聚球藻7942混養(yǎng)培養(yǎng)中碳代謝與能量利用

顏日明，張志斌，曾慶桂，朱篤,3，儲(chǔ)炬

1 華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院 生物反應(yīng)器工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237

2 江西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 江西省亞熱帶植物保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南昌 330022

3 宜春學(xué)院，宜春 336000

代謝工程

聚球藻7942混養(yǎng)培養(yǎng)中碳代謝與能量利用

顏日明1,2，張志斌2，曾慶桂2，朱篤2,3，儲(chǔ)炬1

1 華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院 生物反應(yīng)器工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237

2 江西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 江西省亞熱帶植物保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南昌 330022

3 宜春學(xué)院，宜春 336000

為了考察聚球藻 7942在混養(yǎng)條件下的能量利用效率，分別以葡萄糖和乙酸為碳源開展了聚球藻7942的混養(yǎng)培養(yǎng)研究，并在此基礎(chǔ)上利用代謝通量分析方法對(duì)聚球藻7942混養(yǎng)條件下的碳代謝和能量利用進(jìn)行了探討。結(jié)果表明：葡萄糖和乙酸均能促進(jìn)藻細(xì)胞生長，且乙酸促進(jìn)藻細(xì)胞生長的作用更為明顯；葡萄糖利用可明顯增加藻細(xì)胞糖酵解途徑中碳代謝流量，而乙酸利用則導(dǎo)致糖酵解途徑中碳代謝流量減小，兩種有機(jī)碳源均增加了檸檬酸循環(huán)中碳代謝流量；有機(jī)碳源導(dǎo)致藻細(xì)胞光化學(xué)效率下降，而葡萄糖較之乙酸降低藻細(xì)胞光化學(xué)效率更為明顯。雖然混養(yǎng)條件下光能的貢獻(xiàn)率要小于光自養(yǎng)，但基于能量的細(xì)胞得率和能量轉(zhuǎn)換率均高于光自養(yǎng)，光自養(yǎng)和以葡萄糖、乙酸為碳源的混養(yǎng)中基于ATP生成的能量轉(zhuǎn)換效率分別為6.81%、7.43%和8.77%。

聚球藻7942，混養(yǎng)培養(yǎng)，代謝通量分析，碳代謝，能量利用

Abstract:To investigate the energy utilization efficiency ofSynechococcussp. PCC7942 under mixotrophic conditions, we studied its growth characteristics in mixotrophic cultures with glucose and acetic acid respectively and discussed the carbon metabolism and energy utilization based on metabolic flux analysis. Results showed that both glucose and acetate could better enhance the growth ofSynechococcussp. PCC7942, and the latter was more effective. The metabolic flux through glycolytic pathway in mixotrophic cultures was stimulated by glucose whereas depressed by acetate, while the flux through the tricarboxylic acid cycle increased in both cases. Under mixotrophic conditions, glucose makes more significant impact on the diminishment of photochemical efficiency ofSynechococcussp. PCC7942. Although the contribution of light energy was smaller, the cell yields based on total energy in mixotrophic cultures were higher comparing with photoautotrophic culture. The energy conversion efficiencies based on ATP synthesis in photoautotrophic culture, mixotrophic cultures with glucose and with acetate wereevaluated to be 6.81%, 7.43% and 8.77%, respectively.

Keywords:Synechococcussp. PCC7942, mixotrophic cultivation, metabolic flux analysis, carbon metabolism, energetic utilization

聚球藻 (Synechococcus，過去亦稱為Anacystis nidulans) 是分布最廣的單細(xì)胞原核藍(lán)藻類群之一，它們能利用光、CO2及其他無機(jī)物來生長，是全球碳循環(huán)的主要參與者和初級(jí)生產(chǎn)力的主要貢獻(xiàn)者之一[1]。聚球藻在眾多理論研究領(lǐng)域，如無機(jī)碳源吸收[2]、氮源調(diào)節(jié)[3]、鐵缺乏應(yīng)激響應(yīng)[4]，環(huán)境適應(yīng)機(jī)制[5]和生物鐘研究[6]等方面是一個(gè)很好的研究材料，同時(shí)也是一個(gè)良好的外源基因載體，迄今多種具有較高應(yīng)用價(jià)值的藥用蛋白基因被導(dǎo)入藍(lán)藻，并獲得了表達(dá)[7]。聚球藻曾經(jīng)被認(rèn)為是營專性光自養(yǎng)的單細(xì)胞藍(lán)藻[8]，因此絕大多數(shù)文獻(xiàn)都集中在光自養(yǎng)培養(yǎng)研究，但也有一些研究表明很多營專性光自養(yǎng)藍(lán)藻能同化有機(jī)碳源[9-12]。Takahashi等發(fā)現(xiàn)在光自養(yǎng)與氮饑餓的條件下，往培養(yǎng)基中添加前體物質(zhì)乙酸鈉能有效地提高聚球藻 7942 (Synechococcussp.PCC 7942) 藻細(xì)胞中PHB的含量[13]。汪晶[14]和康瑞娟[15]等對(duì)聚球藻7002 (Synechococcussp. PCC 7002)進(jìn)行了混養(yǎng)培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)混養(yǎng)條件下菌體的生長和光合速率與光自養(yǎng)相比均有所提高。這些研究均表明聚球藻具備混養(yǎng)生長的能力。迄今，雖然已有關(guān)于聚球藻7942同化有機(jī)碳源的研究，但有關(guān)其混養(yǎng)培養(yǎng)的研究尚未見報(bào)道。同時(shí)，有關(guān)聚球藻研究都是建立在宏觀分析的基礎(chǔ)上，而對(duì)于聚球藻在混養(yǎng)條件下有機(jī)碳源促進(jìn)細(xì)胞生長和產(chǎn)物合成的機(jī)理沒有涉及，特別是對(duì)于其基于代謝流尺度的微觀代謝特征還沒有進(jìn)行過相關(guān)研究。近年來，代謝通量分析作為一個(gè)用來研究微藻的碳代謝和能量利用特征的重要方法而得到廣泛應(yīng)用，我們?cè)鴳?yīng)用該方法對(duì)聚球藻 7942的光自養(yǎng)培養(yǎng)不同光強(qiáng)條件下的碳代謝和能量代謝進(jìn)行過探討[16]，但迄今有關(guān)其在混養(yǎng)條件下的代謝特征以及能量利用效率方面的研究未見報(bào)道。本文以聚球藻7942為研究對(duì)象，研究了葡萄糖和乙酸對(duì)聚球藻7942生長的影響，在此基礎(chǔ)上應(yīng)用代謝通量分析方法，以光自養(yǎng)為參照，著重研究其在混養(yǎng)條件下的碳代謝和能量代謝特征，并對(duì)其在不同培養(yǎng)條件下的能量利用情況進(jìn)行了分析。

1 材料與方法

1.1 藻種與培養(yǎng)基

聚球藻7942 (Synechococcussp. PCC7942) 由中國科學(xué)院水生所藻種庫提供。實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基采用BG-11培養(yǎng)基[17]?；祓B(yǎng)培養(yǎng)時(shí)在此基礎(chǔ)上分別加入濃度為4.0 g/L葡萄糖或2.0 g/L的乙酸，滅菌后用NaOH調(diào)節(jié)至8.0備用。

1.2 培養(yǎng)方法

藻細(xì)胞在植物細(xì)胞反應(yīng)器 (ALG-XL型，上海國強(qiáng)生化工程裝備有限公司) 中進(jìn)行，工作體積3 L，入射光強(qiáng)為 51.2 μmol/(m2?s)，培養(yǎng)溫度為 28℃，空氣流量為0.5 vvm，pH控制在10.0以下。

1.3 培養(yǎng)方法

藻細(xì)胞測定：藻液用0.45 μm的醋酸纖維濾膜過濾，將過濾后的藻體在 105℃的烘箱恒溫烘干至恒重，稱重3次，取平均值。

光強(qiáng)采用光合有效輻射計(jì) (北京師范大學(xué)光電儀器廠) 測定。

光合作用效率 (ΦPSII) 采用水體葉綠素?zé)晒鈨x(AP100，捷克) 測定。

乙酸濃度采用氣相色譜法測定[18]。

葡萄糖濃度采用葡萄糖測定試劑盒 (上海達(dá)豪生物科技有限公司) 測定。

葉綠素和胡蘿卜素含量采用比色法測定[19]。

碳水化合物含量采用硫酸-蒽酮法[20]。

總脂含量采用氯仿/甲醇抽提法[21]。

蛋白質(zhì)含量測定采用考馬斯亮藍(lán)法[22]。

藻液中碳酸鹽測定采用鹽酸滴定法[23]。

藻細(xì)胞碳 (C)、氧 (O)、氮 (N) 和氫 (H) 元素含量用Elementar Vario EL III型元素分析儀 (德國)進(jìn)行測定。

尾氣CO2和O2濃度分別采用PA200-GXH型紅外線氣體分析器 PA200-CJ型磁機(jī)械式氧分析器(重慶川儀分析儀器有限公司) 在線測定。

2 代謝網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及計(jì)算方法

2.1 代謝網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

聚球藻 7942光自養(yǎng)初級(jí)碳代謝網(wǎng)絡(luò)在我們前期的工作中已經(jīng)建立[16]，主要包括卡爾文 (Calvin)循環(huán)、糖酵解 (EMP) 途徑、磷酸己糖 (HMP) 途徑和三羧酸 (TCA) 循環(huán)。在以葡萄糖為碳源時(shí)，葡萄糖直接通過糖酵解途徑生成 6-磷酸葡萄糖進(jìn)入代謝途徑。而在以乙酸為有機(jī)碳源的混養(yǎng)條件下，乙酸進(jìn)入藻細(xì)胞后首先在 ATP的參與下由乙酸激酶(Acetate kinase，AK) 催化生成乙酰磷酸，然后乙酰磷酸再在磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶 (Phosphotransacetylase，PTA) 的催化下生成乙酰輔酶A，進(jìn)入三羧酸循環(huán)進(jìn)行代謝[11]。為了降低代謝網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性和減少代謝流量平衡方程，本研究假定聚球藻7942沒有胞外產(chǎn)物合成。圖1為聚球藻7942混養(yǎng)條件下的主要碳代謝途徑簡圖，相應(yīng)反應(yīng)方程式見文后附錄II。

2.2 碳代謝流計(jì)算

代謝流分析的理論基礎(chǔ)是物料平衡，代謝物之間的轉(zhuǎn)變遵循化學(xué)反應(yīng)計(jì)量關(guān)系。

以ri表示代謝反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)中第i種代謝物的積累速率，則有

式 (1) 中aij和vj分別表示第i種代謝物在第j個(gè)反應(yīng)中的化學(xué)計(jì)量系數(shù)和反應(yīng)流量。整個(gè)代謝網(wǎng)絡(luò)中的所有代謝物可以組成如下線性方程組

式 (2) 中A為m×n的化學(xué)計(jì)量系數(shù)矩陣，r和v分別為m維代謝物累積速率向量和n維流量向量。上述反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)中包含19個(gè)方程和33個(gè)代謝流量，其中包括14個(gè)已知流量和19個(gè)未知流量。根據(jù)已知流量系數(shù)矩陣，利用Matlab軟件可以計(jì)算出所有未知流量。

2.3 能量代謝計(jì)算

藻細(xì)胞能吸收光能用于細(xì)胞生長和產(chǎn)物合成，其比光能吸收速率Eab可用下式表示[24-25]：

圖1 聚球藻7942混養(yǎng)代謝網(wǎng)絡(luò)簡圖Fig.1 A schematic view of key pathways of central metabolism ofSynechococcussp. PCC7942 under photoautotrophic and mixotrophic conditions.

式 (3) 中Eab為比光能吸收速率，I0為入射光強(qiáng)，R為反應(yīng)器半徑，X為細(xì)胞濃度，Ka為吸光系數(shù)。

藻細(xì)胞吸收的光能除了一部分進(jìn)行光化學(xué)反應(yīng)外，還有相當(dāng)多的能量是以產(chǎn)生熒光或者熱耗散的形式消耗掉[26]。因此，在計(jì)算光能的利用和實(shí)際轉(zhuǎn)換效率時(shí)應(yīng)該以用于光化學(xué)的光能為基礎(chǔ)。光合系統(tǒng)II的光化學(xué)效率ΦPSII正好表示為用于光化學(xué)的光能占總吸收的光能比例[27]，因此實(shí)際用于光合作用的光能EP由式 (4) 計(jì)算

在混養(yǎng)條件下，藻細(xì)胞還可以利用有機(jī)碳源的化學(xué)能，總的能量供給ET可由下式表示：

藻細(xì)胞吸收光能和化學(xué)能后用于細(xì)胞的合成，因此基于總能量的細(xì)胞得率YX/E和基于ATP生成的細(xì)胞得率YATP分別由式 (6) 和式 (7) 獲得。

上式中μ為藻細(xì)胞比生長速率，rATP為ATP的比生成速率。

基于ATP生成的能量轉(zhuǎn)換效率為

3 結(jié)果與分析

3.1 聚球藻7942的混養(yǎng)培養(yǎng)

聚球藻7942除了光自養(yǎng)外，還能利用有機(jī)碳源進(jìn)行混養(yǎng)培養(yǎng)。為了考察葡萄糖和乙酸濃度對(duì)藻細(xì)胞生長的影響，分別在 BG11培養(yǎng)基中加入了不同濃度的葡萄糖和乙酸進(jìn)行混養(yǎng)培養(yǎng)，10 d后對(duì)菌體濃度進(jìn)行測量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)添加葡萄糖和乙酸的濃度分別為4.0 g/L和2.0 g/L時(shí)的藻細(xì)胞濃度最大，分別達(dá)到了0.79 g/L和0.90 g/L，比光自養(yǎng)條件下分別提高了 26%和 40% (圖 2)。這表明，聚球藻 7942能在低濃度的有機(jī)碳源存在下進(jìn)行混養(yǎng)培養(yǎng)，并且混養(yǎng)培養(yǎng)更有利于藻細(xì)胞的生長。

為了進(jìn)一步比較不同營養(yǎng)類型對(duì)聚球藻生長的影響，本文比較了光自養(yǎng)、葡萄糖混養(yǎng) (添加4.0 g/L的葡萄糖)、乙酸混養(yǎng) (添加2.0 g/L的乙酸) 和異養(yǎng)(添加4.0 g/L的葡萄糖或2.0 g/L的乙酸) 條件下聚球藻7942的生長情況。從圖3可以看到，在混養(yǎng)條件下，藻細(xì)胞的生長速率明顯要高于光自養(yǎng)，在培養(yǎng)到第11天，葡萄糖混養(yǎng)和乙酸混養(yǎng)條件下的藻細(xì)胞濃度分別達(dá)到0.83 g/L和0.96 g/L，比光自養(yǎng)的0.65 g/L分別增加了 28%和 48%，這進(jìn)一步說明了聚球藻7942在混養(yǎng)條件下細(xì)胞生長要優(yōu)于光自養(yǎng)。同時(shí)，從圖3也可以看出，聚球藻7942在異養(yǎng)條件下沒有生長，并且在第 6天后幾乎全部死亡，說明其不能進(jìn)行異養(yǎng)培養(yǎng)。

圖2 葡萄糖和乙酸濃度對(duì)聚球藻 7942混養(yǎng)培養(yǎng)生長的影響Fig.2 Effect of glucose and acetate concentration on the growth ofSynechococcussp. PCC 7942 in mixotrophic culture.

圖3 聚球藻7942在不同營養(yǎng)方式下的生長比較Fig.3 Comparison ofSynechococcussp. PCC 7942 growth under photoautotrophic (◇), mixotrophic (Glucose □; Acetate ○)and heterotrophic (Glucose ■; Acetate ●) conditions respectively.

為了更好地研究混養(yǎng)條件下的碳代謝，本文考察了有機(jī)碳源對(duì)藻細(xì)胞組成成分的影響。從圖4A可以看到，與光自養(yǎng)相比，在葡萄糖混養(yǎng)中藻細(xì)胞的碳水化合物的含量顯著提高 (P＜0.05)，由光自養(yǎng)的20.6%提高到 22.5%。而在乙酸混養(yǎng)中，藻細(xì)胞的脂類含量也有一定的提高，由光自養(yǎng)的 12.9%提高到 13.8%。這說明葡萄糖和乙酸在藻細(xì)胞的碳水化合物和脂類合成中起重要作用，也表明葡萄糖和乙酸可以作為前體物質(zhì)直接參與細(xì)胞物質(zhì)的合成。同時(shí)，對(duì)細(xì)胞的主要色素葉綠素和類胡蘿卜素含量的研究也發(fā)現(xiàn)，異養(yǎng)條件下，葉綠素的含量顯著降低，而類胡蘿卜素的含量則變化不大 (圖4B)。作為光合作用最重要的色素，葉綠素含量的下降一方面可能是由于有機(jī)碳源的抑制作用[29]；另一方面，在混養(yǎng)條件下，藻細(xì)胞生長的能量除了來自光源外，還能同化有機(jī)碳源所產(chǎn)生的能量，因此藻細(xì)胞可能通過降低細(xì)胞光合色素的含量來降低對(duì)光的依賴，同時(shí)還在一定程度上減少了光抑制[30]。

圖 4 自養(yǎng)和混養(yǎng)條件下聚球藻 7942菌體主要成分 (A)及色素 (B) 比較Fig.4 Main compositions ofSynechococcussp. PCC 7942 cells under photoautotrophic and mixotrophic conditions (A)and changes of pigments contents inSynechococcussp. PCC 7942 cells under photoautotrophic (△) and mixotrophic(Glucose ○; Acetate □) conditions respectively (B).

3.2 聚球藻 7942光自養(yǎng)和混養(yǎng)條件下碳代謝流分布

圖5 聚球藻7942在光自養(yǎng)和混養(yǎng)條件下的代謝流分布(120 h)Fig.5 Metabolic flux distribution ofSynechococcussp.PCC7942 under photoautotrophic and mixotrophic conditions at culture time of 120 h. The flux values are normalized by the flux for CO2uptake, and the upside, middle and undersides numerals are the flux values calculated from photoautotrophic culture, mixotrophic culture with glucose and mixotrophic culture with acetate respectively.

以 CO2的比消耗速率為 100，圖 5給出了聚球藻7942分別在光自養(yǎng)和混養(yǎng)條件下120 h時(shí)的碳代謝流量分布。聚球藻7942光自養(yǎng)條件下的代謝特征已有探討[16]，這里著重討論與光自養(yǎng)相比的混養(yǎng)條件下的碳代謝特點(diǎn)。從圖 5可以看到，在以葡萄糖為碳源的混養(yǎng)中，在糖酵解途徑和Calvin循環(huán)的分支點(diǎn)3-磷酸甘油醛 (G3P) 處，通向糖酵解的碳代謝流量明顯高于光自養(yǎng)和乙酸混養(yǎng)。這是由于葡萄糖的加入，能直接促進(jìn)糖酵解途徑的進(jìn)行，并進(jìn)一步使得檸檬酸循環(huán)也得到進(jìn)一步加強(qiáng)。由于葡萄糖(GLC) 直接降解為6-磷酸葡萄糖，因此使得充足的6-磷酸葡萄糖供給能對(duì)于細(xì)胞內(nèi)碳代謝產(chǎn)生重要影響：1) 能使得在光自養(yǎng)條件下由6-磷酸果糖 (F6P)生成6-磷酸葡萄糖 (G6P) 的途徑發(fā)生流量逆轉(zhuǎn)；2)由 6-磷酸葡萄糖 (G6P) 再生 5-磷酸核酮糖 (Ru5P)的途徑流量有一定的加強(qiáng)；3) 直接作為菌體成分中糖類物質(zhì)合成的前體來源；4) 直接產(chǎn)生更多的ATP用于細(xì)胞合成。而在以乙酸為碳源的混養(yǎng)中，乙酸首先被代謝生成乙酰輔酶 A (AcCoA)。由于不存在乙醛酸循環(huán)，因此乙酸的代謝對(duì)于細(xì)胞物質(zhì)的合成起重要作用。一方面，由于乙酰輔酶A的大量存在，使得檸檬酸循環(huán)得到加強(qiáng)，生成大量的 α-酮戊二酸(α-KG) 用于細(xì)胞物質(zhì)的合成；另一方面，通過反饋調(diào)節(jié)降低糖酵解途徑中由磷酸烯醇式丙酮酸 (PEP)經(jīng)丙酮酸 (PYR) 生成乙酰輔酶 A的代謝流量，使得累積更多的磷酸烯醇式丙酮酸和丙酮酸用于各種細(xì)胞組成物質(zhì)的合成。更重要的是，乙酰輔酶A是合成脂肪酸的前體物質(zhì)，因此它的積累可以大大促進(jìn)細(xì)胞脂類物質(zhì)的合成，這與前述在乙酸混養(yǎng)條件下細(xì)胞脂類物質(zhì)含量增加一致。另外，我們也注意到，由于代謝流量是以 CO2固定流量為基礎(chǔ)，因此不管是在光自養(yǎng)還是混養(yǎng)條件下，Calvin循環(huán)的相對(duì)流量保持不變，這進(jìn)一步說明了 CO2的固定和Calvin循環(huán)是緊密關(guān)聯(lián)的。

3.3 能量代謝分析

基于上述代謝流分布結(jié)果，我們可以獲得以ATP為代表的3種培養(yǎng)條件下的能量產(chǎn)生和消耗速率 (表1)。從表1可以看到，在混養(yǎng)的條件下，雖然ATP仍主要來自光合磷酸化，約占總產(chǎn)生量的60%，但遠(yuǎn)低于在光自養(yǎng)條件下87%的水平。這表明有機(jī)碳源在混養(yǎng)過程中確實(shí)提供了一部分能量。此外，由于乙酸在代謝網(wǎng)絡(luò)中的作用主要是提供細(xì)胞合成前體，很少提供能量，因此依賴光合磷酸化的比例要比葡萄糖的高。同時(shí)還可以看到，在混養(yǎng)條件下，糖酵解途徑或檸檬酸循環(huán)的代謝流量比光自養(yǎng)明顯增加，導(dǎo)致氧化磷酸化途徑得到加強(qiáng)，從而使得在混養(yǎng)條件下氧化磷酸化所產(chǎn)生的ATP量要比光自養(yǎng)的高。在能量消耗方面，Calvin循環(huán)依然是主要的ATP消耗陷阱。在3種培養(yǎng)條件下，Calvin循環(huán)消耗的ATP占總消耗的ATP比例分別為81.5%、78.7%和79.5%。與光自養(yǎng)不同，在混養(yǎng)條件下的ATP的消耗除了Calvin循環(huán)、細(xì)胞合成和細(xì)胞維持等方面的ATP消耗外，還包括有機(jī)碳源基質(zhì)吸收進(jìn)入碳循環(huán)所需的ATP消耗。從表1的數(shù)據(jù)來看，有機(jī)碳源的吸收所需的 ATP約占總消耗的 4.2%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于Calvin循環(huán)固定CO2所消耗的ATP量。因此從能量學(xué)角度來說，有機(jī)碳源可能比無機(jī)碳源更有利于細(xì)胞同化。

表1 聚球藻7942光自養(yǎng)和混養(yǎng)中ATP與NAD(P)H的產(chǎn)生與利用 (mmol/(g?h))Table 1 The generation and utilization of ATP and NAD(P)H in the photoautotrophic and mixotrophic cultures ofSynechococcussp. PCC7942 (mmol ATP/ (g?h))

3.4 能量利用與轉(zhuǎn)換效率

在光自養(yǎng)條件下，藻細(xì)胞合成和產(chǎn)物生成所需的能量全部來自光能。而在混養(yǎng)條件下，除了光供給能量外，細(xì)胞還可以利用有機(jī)碳源代謝提供的能量用于細(xì)胞合成和產(chǎn)物生成。研究基于能量生成或消耗的細(xì)胞得率對(duì)于了解聚球藻 7942在混養(yǎng)條件下的能量利用和轉(zhuǎn)換效率具有重要意義。

在聚球藻7942光自養(yǎng)和混養(yǎng)過程中，吸收的光能只有一部分用于光合作用。從圖 6可以看到，聚球藻 7942在混養(yǎng)條件下的光化學(xué)效率明顯要比光自養(yǎng)條件下的低，特別是在葡萄糖混養(yǎng)中，光化學(xué)效率僅為37%。這是因?yàn)橛袡C(jī)碳源的存在能抑制低CO2濃度下光自養(yǎng)生長的藻細(xì)胞碳酸酐酶的活性，并在一定程度上降低了光合作用速率[31]，從而進(jìn)一步導(dǎo)致用于光合作用的光能利用率下降。盡管如此，藻細(xì)胞在混養(yǎng)條件下，光仍然是能量的主要提供者。在葡萄糖混養(yǎng)和乙酸混養(yǎng)條件下，光所提供的能量占細(xì)胞總吸收能量的比例分別達(dá)到69.9%和89.0%。

圖6 聚球藻7942在不同培養(yǎng)條件下的能量吸收Fig.6 Energy absorption ofSynechococcussp. PCC7942 in different cultures. The photochemical efficiency of photosystem II(■) and the percentages of energy contribution were also showed in the figure.

為了進(jìn)一步研究藻細(xì)胞在混養(yǎng)條件下的能量利用情況，根據(jù)上述聚球藻7942的代謝流數(shù)據(jù)，可以獲得其分別在不同培養(yǎng)條件下的能量利用和轉(zhuǎn)換效率相關(guān)參數(shù) (表2)。聚球藻7942在葡萄糖混養(yǎng)和乙酸混養(yǎng)條件下基于總能量的得率YX/E分別為10.93×10?3g/kJ和 13.22×10?3g/kJ，遠(yuǎn)高于光自養(yǎng)條件的 6.85×10?3g/kJ水平。同樣，混養(yǎng)條件下基于ATP生成的藻細(xì)胞得率YATP比光自養(yǎng)分別增加46%和50%。與此相對(duì)應(yīng)，基于ATP生成的能量轉(zhuǎn)換效率，分別為 7.43%和 8.77%，分別為光自養(yǎng)的 1.1和 1.3倍，這進(jìn)一步表明混養(yǎng)的能量轉(zhuǎn)換率要高于光自養(yǎng)。這是因?yàn)樵诠夂衔⒃迮囵B(yǎng)過程中，以 ATP為代表的生物能量的產(chǎn)生主要來自 2條途徑：光合磷酸化和氧化磷酸化，并且氧化磷酸化途徑的能量生產(chǎn)效率要遠(yuǎn)高于光合磷酸化[25]。在混養(yǎng)培養(yǎng)中，微藻細(xì)胞內(nèi)的氧化磷酸化程度比光自養(yǎng)條件下的要高，從表 1也可以看出，混養(yǎng)條件下通過氧化磷酸化產(chǎn)生的ATP量是光自養(yǎng)水平下的4倍。因此，混養(yǎng)的能量利用和轉(zhuǎn)換效率要高于光自養(yǎng)。另一方面，由于乙酸在代謝網(wǎng)絡(luò)中主要是以前體物質(zhì)提供者參與細(xì)胞合成，能量釋放較少，而葡萄糖除了提供前提外，更多地參與了氧化磷酸化過程，能提供較多能量 (圖 6)。所以乙酸混養(yǎng)的能量利用率略高于葡萄糖混養(yǎng)，相應(yīng)的細(xì)胞得率也略有提高，這與分批培養(yǎng)數(shù)據(jù)比較吻合 (圖3)。

表2 聚球藻7942光自養(yǎng)和混養(yǎng)中的能量利用Table 2 The energy utilization ofSynechococcussp.PCC7942 in the photoautotrophic and mixotrophic cultures

4 小結(jié)

聚球藻7942曾經(jīng)被認(rèn)為是專性光自養(yǎng)藍(lán)藻，然而本研究發(fā)現(xiàn)其能在低濃度有機(jī)碳源存在的情況下進(jìn)行混養(yǎng)生長。本文以聚球藻7942為對(duì)象，分別以葡萄糖和乙酸為有機(jī)碳源進(jìn)行混養(yǎng)培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在基本培養(yǎng)基中添加4.0 g/L的葡萄糖和2.0 g/L乙酸的藻細(xì)胞濃度分別達(dá)到了0.79 g/L和0.90 g/L，比光自養(yǎng)條件下有明顯提高。在此基礎(chǔ)上，本文運(yùn)用代謝通量分析方法著重對(duì)聚球藻 7942在異養(yǎng)條件下的碳代謝特征進(jìn)行了探討。研究結(jié)果表明，在葡萄糖混養(yǎng)中，糖酵解途徑的碳代謝流量要高于光自養(yǎng)和乙酸混養(yǎng)，并能直接產(chǎn)生更多的ATP用于細(xì)胞合成。而在乙酸混養(yǎng)中，乙酸主要作為合成細(xì)胞成分的前體物質(zhì)參與碳代謝。從能量代謝角度來說，混養(yǎng)過程中光合磷酸化產(chǎn)生的 ATP明顯低于光自養(yǎng)，但氧化磷酸化過程所產(chǎn)生的ATP要高于光自養(yǎng)。雖然聚球藻 7942在混養(yǎng)條件下的光化學(xué)效率低于光自養(yǎng)條件，但光仍然是能量的主要提供者。在能量利用方面，聚球藻7942在葡萄糖混養(yǎng)和乙酸混養(yǎng)條件下的基于總能量的得率和基于ATP生成的得率均高于光自養(yǎng)，能量轉(zhuǎn)換效率是光自養(yǎng)的 1.1倍以上。本研究不僅從宏觀的細(xì)胞生長的角度，而且還從碳代謝和能量利用的微觀角度上進(jìn)一步探討了混養(yǎng)培養(yǎng)碳源對(duì)聚球藻7942生長促進(jìn)的機(jī)制。這在一定程度上為其利用混養(yǎng)培養(yǎng)來提高藻細(xì)胞的培養(yǎng)密度，實(shí)現(xiàn)微藻的大規(guī)模培養(yǎng)奠定了理論基礎(chǔ)。

附錄 I Nomenclature

附錄 II Biochemical reactions for flux estimation

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Carbon metabolism and energetic utilization ofSynechococcussp. PCC7942 under mixotrophic condition

Riming Yan1,2, Zhibin Zhang2, Qinggui Zeng2, Du Zhu2,3, and Ju Chu1

1State Key Laboratory of Bioreactor Engineering,East China University of Science and Technology,Shanghai200237,China
2Key Laboratory of Protection and Utilization of Subtropical Plant Resources of Jiangxi Province,Jiangxi Normal University,Nanchang330022,China
3Yichun University,Yichun336000,China

Received:April 29, 2010;Accepted:July 12, 2010

Supported by:National Natural Science Foundation of China (No. 20506009), Natural Science Foundation of Jiangxi Province (No. 0530095),Education Department of Jiangxi Province (No. GJJ08147).

Corresponding author:Du Zhu. Tel: +86-795-3200616; E-mail: zhudu12@163.com

Ju Chu. Tel: +86-21-64253021; E-mail: juchu@ecust.edu.cn

國家自然科學(xué)基金 (No. 20506009)，江西省自然科學(xué)基金 (No. 0530095)，江西省教育廳 (No. GJJ08147) 資助。