45例腎病綜合征患者腎組織c-Jun和c-Fos的表達(dá)及意義

喬 麗,余月明,曹禮應(yīng),蔡純青,郭 虹,王柏青,吳永雪

(成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院腎臟科 650032)

原發(fā)性腎病綜合征(nephrotic syndrome,NS)是一種免疫炎癥性疾病,臨床上以糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid,GC)治療為主,但患者對(duì)激素的反應(yīng)不同。部分患者開(kāi)始對(duì)GC敏感,在GC減量維持過(guò)程中因感染等原因,蛋白尿再次出現(xiàn),并出現(xiàn)GC抵抗,其機(jī)制尚不清楚。GC要與糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoid receptor,GR)結(jié)合后才能發(fā)揮作用?；罨鞍?1(activator protein-1,AP-1)是一類在細(xì)胞中發(fā)揮重要作用的核轉(zhuǎn)錄因子,介導(dǎo)許多與免疫反應(yīng)有關(guān)的細(xì)胞因子基因的轉(zhuǎn)錄活化過(guò)程,促進(jìn)炎癥的發(fā)生。AP-1的組成成員主要包括c-Jun和c-Fos。近年來(lái)的研究證實(shí),AP-1和GR相互拮抗,AP-1的變化影響GR的活性。因此c-Jun和c-Fos的含量可影響機(jī)體對(duì)GC的反應(yīng)。為此,本研究選取45例原發(fā)性NS患者檢測(cè)腎臟組織中c-Jun和c-Fos表達(dá)水平,探討這兩種轉(zhuǎn)錄因子在激素抵抗型NS患者中的作用及其臨床意義。

1 臨床資料

1.1 一般資料 入選病例為2006年1月至2006年5月在第三軍醫(yī)大學(xué)附屬新橋醫(yī)院腎內(nèi)科的原發(fā)性NS患者,腎活檢為微小病變或輕度系膜增生性腎小球腎炎患者。均符合1992年中華腎臟病學(xué)會(huì)制定的原發(fā)性腎小球疾病分類標(biāo)準(zhǔn)。各種繼發(fā)性腎小球腎炎患者、合并其他器官慢性炎癥(如:肝硬化、支氣管哮喘、動(dòng)脈粥樣硬化等)患者不進(jìn)入本實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 根據(jù)GC效果將原發(fā)性NS患者分為3個(gè)組:激素抵抗組,指潑尼松足量(1mg?kg-1?d-1)治療12周后,尿蛋白仍無(wú)明顯減少者,15例,其中男13例,女2例,年齡14～60歲;激素敏感組,指潑尼松足量治療8周內(nèi)尿蛋白轉(zhuǎn)陰的患者,減量后尿蛋白仍然陰性,15例,其中男9例,女6例,年齡18～59歲;復(fù)發(fā)后抵抗組,指潑尼松足量治療8周內(nèi)尿蛋白轉(zhuǎn)陰,在激素減量過(guò)程中于數(shù)周或數(shù)月后尿蛋白再次出現(xiàn)而再入院,增加激素用量仍不敏感的患者,15例,其中男13例,女2例,年齡14～60歲。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 標(biāo)本的收集 45例患者均于治療前行腎活檢術(shù)。其他指標(biāo)按常規(guī)方法收集標(biāo)本。

1.3.2 c-Jun和c-Fos免疫組織化學(xué)檢測(cè) 采用SP法進(jìn)行(試劑盒購(gòu)自深圳晶美生物工程有限公司,兔抗人c-Jun和c-Fos多克隆抗體分別購(gòu)自Santa Cruz公司和福建邁新公司)。所用玻片經(jīng)多聚賴氨酸預(yù)處理。將腎活檢組織常規(guī)石蠟包埋、切片(3μm)、脫蠟、脫水、微波修復(fù)、過(guò)氧化氫阻斷、山羊血清封閉、加兔抗人c-Jun(1∶50)或c-Fos抗體(工作原液)、4℃過(guò)夜、PBS沖洗后,滴加生物素標(biāo)記的羊抗兔二抗和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素,于37℃分別孵育20min,DAB顯色,蘇木素復(fù)染,封片。陰性對(duì)照采用PBS代替一抗。

1.3.3 圖像分析 對(duì)免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行顯微數(shù)碼攝影,注意攝影參數(shù)及輸入圖像背景灰度值一致。用Qwin圖像分析軟度件(leica)分析照片中腎臟組織的染色情況,所測(cè)定的腎臟組織灰度值表示腎臟組織的免疫組織化學(xué)染色強(qiáng)度。該軟件平均灰值越高則切片上免疫組織化學(xué)陽(yáng)性反應(yīng)呈現(xiàn)的顏色越淺,平均灰度值越低表明切片上免疫組織化學(xué)陽(yáng)性反應(yīng)呈現(xiàn)的顏色越深。

表1 各組患者血液生化和血白細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果比較(±s)

表1 各組患者血液生化和血白細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果比較(±s)

組別n肌酐(μmol/L)白蛋白(g/L)24h尿蛋白(g/d)白細(xì)胞(×109/L)激素敏感組15 71.27±6.08 20.17±3.57 3.83±0.28 8.18±1.74激素抵抗組15 82.50±17.39 19.91±3.95 3.86±0.27 9.01±1.33復(fù)發(fā)后抵抗組15 72.07±24.23 20.28±5.49 3.91±0.29 9.84±3.36

2 結(jié) 果

2.1 臨床指標(biāo) 各組間年齡、性別差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);各組間腎功能、血漿白蛋白、血白細(xì)胞和24h尿蛋白定量差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),見(jiàn)表1。

圖1 c-Jun在激素敏感組中的表達(dá)(×400)

圖2 c-Jun在激素抵抗組中的表達(dá)(×400)

圖3 c-Jun在復(fù)發(fā)抵抗組中的表達(dá)(×400)

圖4 c-Fos在激素敏感組中的表達(dá)(×400)

圖5 c-Fos在激素抵抗組中的表達(dá)(×400)

圖6 c-Fos在復(fù)發(fā)抵抗組中的表達(dá)(×400)

表2 各組C-jun和C-fos表達(dá)強(qiáng)度(灰度值)的比較(±s)

表2 各組C-jun和C-fos表達(dá)強(qiáng)度(灰度值)的比較(±s)

組別n c-Jun c-Fos激素敏感組15 183.07±4.28 180.13±7.21激素抵抗組15 160.27±6.62 162.24±7.31復(fù)發(fā)后抵抗組15 158.90±5.66 162.96±8.97

2.2 c-Jun和c-Fos的表達(dá) c-Jun和c-Fos在各組患者的腎小球和腎小管的胞核內(nèi)均有表達(dá),呈強(qiáng)弱不等的棕黃色(圖1～6)。復(fù)發(fā)后抵抗組和激素抵抗組腎組織中c-Jun和c-Fos表達(dá)明顯高于激素敏感組(P＜0.05);復(fù)發(fā)后抵抗組與激素抵抗組之間c-Jun和c-Fos表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),見(jiàn)表2。

3 討 論

GC與GR結(jié)合是GC發(fā)揮抗炎和免疫抑制作用的前提條件,說(shuō)明GR在調(diào)節(jié)GC療效方面具有極其重要的功能。GR作為一種轉(zhuǎn)錄因子,當(dāng)與胞漿中的GC結(jié)合后,形成GC-GR復(fù)和物迅速轉(zhuǎn)移進(jìn)細(xì)胞核與糖皮質(zhì)激素反應(yīng)元件(glucocorticoid response element,GRE)結(jié)合調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄,從而發(fā)揮GC的作用[1]。AP-1是一類在細(xì)胞中發(fā)揮重要作用的核轉(zhuǎn)錄因子,其組成成員主要包括c-Jun和c-Fos家族。AP-1能與DNA結(jié)合,并可與其他的轉(zhuǎn)錄因子家族以及細(xì)胞核激素受體結(jié)合。生理情況下,AP-1分子的構(gòu)成以c-Jun同源二聚體為主,具有微弱的DNA結(jié)合和基因轉(zhuǎn)錄活性。當(dāng)細(xì)胞受到刺激(如生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、神經(jīng)介質(zhì)和細(xì)胞外應(yīng)激等)時(shí),AP-1迅速轉(zhuǎn)變?yōu)橐詂-Jun和c-Fos異源二聚體為主的形式,其與DNA結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合能力及促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄的活性顯著增強(qiáng),從而促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生[2]。AP-1能干擾GC-GR復(fù)合體與GRE結(jié)合,降低GC生物學(xué)作用[3]。

本研究發(fā)現(xiàn),各組原發(fā)性NS患者腎小球和腎小管的胞核內(nèi)c-Jun與c-Fos均有表達(dá),激素抵抗組和復(fù)發(fā)后抵抗組腎組織中c-Jun與c-Fos的表達(dá)均高于激素敏感組。提示激素抵抗型NS患者腎臟組織中過(guò)表達(dá)的c-Jun和c-Fos可能影響GR功能,影響GC效應(yīng)的發(fā)揮,從而導(dǎo)致激素抵抗。同時(shí)也提示了c-Jun和c-Fos含量越高對(duì)激素的療效越差,越低療效越敏感。究竟是c-Jun還是c-Fos影響了GR,目前說(shuō)法并不一致。有許多實(shí)驗(yàn)證實(shí)了c-Fos的增加會(huì)影響GR的水平,Lane等[4]檢測(cè)了激素抵抗型哮喘患者外周血單核細(xì)胞c-Fos的mRNA水平及蛋白含量,發(fā)現(xiàn)激素抵抗組核酸及蛋白水平均高于正常對(duì)照組和激素敏感組,但在地塞米松孵育的外周血單核細(xì)胞中加入c-Fos的反義寡核苷酸后,GR與GRE的結(jié)合明顯增加。但是也有實(shí)驗(yàn)證實(shí)c-Jun也會(huì)影響GR,程曉剛等[5]研究表明c-Jun蛋白表達(dá)水平對(duì)GR的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄激活活性有影響,抑制c-Jun蛋白表達(dá),一定程度上可促進(jìn)GR表達(dá)并增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄激活功能。而本研究發(fā)現(xiàn)在激素抵抗時(shí)c-Jun與c-Fos都升高。

激素抵抗的機(jī)制現(xiàn)在仍不清楚,作者前期的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)激素抵抗組和復(fù)發(fā)后抵抗組患者血清中IL-1β和TNF-α明顯高于激素敏感組[6]。已有的研究發(fā)現(xiàn),IL-1β、TNF-α可使AP-1的活性升高,是否IL-1β和TNF-α通過(guò)影響AP-1活性繼而影響糖皮質(zhì)激素受體活性而發(fā)生激素抵抗,還有待進(jìn)一步研究。但是本試驗(yàn)說(shuō)明AP-1的高表達(dá)可能在激素抵抗的發(fā)生機(jī)制中起重要作用,與文獻(xiàn)報(bào)道相符[7-9]。但是AP-1的高表達(dá)是通過(guò)干擾GC-GR與GRE結(jié)合而導(dǎo)致激素抵抗,還是直接與GR結(jié)合使GR減少而導(dǎo)致激素抵抗,還需進(jìn)一步研究。

總之,腎組織中c-Jun和c-Fos的表達(dá)變化與原發(fā)性NS患者激素抵抗密切相關(guān);檢測(cè)腎組織中c-Jun和c-Fos的表達(dá),有助于原發(fā)性NS患者預(yù)后判斷和指導(dǎo)治療方案的調(diào)整。

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