微生物法生產(chǎn)1,3-二羥基丙酮代謝工程研究進展

孫麗慧，胡忠策，鄭裕國，沈寅初

浙江工業(yè)大學生物工程研究所，杭州 310032

代謝工程

微生物法生產(chǎn)1,3-二羥基丙酮代謝工程研究進展

孫麗慧，胡忠策，鄭裕國，沈寅初

浙江工業(yè)大學生物工程研究所，杭州 310032

1,3-二羥基丙酮是一種重要的化工原料和醫(yī)藥中間體，廣泛應用于化妝品、醫(yī)藥、食品等領域。以下綜述了微生物法生產(chǎn) 1,3-二羥基丙酮的代謝途徑和關鍵酶，以及微生物法生產(chǎn) 1,3-二羥基丙酮所涉及的代謝工程技術的研究進展。指出利用基因工程的方法對菌株進行改造，提高甘油脫氫酶催化活性，同時根據(jù)菌株的代謝特性，對發(fā)酵過程進行調(diào)控，提高1,3-二羥基丙酮的得率，是今后的研究方向。

1,3-二羥基丙酮，代謝工程，發(fā)酵，甘油

Abstract:1,3-Dihydroxyacetone is widely used in cosmetics, medicines and food products. We reviewed the recent progress in metabolic pathways, key enzymes, as well as metabolic engineering for microbial production of 1,3-dihydroxyacetone. We addressed the research trend to increase yield of 1,3-dihydroxyacetone by improving the activity of glycerol dehydrogenase with genetic engineering, and regulating of fermentation process based on metabolic characteristic of the strain.

Keywords:1,3-dihydroxyacetone, metabolic engineering, fermentation, glycerol

1,3-二羥基丙酮 (1,3-Dihydroxyacetone，DHA)是最簡單的酮糖，外觀是白色粉末狀結晶，有甜味，易溶于水、乙醇、丙酮和乙醚等溶劑。一般狀態(tài)下是以二聚體 (1,4-Dioxane) 結晶的形式存在，但經(jīng)過溶解或加熱則變成單體[1]。由于DHA分子中具有3個官能團，其化學性質(zhì)活潑，可參與多種反應，因而作為重要的化學合成中間體和多功能試劑，在化工、醫(yī)藥、食品等領域有著廣泛的應用[2]。DHA 的生產(chǎn)方法有化學法和微生物法[3-5]?；瘜W法合成DHA需要價格較高的原料或者較昂貴的金屬催化劑，原料利用率低，導致生產(chǎn)成本較高，且對環(huán)境污染嚴重；而微生物法具有對環(huán)境友好、專一性強、反應條件溫和、底物利用率高等優(yōu)點，越來越受到人們的廣泛重視。微生物法生產(chǎn)DHA相比化學合成法而言，既符合綠色化工的要求，又可避免化學合成的困難，同時可以實現(xiàn)人類社會生產(chǎn)由傳統(tǒng)的以不可再生化石資源為原料的石油煉制向以可再生生物質(zhì)資源為原料的生物煉制轉型。

1898年Bertrand首先報道了甘油微生物法生產(chǎn)DHA[3]。自上世紀 50?60年代起，各國科研人員逐步展開了微生物法生產(chǎn)DHA的研究，并不斷深入，研究內(nèi)容主要涉及到菌種的誘變篩選、發(fā)酵工藝的優(yōu)化、發(fā)酵底物和產(chǎn)物對DHA合成的影響、反應動力學等[6-8]。在國內(nèi)，我們于 2001年率先報道了微生物法轉化甘油生產(chǎn)DHA的研究[9]，并開展了發(fā)酵工藝優(yōu)化、產(chǎn)業(yè)化放大等研究工作，已取得了較好的研究開發(fā)成果[5,9-13]。目前國內(nèi)外學者在代謝工程技術應用于微生物產(chǎn) DHA方面的研究也取得了一定的進展，可以預計對提高DHA的生產(chǎn)水平具有重要作用。

1 微生物代謝產(chǎn)DHA的途徑及關鍵酶

目前研究發(fā)現(xiàn)，很多微生物都能夠利用甘油或甲醇為底物代謝產(chǎn)生 DHA，利用微生物代謝產(chǎn)生DHA通常有兩種途徑。一種產(chǎn)生DHA路線是以甘油為底物，利用微生物代謝產(chǎn)生的甘油脫氫酶，將甘油分子結構中2位C 上的羥基進行脫氫反應，轉化成DHA；另一種產(chǎn)生路線是以甲醇為底物，首先將甲醇氧化生成甲醛，然后與 5-磷酸木酮糖在二羥基丙酮合成酶的作用下生成DHA和3-磷酸甘油醛。

能夠產(chǎn)生甘油脫氫酶 (GDH) 的微生物，如大腸桿菌Escherichia coli[14]、氧化葡萄糖酸桿菌Gluconobacter oxydans[10,15]、木醋桿菌Acetobacter xylinum[16]和產(chǎn)氣克雷伯氏菌Klebsiella aerogenes[17]等，它們都能將甘油代謝轉化生成DHA；能夠產(chǎn)生二羥基丙酮合成酶 (DHAS) 的甲基營養(yǎng)型酵母[18]，如多形漢遜酵母Hansenula polymorpha和博伊丁假絲酵母Candida boidinii等，能夠以甲醇作為底物，生成DHA；另外還有部分甲基營養(yǎng)型酵母既能夠產(chǎn)生甘油脫氫酶，又能產(chǎn)生二羥基丙酮合成酶，如Liu等[13]從土壤中分離得到一株膜璞畢赤酵母Pichia membranifaciens，在初始甘油濃度為40 g/L的培養(yǎng)基中，可獲得DHA 13.57 g/L。在上述所有產(chǎn)DHA的微生物中，有關氧化葡萄糖酸桿菌Gluconobacter oxydans的研究報道最多，該菌種生產(chǎn)性能穩(wěn)定，甘油生成DHA的轉化率高，是目前用于工業(yè)化生產(chǎn)的主要菌株。

微生物中的甘油脫氫酶 (Glycerol dehydrogenase，GDH) 按照其依賴輔酶的情況可劃分為3種類型[19]：第一種為依賴NAD+的GDH (EC1.1.1.6)，主要存在于細胞質(zhì)中，它將甘油轉化為DHA后，DHA進一步磷酸化，進入糖酵解和三羧酸循環(huán)途徑，為微生物生長提供能量。GDH (EC1.1.1.6) 存在于多種細菌的細胞質(zhì)中[19]，如E. coli、弱氧化醋桿菌Acetobacter suboxydans和克雷伯氏肺炎桿菌Klebsiella pneumonia等。第二種GDH (EC1.1.1.72和EC1.1.1.156) 需要以NADP+作為輔酶因子，這類GDH大多存在于霉菌和動物組織中，如構巢曲霉Aspergillus nidulans、粗糙脈孢霉Neurospora crassa、米曲霉Aspergillus oryzae、深綠木霉Trichoderma aureoviride等[20]，可將甘油氧化為 DHA或甘油醛。第三種 GDH(EC1.1.99.22) 既不依賴NAD+、也不依賴NADP+，主要存在于葡萄糖酸桿菌屬 (氧化葡萄糖酸桿菌Gluconobacter oxydans、弱氧化葡萄糖酸桿菌Gluconobacter suboxydans等) 的細胞膜上[21-22]。

在G. oxydans中，GDH (EC1.1.1.6) 和 GDH(EC1.1.99.22) 往往同時存在。G. oxydans代謝甘油產(chǎn)生DHA主要有兩條氧化途徑 (圖1)[22-23]。第一條代謝途徑是不需要ATP和輔酶因子NAD+，甘油可被細胞膜上的甘油脫氫酶一步直接氧化成DHA，這一過程的電子傳遞鏈由泛醌、細胞色素O和細胞色素O還原性酶組成，氧作為電子受體，并且該電子傳遞鏈與ADP氧化磷酸化形成ATP的過程相耦合，當細胞中糖酵解途徑及三羧酸循環(huán)途徑缺乏時，這條途徑可為細胞生長及其他代謝過程提供所需的能量；第二條代謝途徑是甘油進入細胞后，在細胞質(zhì)中甘油脫氫酶的作用下生成DHA，然后在二羥丙酮激酶作用下轉變?yōu)榱姿岫u丙酮 (DHAP)，或者甘油在磷酸激酶作用下磷酸化成甘油-3-磷酸(Glycerol-3-P)，然后經(jīng)細胞質(zhì)內(nèi)甘油-3-磷酸脫氫酶作用轉變成 DHAP，再進入磷酸戊糖循環(huán)途徑，這一過程需要 ATP，也需要輔酶因子 NAD+。在正常情況下，微生物細胞在以甘油作為唯一碳源培養(yǎng)基上生長時，細胞質(zhì)中代謝是其能量的主要來源。在沒有抑制劑或去耦合試劑存在時，甘油既在細胞膜上代謝也在細胞質(zhì)中代謝。

圖1 氧化葡萄糖酸桿菌代謝甘油的途徑Fig.1 Pathways of glycerol metabolism inG. oxydans.

以往研究發(fā)現(xiàn)，高濃度基質(zhì)甘油和高濃度產(chǎn)物DHA都會抑制甘油脫氫酶的活性，進而對發(fā)酵過程產(chǎn)生不利的影響。Bories等[24]研究發(fā)現(xiàn)，當初始甘油濃度從50 g/L提高到100 g/L，菌體生長和DHA生成能力都明顯下降。Ohrem等[25]發(fā)現(xiàn)，高濃度的DHA會抑制細胞膜系的甘油脫氫酶的活性，當DHA濃度達到61 g/L時，菌體停止生長，當DHA濃度達到108 g/L時，甘油停止轉化。為有效消除底物的抑制作用，Bauer等[15]研制開發(fā)出一種新型的半連續(xù)兩階段反復補料發(fā)酵工藝，最終可獲得高達220 g/L的DHA，這是目前國內(nèi)外所報道的最高產(chǎn)量。

微生物代謝甘油產(chǎn)生DHA的關鍵酶是GDH，因此，除了直接發(fā)酵法或靜息細胞催化法，也可以直接利用從微生物細胞中提取獲得的 GDH作為催化劑。然而，利用 GDH (EC1.1.1.6) 酶催化甘油生產(chǎn)DHA的反應需要以NAD+作為輔酶，輔酶的價格昂貴，而且生成的還原型輔酶NADH是NAD+的競爭性抑制劑[26]，因此有必要對輔酶進行循環(huán)再生。近年來，學者們開始考慮利用雙酶耦聯(lián)反應來解決酶催化過程中的輔酶再生問題。方柏山等將 GDH(EC1.1.1.6) 和 1,3-丙二醇氧化還原酶 (PDOR) 相耦合，以3-羥基丙醛和甘油為底物，利用GDH將甘油還原成DHA產(chǎn)生NADH，而PDOR氧化3-羥基丙醛生成1,3-丙二醇和NAD+，該方法實現(xiàn)了輔酶的再生，并大大提高了產(chǎn)品得率，在分批操作條件下，該酶耦聯(lián)催化反應產(chǎn)物得率都接近1 mol/mol[27]。然而，底物 3-羥基丙醛穩(wěn)定性差，并且酶的分離提純過程也相對繁瑣。在該研究基礎上，Nemeth等[28]提出了一個相對更為經(jīng)濟的微生物酶催化反應過程(圖2)，即在膜反應器中，利用甘油為底物，加入超聲破碎K. pneumoniae細胞和丁酸梭菌Clostridium butyricum細胞獲得的粗酶甘油脫水酶 (GDHt)、PDOR和GDH，進行酶催化反應，同時實現(xiàn)輔酶的再生。目前與輔酶再生相關的酶耦聯(lián)催化技術僅在實驗室中探索研究，在大規(guī)模生產(chǎn)上還受到一定的限制。

圖2 酶耦合催化甘油合成1,3-丙二醇和1,3-二羥基丙酮Fig.2 Enzymatic bioconversion of glycerol to PD and DHA.

2 代謝工程技術在微生物產(chǎn)DHA中的應用

近年來，隨著生物工程技術的迅猛發(fā)展，代謝工程技術已經(jīng)在生物醫(yī)藥、生物基化學品和生物能源等諸多領域展開了廣泛的應用。代謝工程(Metabolic engineering) 是利用分子生物學原理系統(tǒng)分析代謝途徑，設計合理的遺傳修飾戰(zhàn)略來定向改善細胞的特性，或運用重組DNA技術來構建新的代謝途徑[29]。國內(nèi)外學者將代謝工程技術應用于微生物生產(chǎn)DHA的研究工作主要包括兩個關鍵方面：1) 過量表達甘油脫氫酶基因，改善微生物細胞已有的代謝網(wǎng)絡；2) 將甘油脫氫酶基因在模式宿主菌中表達，構建新的代謝途徑或拓寬菌株的底物利用范圍。

基于微生物代謝途徑和代謝功能的解析，在重組 DNA技術基礎之上改善微生物細胞中已有的代謝網(wǎng)絡和表達調(diào)控網(wǎng)絡，實現(xiàn)生物加工過程的高效率，是代謝工程的重要內(nèi)容之一[30]。根據(jù)微生物代謝產(chǎn)生DHA的途徑，DHA的微生物法生產(chǎn)無論采用直接發(fā)酵技術還是利用生物催化 (整體細胞、酶)技術，其核心的問題是改善微生物細胞性狀，提高關鍵酶的表達。分子生物學的發(fā)展已經(jīng)能夠構建出DHA產(chǎn)生途徑中的甘油脫氫酶 GDH過量表達的基因工程菌，成為DHA微生物法生產(chǎn)的重要研究方向。而過量表達目的基因，強啟動子是必不可少的[31]。Gatgens等分別利用強啟動子tufB和gdh使G. oxydans膜系脫氫酶sldAB基因過量表達，不但提高了菌體生長的密度，還明顯提高了DHA濃度和轉化率。以 550 mmol/L甘油為底物，微生物法生產(chǎn)DHA的產(chǎn)量可以達到350 mmol/L，DHA產(chǎn)量比普通菌提高了75%[32]。為縮短克隆周期，提高克隆效率，Schleyer等構建了pEXGOX克隆和表達載體系統(tǒng)，該系列載體較小，僅為5.7 kb，序列結構明確，易于操作和改造，具有tufB強啟動子，能高效克隆和表達G. oxydans基因，并可以直接克隆平末端PCR產(chǎn)物[33]。

除將G. oxydans中甘油脫氫酶過量表達以外，也有學者考慮利用基因重組技術在宿主菌中表達異源甘油脫氫酶基因來提高DHA的產(chǎn)率。大腸桿菌和釀酒酵母菌是目前最常用基因工程宿主菌，它們的生理和遺傳機制、基因組信息、代謝網(wǎng)絡模型都研究的比較透徹[29]，同時大腸桿菌和釀酒酵母本身都具有代謝產(chǎn)生DHA的甘油脫氫酶，只是產(chǎn)DHA的能力很低。因此，以它們?yōu)樗拗骷毎Y合有效的遺傳操作技術，改造后的菌種產(chǎn)DHA能力能夠顯著提高。魏東芝等研究以沙門氏菌、克雷伯氏菌、醋酸桿菌、志賀氏菌、大腸桿菌或氧化葡萄糖桿菌基因組 DNA為模板，PCR擴增獲得編碼甘油脫氫酶基因gdh和編碼NADH脫氫酶基因ndh，利用PET系列表達載體分別構建基因工程質(zhì)粒 pET-gdh和pET-ndh，并將其分別或共同轉入大腸桿菌中。利用該重組菌代謝甘油生產(chǎn)DHA，提高了DHA的產(chǎn)率，同時收集到的菌體經(jīng)處理后可重復利用[34]。

代謝工程技術在 DHA生產(chǎn)中應用的另一個重要方向是根據(jù)微生物代謝甘油產(chǎn) DHA的途徑和關鍵酶，從降低DHA的生產(chǎn)成本角度考慮，利用基因工程技術改造菌種，改變微生物的代謝性能，使其將底物食譜擴展到諸如葡萄糖和淀粉之類廉價而豐富的可再生原料，這也是DHA規(guī)?；a(chǎn)使其在同類產(chǎn)品中更具競爭力的一個研究方向，值得我們予以特別關注。Nguyen等提出了利用能夠代謝葡萄糖產(chǎn)生甘油的釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae為出發(fā)菌株，并導入能夠表達甘油脫氫酶的外源基因，以實現(xiàn)利用葡萄糖為底物來發(fā)酵生成DHA (圖3)。作者分別將來源于H. polymorpha和E. coli中的甘油脫氫酶基因在S. cerevisiae中進行表達，構建轉化甘油生成DHA的途徑，結果表明來源于H. polymorpha依賴 NAD+的甘油脫氫酶基因在酵母中表達后，其催化活力相對較高，在葡萄糖濃度為20 g/L的搖瓶中發(fā)酵培養(yǎng)，DHA濃度可達100 mg/L，是野生株產(chǎn)量的5倍；此外，為阻斷DHA進一步被二羥丙酮激酶轉化生成 DHAP，作者還研究了將編碼二羥丙酮激酶的基因DAK1/DAK2敲除 (圖3)，同時過量表達H. polymorpha甘油脫氫酶基因，在同樣發(fā)酵條件下，DHA產(chǎn)量可提高到700 mg/L[35]。與國內(nèi)外文獻所報道的DHA發(fā)酵最好水平相比，雖然當前利用工程菌生產(chǎn)DHA的發(fā)酵水平還相對較低，但這些研究反過來對代謝工程方法應用于 DHA生產(chǎn)產(chǎn)生了有力的推動作用，為該領域研究提出了一個很好的發(fā)展方向。

圖3Saccharomyces cerevisiae利用葡萄糖產(chǎn)1,3-二羥基丙酮的代謝途徑和工程育種策略Fig.3 Metabolic pathways and engineering strategy for the production of DHA from glucose inSaccharomyces cerevisiae.FBP: 1,6-fructose bisphosphate; GAP: glyceraldehydes 3-phosphate;DHAP: dihydroxyacetone phosphate; G3P: glycerol 3-phosphate.

3 總結與展望

甘油作為生物柴油的主要副產(chǎn)物，其下游產(chǎn)品有DHA、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、丙烯醛、乙二醇、3-羥基丙酸、3-羥基丙醛、環(huán)氧氯丙烷等，其中DHA作為一種重要的化工原料和醫(yī)藥中間體，其后續(xù)衍生產(chǎn)品種類很多，且衍生產(chǎn)品市場容量大，因而DHA的市場潛力很大。

目前，微生物發(fā)酵法工業(yè)化生產(chǎn)DHA主要分布在美國、日本、德國。我國雖然起步相對較晚，但近年來也取得了喜人的研究成果。魏東芝教授課題組在微生物細胞固定化產(chǎn) DHA和基因重組工程菌方面做了很多研究工作[8,34]。我們所在團隊的浙江工業(yè)大學生物工程研究所近十余年來對微生物法生產(chǎn)DHA也做了大量的工作，包括建立了產(chǎn)DHA菌株的快速篩選模型[5]；對篩選得到高產(chǎn)DHA的微生物菌株G. oxydans在發(fā)酵過程中的代謝特性進行研究，通過分階段培養(yǎng)來控制代謝流的分配，提高了目標產(chǎn)物濃度和轉化率；同時對產(chǎn)物后續(xù)分離工藝也進行了研究，能夠得到高純度的DHA產(chǎn)品，符合化妝品添加劑、醫(yī)藥中間體等質(zhì)量指標?，F(xiàn)已在浙江海正藥業(yè)股份有限公司完成10 t發(fā)酵罐規(guī)模的生產(chǎn)性試驗，構建了年產(chǎn)1 000 t的DHA生產(chǎn)線，在生產(chǎn)規(guī)模下產(chǎn)物濃度達到250 g/L以上，并且還有進一步提升的潛力和空間，發(fā)酵水平明顯高于目前國內(nèi)外報道的最好水平 (采用半連續(xù)兩階段反復補料發(fā)酵工藝，最終可獲得高達220 g/L的DHA)[15]。我們將這些研究成果已經(jīng)成功地進行了產(chǎn)業(yè)化，生產(chǎn)菌種和生產(chǎn)工藝擁有自主知識產(chǎn)權[36-39]，技術指標達到國際領先水平，產(chǎn)品已經(jīng)在浙江海正藥業(yè)股份有限公司開始生產(chǎn)和銷售。

綜觀國內(nèi)外的研究現(xiàn)狀，盡管對微生物法生產(chǎn)DHA的研究取得了一定的進展，DHA的發(fā)酵技術已經(jīng)推上了產(chǎn)業(yè)化，但代謝工程技術應用在微生物生產(chǎn)DHA的研究報道還不多見，仍有許多研究和開發(fā)工作有待進行。一方面，可以利用基因工程的方法對菌株進行改造，提高甘油脫氫酶催化活性，并使其耐受高濃度底物和產(chǎn)物；另一方面，根據(jù)微生物的代謝特性，對發(fā)酵過程進行代謝調(diào)控，合理地設計發(fā)酵工藝，增加DHA途徑的代謝流分配，使底物甘油最大程度地轉化為DHA，減少代謝過程中的副產(chǎn)物，這樣既可以提高產(chǎn)物濃度，又降低了分離成本。同時，還要充分開發(fā) DHA下游產(chǎn)品，拓寬DHA的應用范圍。

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Progress in metabolic engineering of microbial production of 1,3-dihydroxyacetone

Lihui Sun, Zhongce Hu, Yuguo Zheng, and Yinchu Shen

Institute of Bioengineering,Zhejiang University of Technology,Hangzhou310032,China

Received:April 22, 2010;Accepted:July 7, 2010

Supported by:National Basic Research and Development Program of China (973 Program) (No. 2007CB714306), Key Research and Development Project of Zhejiang Province (No. 2008C01014-2).

Corresponding author:Yuguo Zheng. Tel: +86-571-88320614; Fax: +86-571-88320630; E-mail: zhengyg@zjut.edu.cn

國家重點基礎研究發(fā)展計劃 (973計劃) (No. 2007CB714306)，浙江省重大科技專項 (No. 2008C01014-2) 資助。