高山被孢霉產(chǎn)花生四烯酸及其遺傳改造的研究進(jìn)展

叢蕾蕾，彭超，紀(jì)曉俊，黎志勇，尤江英，路金淼，黃和

南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院 材料化學(xué)工程國家重點實驗室，南京 210009

代謝工程

高山被孢霉產(chǎn)花生四烯酸及其遺傳改造的研究進(jìn)展

叢蕾蕾，彭超，紀(jì)曉俊，黎志勇，尤江英，路金淼，黃和

南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院 材料化學(xué)工程國家重點實驗室，南京 210009

花生四烯酸作為一種重要的多價不飽和脂肪酸，因其具有多種生理功能而被認(rèn)為是潛在的食品添加劑和藥物。近年來，利用高山被孢霉合成花生四烯酸已成為研究熱點。前期相關(guān)研究主要集中在菌種選育及發(fā)酵調(diào)控方面。隨著研究的不斷深入，關(guān)于高山被孢霉合成花生四烯酸的代謝途徑的研究取得了較大進(jìn)展。以下簡要概述前期工作進(jìn)展，著重論述花生四烯酸合成途徑的關(guān)鍵酶及其高山被孢霉的遺傳改造的研究情況，包括生物合成花生四烯酸代謝途徑、關(guān)鍵酶及其應(yīng)用、高山被孢霉的遺傳操作系統(tǒng)的構(gòu)建以及遺傳改造的應(yīng)用，并對其研究前景進(jìn)行了展望。

花生四烯酸，高山被孢霉，關(guān)鍵酶，遺傳操作系統(tǒng)，遺傳改造

Abstract:Arachidonic acid, as an important polyunsaturated fatty acid, is identified as potential food additives or pharmaceuticals for their biological activities. In recent years, arachidonic acid production byMortierella alpinais becoming a research highlight.The prophase relevant researches focused on the mutagenic breeding and fermentation optimization. With the depth of investigation,the advancement concerning pathway for the biosynthesis of arachidonic acid inMortierella alpinahas been made. In this review, we summarized the prophase work briefly. Mainly, we discussed the biosynthesis pathway of arachidonic acid, the key enzymes, the construction of transformation system and the genetic modification. In addition, the prospect of microorganism arachidonic acid production is put forward.

Keywords:arachidonic acid,Mortierella alpina, key enzymes, transformation system, genetic modification

多價不飽和脂肪酸 (Polyunsaturated fatty acids，PUFAs) 是指一系列含有2個或2個以上非共軛順式雙鍵的 C16-22的多不飽和脂肪酸[1]。花生四烯酸(Arachidonic acid，簡稱AA或ARA)，屬于 ω-6系列多不飽和脂肪酸，結(jié)構(gòu)式如圖1所示。ARA不僅是機體組織細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)成分；同時也是前列腺素、環(huán)前列腺素和白三烯類等二十碳衍生物的直接前體[2]。其具有多種生理活性[3]，已在保健食品、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。

圖1 ARA結(jié)構(gòu)式Fig.1 The structural formula of ARA.

高山被孢霉Mortierella alpina被認(rèn)為是最佳的ARA生產(chǎn)菌株，它具有ARA含量高且PUFAs組成合理等特點，研究較多。目前，利用M. alpina發(fā)酵生產(chǎn)ARA的研究主要集中在菌種選育、培養(yǎng)基優(yōu)化和關(guān)鍵酶等方面。近年來，本實驗室在利用M. alpina發(fā)酵生產(chǎn)ARA方面展開了研究，研究工作主要集中在高產(chǎn)菌株的誘變選育[4]、培養(yǎng)基優(yōu)化[5]和發(fā)酵工藝優(yōu)化[6]等方面。在研究過程中發(fā)現(xiàn)，油脂中ARA占總脂肪酸的百分含量較低，這也是利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)ARA油脂的技術(shù)瓶頸。利用傳統(tǒng)的生物工程技術(shù)，如誘變選育以及發(fā)酵過程控制等，都無法對ARA合成代謝途徑進(jìn)行有針對性的、定向的調(diào)控從而突破該瓶頸。利用基因工程技術(shù)對 ARA產(chǎn)生菌M.alpina進(jìn)行遺傳改造，可以定向選育ARA高產(chǎn)菌株，進(jìn)一步大幅度提高ARA發(fā)酵生產(chǎn)水平。本文簡要概述了利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)ARA的研究進(jìn)展，著重論述了生物合成 ARA代謝途徑中的關(guān)鍵酶以及利用基因工程技術(shù)對 ARA生產(chǎn)菌株進(jìn)行遺傳改造的研究，對未來發(fā)展趨勢進(jìn)行展望，并提出了這一研究領(lǐng)域未來可能的研究方向。

1 ARA產(chǎn)生菌誘變選育

微生物發(fā)酵生產(chǎn) ARA過程中，獲得一株性狀優(yōu)良的生產(chǎn)菌株是 ARA發(fā)酵生產(chǎn)的關(guān)鍵。因此，對生產(chǎn)菌種進(jìn)行誘變選育是提高 ARA發(fā)酵水平的首要工作。1987年，Totani和Oba[7]發(fā)現(xiàn)M. alpina的某些菌株中，ARA累積量能達(dá)到總脂肪酸含量的68.5%～78.8%。1996年，Eroshin等[8]發(fā)現(xiàn)被孢霉菌對培養(yǎng)基中的乙酰水楊酸敏感，利用含乙酰水楊酸的培養(yǎng)基選擇性地篩選了產(chǎn) ARA的被孢霉，ARA含量超過 40%。1997年，Chen等[9]在 10℃的低溫下篩選到一株油脂中ARA含量達(dá)42.4%的菌株M.alpinaWuji-H4。2002年，Yuan等[10]利用離子束注入生物技術(shù)對M. alpina進(jìn)行誘變，篩選到高產(chǎn)菌株I49-N18，并進(jìn)行了 50 t罐發(fā)酵試驗，ARA產(chǎn)量為5.11 g/L。2004年，Sakuradani等[11]用亞硝基胍(MNNG) 誘變M. alpina1S-4得到了ω-3脫氫酶活性較低的突變株Yl1，其ARA產(chǎn)量從3.74 g/L提高到了4.97 g/L。本實驗室ARA生產(chǎn)菌株M. alpinaME-1[12-13]是利用代謝控制育種原理，自行誘變篩選獲得的。該菌株現(xiàn)保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為：CCTCCM207067。對已有文獻(xiàn)報道中ARA含量較高的菌株進(jìn)行了總結(jié)比較，由表1可知，本實驗室所保藏的菌株M. alpinaME-1的ARA發(fā)酵水平已處于世界領(lǐng)先水平。

表1 不同菌株發(fā)酵產(chǎn)ARA水平Table 1 The fermentation level of ARA production by various microorganisms

2 ARA發(fā)酵調(diào)控

ARA產(chǎn)量主要受菌體生物量、總油脂含量和油脂中ARA的含量等因素的制約，而它們主要都受外界環(huán)境如培養(yǎng)基的組成和發(fā)酵工藝等因素的影響。為了在實際生產(chǎn)中獲得高純度和高濃度的 ARA油脂，必須對培養(yǎng)基和發(fā)酵工藝進(jìn)行研究，以期獲得高生物量、油脂含量和ARA含量。

在發(fā)酵過程中，培養(yǎng)基的組成不僅影響生產(chǎn)效率，也影響菌絲的形態(tài)，而菌絲形態(tài)則影響到氣體的擴散、物質(zhì)和熱量的轉(zhuǎn)移以及均勻性等。研究人員通過研究證實溶氧、氮源、C/N比、以及礦物質(zhì)和氨基酸的添加等因素都會影響菌絲的形態(tài)。Koike等[20]發(fā)現(xiàn)C/N比為15～20時，菌絲的形態(tài)最有利于ARA的積累。針對培養(yǎng)基的優(yōu)化，國內(nèi)外研究人員已經(jīng)進(jìn)行了大量的研究。Higashiyama等[21]研究了無機鹽對M. alpina菌絲形態(tài)和ARA產(chǎn)量的影響，在添加一定無機鹽優(yōu)化的培養(yǎng)基中，ARA產(chǎn)量達(dá)9.8 g/L。Peng等[5]利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化M. alpinaME-1生產(chǎn)ARA培養(yǎng)基成分，生物量達(dá)36.86 g/L，ARA產(chǎn)量達(dá)9.65 g/L。當(dāng)在培養(yǎng)基中添加某些外源物質(zhì)時，ARA產(chǎn)量也能得到進(jìn)一步提高。Singh等[15]研究發(fā)現(xiàn)，添加黃豆粉和植物油可以顯著提高生物量和ARA的產(chǎn)量，ARA最高達(dá)11.1 g/L。

目前，ARA發(fā)酵工藝優(yōu)化的研究主要圍繞補料分批發(fā)酵、溶氧控制、菌絲體老化以及兩階段發(fā)酵控制等方面展開。Hwang等[19]通過補料添加葡萄糖，并用NH4OH調(diào)節(jié)pH值，菌體干重提高了4倍，ARA的含量提高到 18.8 g/L。利用M. alpina發(fā)酵生產(chǎn)ARA可分為菌體生長及油脂積累2個階段，油脂積累階段采用菌絲體老化工藝則有利于ARA的快速積累。Jin等[22]對傳統(tǒng)老化工藝進(jìn)行改進(jìn)，最終 ARA產(chǎn)量高達(dá)19.02 g/L，是傳統(tǒng)工藝的1.55倍。ARA發(fā)酵過程中溶氧是一個限制因素，在補料生產(chǎn)過程中高濃度生物量的獲得非常困難。針對此問題，通常采用大通氣量和高攪拌輸出功率相結(jié)合的方法，但該方法不利于絲狀真菌發(fā)酵生產(chǎn)過程，因此研究新的供氧方式十分重要。Jin等[12]利用乙醇脅迫作用及兩步法發(fā)酵來提高ARA產(chǎn)量，發(fā)酵5 d后將降低轉(zhuǎn)速，提高通氣量，延長了發(fā)酵穩(wěn)定期。在第5天和第7天分別添加3%和2%的乙醇，ARA產(chǎn)量為19.8 g/L，達(dá)到世界領(lǐng)先水平。Peng等[6]采用正十六烷作為氧載體來提高發(fā)酵液中溶氧濃度 (DO)，通過在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加正十六烷，發(fā)酵體系的傳氧系數(shù) (KLa)和DO值都大大提高，最終ARA產(chǎn)量達(dá)到15.9 g/L，比單一的兩階段轉(zhuǎn)速控制發(fā)酵法提高了28.9%。

利用現(xiàn)代生物工程新技術(shù)，例如ARA生產(chǎn)菌株的誘變選育、發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵工藝的優(yōu)化以及發(fā)酵過程的實時調(diào)控等技術(shù)，最終ARA的產(chǎn)量能得到一定幅度的提高。但是，這些傳統(tǒng)的操作手段并未能從ARA合成途徑等深層次去指導(dǎo)發(fā)酵調(diào)控，從而進(jìn)一步大幅度提高ARA產(chǎn)量。

3 ARA合成的關(guān)鍵酶及其遺傳改造

從20世紀(jì)末開始，日本、英國等展開了對利用產(chǎn)油微生物生產(chǎn)PUFAs的研究。迄今為止，各國研究人員在利用M. alpina發(fā)酵產(chǎn)ARA機理方面的研究已經(jīng)卓有成效，尤以日本京都大學(xué) Shimizu教授實驗室為代表。該實驗室在利用M. alpina1S-4發(fā)酵產(chǎn)多不飽和脂肪酸的途徑、關(guān)鍵酶以及基因工程育種等方面進(jìn)行了非常詳盡的研究[23]。

本實驗室在研究過程中發(fā)現(xiàn)，C18脂肪酸累積量較高，尤其是硬脂酸 (C18:0) 和油酸 (C18:1) 的含量較高，導(dǎo)致最終ARA占總脂肪酸中的百分含量較低，降低了ARA的合成效率，這也是目前利用微生物發(fā)酵產(chǎn)ARA油脂的技術(shù)瓶頸。運用傳統(tǒng)的發(fā)酵工程手段并不能較好地解決以上這些問題。因此，對ARA生物合成的代謝途徑進(jìn)行分析，并從分子水平或者代謝機理方面展開研究，有望實現(xiàn)富含ARA的油脂的高效生產(chǎn)。

3.1 ARA合成的關(guān)鍵酶

3.1.1ARA合成途徑以及關(guān)鍵酶

微生物發(fā)酵合成 PUFAs的代謝途徑如圖 2所示。PUFAs生物合成[24]從油酸 (Oleic acid，OA) 開始，Δ12脂肪酸脫氫酶催化油酸形成亞油酸。亞油酸是合成亞麻酸的前體物質(zhì)，在Δ6脂肪酸脫氫酶催化下形成γ-亞麻酸 (GLA)。GLA在碳鏈延長酶催化下，合成雙高-γ-亞麻酸 (DGLA)，然后經(jīng)Δ5脂肪酸脫飽和酶催化，將DGLA第5位碳原子上的氫脫除轉(zhuǎn)化成 ARA?？v觀 PUFAs合成途徑[23]，脂肪酸脫飽和酶 (Desaturase)、碳鏈延長酶 (Elongase) 和NADH-細(xì)胞色素b5還原酶等酶都是ARA合成代謝途徑中的關(guān)鍵酶。

長期以來脫飽和被認(rèn)為是PUFAs生物合成過程中的限速步驟，因此絕大多數(shù)的研究都集中脫飽和酶基因的克隆與表達(dá)及其酶學(xué)性質(zhì)研究等方面[25]。自20世紀(jì)90年代初，Shimizu教授的實驗室就開始展開關(guān)于脫飽和酶酶學(xué)性質(zhì)方面的研究。隨后，Δ5脂肪酸脫飽和酶[26]、Δ12脂肪酸脫飽和酶[27]、Δ6脂肪酸脫飽和酶[28]等去飽和酶的功能逐一被揭開，并且獲得了相應(yīng)酶缺陷型菌株的特異產(chǎn)物。這些研究為全面剖析PUFAs的合成途徑奠定了堅實的基礎(chǔ)。然而近期的研究卻表明，脫飽和并非ARA合成過程的限速步驟。2000年，Wynn等[29]證實碳鏈延長酶催化GLA合成DGLA才是ARA合成過程中的限速步驟。2005年，Takeno等[30]進(jìn)一步從分子水平驗證，該反應(yīng)是M. alpina合成ARA過程中的限速步驟。因此，對碳鏈延長酶進(jìn)行基因操作可以作為提高ARA產(chǎn)量的一條有效途徑。不論脫飽和過程和延長過程兩者哪一個步驟是限速步驟，這兩種參與反應(yīng)的酶都是 ARA合成途徑中不可或缺的關(guān)鍵酶。而NADH-細(xì)胞色素 b5還原酶 (CbR) 作為電子傳遞鏈的一部分，參與多種酶反應(yīng)，其中就包含脂肪酸乙酰輔酶A的去飽和反應(yīng)以及延長反應(yīng)[31]。因而，這個酶也是PUFAs合成過程中的一個關(guān)鍵酶。1999年，Sakuradani等[31]從M. alpina中成功克隆得到CbR的編碼基因，通過序列比對發(fā)現(xiàn)該基因序列與其他來源 (如釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae) 的 CbR基因序列類似。并且對M. alpinaCbR進(jìn)行純化，純化后的CbR與NADPH相比，更偏愛NADH作為給電子體。隨著關(guān)鍵酶方面研究的不斷深入，經(jīng)過多年研究的累積，研究人員對M. alpina合成ARA代謝途徑已有比較清晰完整的認(rèn)識。

圖2 PUFAs生物合成代謝途徑Fig.2 Pathways for the biosynthesis of PUFAs in microorganism. ΔN: ΔN desaturase; EL: fatty acid elongase.

3.1.2關(guān)鍵酶在不同體系中的表達(dá)

近些年，研究人員對ARA合成途徑中的關(guān)鍵酶進(jìn)行了大量系統(tǒng)的研究工作，克隆得到了關(guān)鍵酶的編碼基因，并進(jìn)一步將這些關(guān)鍵酶的基因在其他缺乏此類酶的生物體系中實現(xiàn)了表達(dá)。2001年，劉莉等[32]將M. alpinaATCC16266菌株體內(nèi)Δ6脂肪酸脫氫酶克隆到釀酒酵母后，γ-亞麻酸含量占總脂肪酸的含量達(dá)到 31.6%。該基因在釀酒酵母體系中表達(dá)量為國內(nèi)外領(lǐng)先水平。2004年，李明春等[33]初步建立起Δ6脂肪酸脫氫酶在畢赤酵母中的表達(dá)體系，實現(xiàn)了M. alpinaΔ6脂肪酸脫氫酶在畢赤酵母中的表達(dá)，最終γ-亞麻酸含量占總脂肪酸的16.26%。2006年，Chen等[34]通過將Δ5、Δ6脫飽和酶和碳鏈延長酶基因在大豆種子中進(jìn)行表達(dá)，在大豆油中累積了GLA、二十碳二烯酸 (EDA)、DGLA和ARA，提升了大豆油的品質(zhì)。這種方法使得從產(chǎn)油植物中獲得所需的PUFAs成為可能。

3.2M. alpina遺傳操作系統(tǒng)

對 ARA生物合成代謝途徑及關(guān)鍵酶的研究是開展基因工程育種研究的必要前提。隨著人們對于ARA生物合成關(guān)鍵酶在分子水平上的認(rèn)識逐步加深，利用基因工程手段改造 ARA生產(chǎn)菌株以提高ARA的發(fā)酵水平日益受到研究人員的青睞。為了高效使用基因工程技術(shù)，構(gòu)建適合目的菌株的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)是先決條件。目前，研究人員已成功構(gòu)建多種高山被孢霉的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，為日后基因工程育種方面的研究奠定了堅實的基礎(chǔ)。

2000年，Mackenzie等[35]首次建立了M. alpinaCBS 224.37的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，成功構(gòu)建了pD4載體。該載體以同源his H4.1p為強啟動子，修正的潮霉素B抗性基因hpt(mod) 為標(biāo)記基因，采用PEG原生質(zhì)體介導(dǎo)的方法成功地將載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，經(jīng)潮霉素抗性篩選得到重組子。2004年，Takeno等[36-37]針對M. alpina1S-4菌株抗潮霉素的性狀，首先利用誘變劑 MNNG對菌種進(jìn)行誘變篩選出尿嘧啶缺陷菌株。嘧啶核苷酸合成途徑中有 2個較關(guān)鍵的酶，即乳清酸磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶 (OPRTase) 和乳清苷單磷酸脫羧酶 (OMPdecase)，ura5和ura3基因分別編碼OPRTase和OMPdecase。通過對比分析缺陷型菌株與原始菌株中這兩種酶活的變化，證實尿嘧啶缺陷菌株缺乏OPRTase，同時分離得到ura5基因。然后在pD4載體的基礎(chǔ)上，建立了以ura5基因為選擇性基因的pDura5載體。該載體以同源 his H4.1p作為強啟動子、ura5基因為標(biāo)記基因、異源絲狀真菌的 trpCt為轉(zhuǎn)錄終止子。通過基因槍轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入M. alpina1S-4孢子，成功篩選到重組子。2009年，Ando等[38]構(gòu)建了M. alpina1S-4的根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。該轉(zhuǎn)化系統(tǒng)轉(zhuǎn)化方法為根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，載體仍然使用pDura5載體。這種方法轉(zhuǎn)化頻率高，且獲得的轉(zhuǎn)化子的有絲分裂穩(wěn)定性比微粒轟擊法更高。但是 Shimizu教授實驗室構(gòu)建的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)都需要篩選缺陷菌株，前期準(zhǔn)備工作繁雜、工作量大、重復(fù)性不高，而且轉(zhuǎn)化子具有生長速率低、產(chǎn)油率低等缺點。為了解決這些問題，構(gòu)建簡便易操作的M. alpina1S-4轉(zhuǎn)化系統(tǒng)成為首要任務(wù)。2005年，Takeno等[39]通過實驗驗證，高濃度的爭光霉素(20 mg/mL) 對M. alpina1S-4菌絲生長有抑制作用。2009年，Ando等[40]證實，100 μg/mL 萎銹靈能完全抑制M. alpina1S-4菌絲生長和孢子萌發(fā)。由此，分別建立 2種以原始菌株作宿主細(xì)胞的新型的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，載體分別以zeo和sdhB基因為抗性基因。這2種新型轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的構(gòu)建使得基因操作簡便易行。

3.3M. alpina遺傳改造

遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的建立，為利用遺傳改造M.alpina進(jìn)一步提高PUFAs發(fā)酵水平奠定了基礎(chǔ)。一些分子選育高產(chǎn) ARA菌株的基因操作即建立在這些轉(zhuǎn)化系統(tǒng)上?；蚬こ逃N可以定向調(diào)控代謝產(chǎn)物的種類及產(chǎn)量。目前，通過基因工程手段提高M(jìn).alpina生物合成ARA水平的主要方法有：基因敲除、RNA干擾以及過量表達(dá)技術(shù)。

Sakuradani等[23,41]通過誘變篩選獲得 Δ12脂肪酸脫氫酶缺陷型突變株M. alpinaJT-180，且測得該突變株中的Δ5和Δ6脂肪酸脫氫酶酶活性比原始菌株高。將 Δ12脂肪酸脫氫酶的基因在突變株M. alpinaJT-180中過表達(dá)，在相同的培養(yǎng)條件下，ARA產(chǎn)量比原始菌株提高66.7%，在總脂肪酸中的百分含量也提高了 18%。2005年，Takeno等[30]在pDura5載體上連接GLELO基因 (編碼脂肪酸延長酶 EL2)，并成功導(dǎo)入目的菌株，使其催化 GLA向DGLA轉(zhuǎn)化，因此ARA的產(chǎn)率得到了大幅度提高。相同培養(yǎng)條件下，ARA產(chǎn)量比原始菌株提高了近1倍。而脂肪酸延長酶EL1基因在M. alpina1S-4中過表達(dá)，也能加快ARA的合成速率并且提高ARA產(chǎn)量。碳鏈延長酶基因的過表達(dá)對M. alpina合成ARA有重要的影響?；贛. alpina基因水平上的深入研究，推動了研究人員對于ARA合成的代謝機理方面的認(rèn)識。

本實驗室長期以來主要在發(fā)酵調(diào)控方面對ARA的合成進(jìn)行研究，并且取得了一定的成果。通過對培養(yǎng)基和發(fā)酵條件的優(yōu)化，ARA的產(chǎn)量已經(jīng)達(dá)到世界領(lǐng)先水平。但是通過對樣品分析，我們發(fā)現(xiàn) C18脂肪酸百分含量比 ARA百分含量高，甚至高出許多。針對該問題，本實驗室擬進(jìn)一步開展基因工程方面的研究，對ARA生產(chǎn)菌株的某些位點酶進(jìn)行改造，從深層次把握整個ARA生物合成代謝途徑，來進(jìn)一步提高ARA產(chǎn)量。

4 展望

隨著對微生物發(fā)酵法生產(chǎn) ARA一系列關(guān)鍵性問題的解決，ARA必將大規(guī)模走向產(chǎn)業(yè)化。ARA發(fā)酵生產(chǎn)中，還存在著葡萄糖轉(zhuǎn)化率低 (5%～10%)、生長周期長 (7～12 d) 和發(fā)酵過程難以控制等問題，這主要是由于ARA的生物合成機制十分復(fù)雜，從葡萄糖至ARA的合成涉及20多步酶促反應(yīng)。

傳統(tǒng)的發(fā)酵調(diào)控 (例如培養(yǎng)基優(yōu)化、溶氧、pH調(diào)控等) 無法對ARA合成進(jìn)行有針對性的、定向的調(diào)控。從基礎(chǔ)科學(xué)問題上看，由于ARA產(chǎn)生菌多為非模式微生物，對其遺傳背景的不了解以及對整個脂肪酸代謝網(wǎng)絡(luò)的認(rèn)識不夠，導(dǎo)致發(fā)酵調(diào)控的盲目性以及不穩(wěn)定性。1991年，Bailey教授在Science上發(fā)表文章[42]，首次詳細(xì)論述了代謝工程，標(biāo)志了代謝工程新學(xué)科的誕生。其與細(xì)胞生物學(xué)、基因工程等技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用已成為研究和控制微生物生長代謝的一個必不可少的手段。因此，對ARA發(fā)酵過程有必要利用先進(jìn)的代謝工程方法對整個脂肪酸網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行系統(tǒng)的分析研究，利用代謝流分析和代謝流控制、優(yōu)化等理論指導(dǎo)發(fā)酵調(diào)控，在全局代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的基礎(chǔ)上實現(xiàn)脂肪酸生產(chǎn)與菌體生長之間的平衡，以期達(dá)到ARA產(chǎn)量最大化。

獲得一株性狀優(yōu)良的生產(chǎn)菌株是 ARA發(fā)酵生產(chǎn)的關(guān)鍵。在國內(nèi)外研究中，盡管利用基因工程技術(shù)對菌株進(jìn)行改造能在一定程度上提高發(fā)酵水平，但是總體而言收效甚微。因而，選育高效的ARA高產(chǎn)菌株必定成為未來研究的重點。全局轉(zhuǎn)錄機器工程[43]和多基因組工程[44]等新興發(fā)展的工業(yè)微生物育種技術(shù)，能深入到轉(zhuǎn)錄水平和基因組水平對菌株進(jìn)行選育，成為研究人員熱點關(guān)注的對象。因此，在未來的研究中，利用新技術(shù)選育高產(chǎn)菌株必將成為一種趨勢，從而更好地為工業(yè)生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展服務(wù)。

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Progress in production of arachidonic acid byMortierella alpinaand genetic modification

Leilei Cong, Chao Peng, Xiaojun Ji, Zhiyong Li, Jiangying You, Jinmiao Lu, and He Huang

State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering,College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering,Nanjing University of Technology,Nanjing210009,China

Received:May 4, 2010;Accepted:July 12, 2010

Supported by:Key Program of National Natural Science Foundation of China (No. 20936002), National Basic Research and Development Program of China (973 Program) (Nos. 2007CB707805, 2009CB724700), the Fifth of Six Projects Sponsoring Talent Summits of Jiangsu Province (No.2008-D-63), College Industrialization Project of Jiangsu Province (No. JH09-30), Program for Century Excellent Talents in University from the Ministry of Education of China (No. NCET-09-0157), the Fok Ying Tung Education Foundation, Ministry of Education of China (No. 123014).

Corresponding author:He Huang. Tel/Fax: +86-25-83172094; E-mail: biotech@njut.edu.cn

國家自然科學(xué)基金重點項目 (No. 20936002)，國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃 (973計劃) (Nos. 2007CB707805, 2009CB724700)，江蘇省六大人才高峰項目 (No. 2008-D-63)，江蘇省高?？蒲谐晒a(chǎn)業(yè)化推進(jìn)項目 (No. JH09-30)，教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才計劃 (No. NCET-09-0157)，教育部霍英東教育基金 (No. 123014) 資助。