shí)驗(yàn)中用到的引物由Invitrogen公司合成。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.4 培養(yǎng)方法

種子培養(yǎng)：從平板挑取單菌落至裝有50 mL種子培養(yǎng)基的300 mL三角瓶中，置于37℃搖床中，240 r/min培養(yǎng)10 h。

發(fā)酵培養(yǎng)：將種子液以 5%接種量接入裝有300 mL培養(yǎng)基的1 000 mL三角瓶中，置于37℃搖床，240 r/min培養(yǎng)。

限氧培養(yǎng)：限氧培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)在生物反應(yīng)搖瓶柜中進(jìn)行。在裝有500 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的反應(yīng)瓶中按5%的接種量接入種子液。通過(guò)打開(kāi)和關(guān)閉通入各瓶的空氣閥門實(shí)現(xiàn)不同階段的限氧控制。

發(fā)酵罐分批培養(yǎng)：分批發(fā)酵在5 L發(fā)酵罐中進(jìn)行。用5 mol/L的NaOH溶液控制pH在6.8左右；通過(guò)調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速維持發(fā)酵前 12 h溶氧在 30%以上，從第12 h開(kāi)始到發(fā)酵結(jié)束控制溶氧在30%以下。

1.5 基因敲除

本研究采用 Red重組系統(tǒng)敲除大腸桿菌 DH5α中的ptsG基因，具體操作方法參見(jiàn)文獻(xiàn)[13]。敲除過(guò)程中用到的引物見(jiàn)表2。

表2 引物序列Table 2 Primers designed for gene knockout

1.6 檢測(cè)方法

1.6.1PHB檢測(cè)

準(zhǔn)確稱取15 mg凍干的菌體放入反應(yīng)瓶中，向其中加入1 mL氯仿、850 μL甲醇和150 μL濃硫酸，密封后沸水浴1 h后，向反應(yīng)瓶中加入1 mL蒸餾水，劇烈混勻后，靜置分層。抽取有機(jī)層過(guò)濾后用氣相色譜儀分析。氣相色譜分析方法參見(jiàn)文獻(xiàn)[14]。

1.6.2糖濃度檢測(cè)

菌液室溫下12 000 r/min離心2 min，取上清，然后用孔徑為0.22 μm的無(wú)菌濾膜過(guò)濾，用高效液相色譜檢測(cè)發(fā)酵產(chǎn)物。檢測(cè)器為視差折光檢測(cè)器RID-10A，色譜柱為HPX-87H (300 mm×7.8 mm)，流動(dòng)相為5 mmol/L的硫酸溶液，流速為0.6 mL/min。

2 結(jié)果與分析

2.1 大腸桿菌生產(chǎn)菌株的選擇

各種大腸桿菌的代謝能力和代謝水平不同。例如E. coliW3110適宜于發(fā)酵，而E. coliMG1655適宜于好氧生長(zhǎng)。為了考察常用的大腸桿菌工程菌適宜于PHB合成的情況，分別對(duì)E. coliDH5α/pBHR68、E. coliMG1655/pBHR68和E. coliW3110/pBHR68進(jìn)行了初步發(fā)酵試驗(yàn) (圖1)。E. coliDH5α/pBHR68無(wú)論從最終菌體濃度還是胞內(nèi)PHB含量上，都要優(yōu)于其他兩種菌。因此，本實(shí)驗(yàn)選用 DH5α/pBHR68作為PHB生產(chǎn)的出發(fā)菌株。

圖1 不同大腸桿菌菌株生產(chǎn)PHB的情況比較Fig.1 Production of PHB with differentE. colistrains.

2.2 大腸桿菌利用各種碳源合成PHB的比較

PHB作為生物基產(chǎn)品，其生產(chǎn)原料的價(jià)格對(duì)其生產(chǎn)成本影響很大。因此，選擇了幾種常用廉價(jià)碳源的單糖，分析大腸桿菌工程菌利用這幾種糖生產(chǎn)PHB的能力 (表 3)。從表中可以看出重組大腸桿菌以葡萄糖為碳源時(shí)，菌體終濃度最高，可達(dá)到4.31 g/L，胞內(nèi)PHB含量也可達(dá)到46%左右；以木糖為碳源時(shí)，其菌體終濃度略低于葡萄糖，但其胞內(nèi) PHB含量卻是最高的，可達(dá)到 49%；以乳糖和L-阿拉伯糖為碳源時(shí)，菌體濃度和PHB含量相對(duì)要低一些。這說(shuō)明大腸桿菌工程菌可以利用各種碳源合成PHB，特別是木糖在生產(chǎn)PHB方面并不遜于葡萄糖，并且其轉(zhuǎn)化為PHB的轉(zhuǎn)化率為0.19，比葡萄糖要高。因此，木糖是生產(chǎn) PHB的一種良好碳源。

表3 不同碳源合成PHB結(jié)果比較Table 3 Comparison of PHB accumulation inE. colifrom different carbon sources

2.3 多種碳源同時(shí)利用的工程化大腸桿菌的構(gòu)建

從上面的研究結(jié)果中可以看出，多種碳源都可以用于PHB的生產(chǎn)，而且許多廉價(jià)碳源都是多種糖的混合物，例如半纖維素的水解物就是葡萄糖、木糖等的混合物。因此，研究了重組E. coliDH5α利用糖混合物生產(chǎn)PHB的情況 (圖2A)。由圖可以看出，E. coliDH5α/pBHR68可以利用多種碳源，但是CCR的存在，導(dǎo)致大腸桿菌在利用混合碳源生長(zhǎng)時(shí)，會(huì)優(yōu)先利用葡萄糖，等葡萄糖耗盡之后才會(huì)利用木糖。這將導(dǎo)致大腸桿菌生長(zhǎng)過(guò)程出現(xiàn)停滯期，降低糖利用效率，延長(zhǎng)發(fā)酵周期。為了消除大腸桿菌CCR的影響，利用本實(shí)驗(yàn)室建立的方法在E. coliDH5α中敲除了ptsG基因[8]。通過(guò)發(fā)酵試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)E. coliDH5α ΔptsG/pBHR68菌株能夠同時(shí)利用葡萄糖、木糖，而且生長(zhǎng)速度明顯變快，PHB也能夠快速積累，只需 30 h左右菌體和 PHB的濃度均達(dá)到最高 (圖2B)。并且，E. coliDH5α ΔptsG/pBHR68 菌株產(chǎn)生的PHB占細(xì)胞干重的含量較初始菌株DH5α有較大提高，可以達(dá)到60%以上。

圖2 大腸桿菌在混合碳源中的生長(zhǎng)和PHB的積累Fig.2 Growth and PHB accumulation ofE. coliin sugar mixture. (A)E. coliDH5α/pBHR68. (B)E. coliDH5α ΔptsG/pBHR68.

2.4 工程化大腸桿菌在發(fā)酵過(guò)程中誘導(dǎo)和培養(yǎng)的優(yōu)化

利用大腸桿菌工程菌生產(chǎn)PHB存在一定的局限性。為此，本實(shí)驗(yàn)室在前期的研究中構(gòu)建了一種能夠通過(guò)環(huán)境壓力變化誘導(dǎo)PHB合成的系統(tǒng)[11]。本實(shí)驗(yàn)將該系統(tǒng)用在E. coliDH5α ΔptsG中，并和IPTG誘導(dǎo)系統(tǒng)中PHB積累的能力作了比較 (表4)。在環(huán)境誘導(dǎo)系統(tǒng)中PHB產(chǎn)量和菌體生長(zhǎng)都得到了大幅的提高，菌體終濃度可達(dá)到 6.24 g/L，比含 pBHR68質(zhì)粒的菌株提高了近20%。推測(cè)環(huán)境誘導(dǎo)系統(tǒng)導(dǎo)致菌體和PHB產(chǎn)量提高的原因在于該調(diào)控系統(tǒng)的啟動(dòng)強(qiáng)度。GFP表達(dá)檢測(cè)結(jié)果表明，該系統(tǒng)的啟動(dòng)迅速并且強(qiáng)度大于Lac啟動(dòng)子[11]。同時(shí)，該系統(tǒng)的應(yīng)用可以消除IPTG對(duì)菌體生長(zhǎng)的抑制作用，也能從一定程度上提高菌體和PHB的產(chǎn)量。

表4 比較重組大腸桿菌在IPTG和環(huán)境誘導(dǎo)系統(tǒng)中PHB的積累Table 4 Comparison of PHB production in IPTG induced system with that in stress-induced system

除了誘導(dǎo)，通氧也是影響發(fā)酵生產(chǎn)中成本的關(guān)鍵因素。文獻(xiàn)報(bào)道，限氧有利于大腸桿菌中PHB的合成[15]。因此，在搖瓶柜上初步優(yōu)化了氧氣的條件，為發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)提供了基礎(chǔ)。在 4個(gè)平行培養(yǎng)的搖瓶中，分別按4種不同的培養(yǎng)方式供氧：全程供氧、全程限氧、0～24 h限氧和24～48 h限氧。如圖3所示，在菌體生長(zhǎng)階段的24～48 h限氧既能保證菌體生長(zhǎng)速度，又能提高胞內(nèi)PHB的含量。這一培養(yǎng)模式符合Wang等的PHB二階段生產(chǎn)模型[15]。因此，選擇該培養(yǎng)方式作為發(fā)酵培養(yǎng)控制溶氧的依據(jù)。

圖3 通氧對(duì)重組大腸桿菌PHB合成的影響Fig.3 Effect of oxygen limitation on PHB synthesis in recombinantE. coli.

2.5 實(shí)驗(yàn)室中利用廉價(jià)底物分批發(fā)酵試驗(yàn)

以E. coliDH5α ΔptsG/pQKZ103 作為發(fā)酵菌株，以“糖蜜”為原料，在5 L發(fā)酵罐中進(jìn)行了PHB發(fā)酵試驗(yàn)。初始總糖濃度約為 30 g/L，發(fā)酵過(guò)程中通過(guò)5 mol/L的NaOH控制pH在6.8左右；從第12 h開(kāi)始到發(fā)酵結(jié)束控制溶氧在30%以下。在發(fā)酵32 h后，糖基本耗盡，大腸桿菌 DH5α ΔptsG/pQKZ103的菌體終濃度達(dá)到 8.24 g/L，PHB占細(xì)胞干重的84.6% (圖4)。從圖上可以看出，發(fā)酵的前16 h菌體快速生長(zhǎng)，16 h之后PHB得到大量積累，這與第12 h開(kāi)始限氧基本相符；本批發(fā)酵糖代謝較為徹底，糖轉(zhuǎn)化為PHB的轉(zhuǎn)化率約為0.243。圖5為培養(yǎng)48 h時(shí)的菌體在透射電鏡下的照片。從照片上可以看出，大腸桿菌胞內(nèi)已經(jīng)被 PHB顆粒充滿，并且產(chǎn)生的PHB顆粒較大，有利于PHB的提取。

圖 4 重組大腸桿菌分批培養(yǎng)菌體生長(zhǎng)、糖消耗及 PHB含量曲線Fig.4 Time profiles of cell concentration, sugars concentration and PHB content of recombinantE. coliin batch culture.

圖5 重組大腸桿菌DH5αΔptsG/pQKZ103透射電鏡照片F(xiàn)ig.5 Transmission electron microscopy photo of recombinantE. coliDH5α ΔptsG/pQKZ103.

3 結(jié)論

由于大腸桿菌擁有許多優(yōu)勢(shì)，利用工程化大腸桿菌生產(chǎn)生物可降解塑料一直是人們追求的一個(gè)方向。但是，大腸桿菌作為細(xì)胞工廠也有一定的缺點(diǎn)，本研究通過(guò)對(duì)大腸桿菌E. coliDH5α的初步改造使之適宜于多種碳源的利用，并通過(guò)非IPTG環(huán)境誘導(dǎo)系統(tǒng)的應(yīng)用，初步解決了大腸桿菌應(yīng)用于PHB生產(chǎn)過(guò)程中的一些問(wèn)題。實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵結(jié)果證明該菌利用玉米芯水解濃縮液作原料能夠很好地實(shí)現(xiàn)大腸桿菌的快速生長(zhǎng)和PHB的高效積累，具有良好的前景。

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Efficient polyhydroxybutyrate production from cheap resources by recombinantEscherichia coli

Guoqing Wei1,2, Quan Chen1, Zhen Kang1, and Qingsheng Qi1

1State Key Laboratory of Microbial Technology,Shandong University,Jinan250100,China
2College ofScience,Jiangxi Agricultural University,Nanchang330045,China

Received:November 17, 2009;Accepted:February 25, 2010

Supported by:National Natural Science Foundation of China (No. 30870022), National Basic Research and Development Program of China (973 Program) (No. 2007CB707803).

Corresponding author:Qingsheng Qi. Tel: +86-531-88365628; Fax: +86-531-88565610; E-mail: qiqingsheng@sdu.edu.cn

國(guó)家自然科學(xué)基金 (No. 30870022)，國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃 (973計(jì)劃) (No. 2007CB707803) 資助。