人心肌肌鈣蛋白I的原核表達與純化

孫牧男，劉 磊，許淑芬，方艷秋，譚 巖

(吉林大學第一醫(yī)院中心實驗室，吉林長春130021)

心肌肌鈣蛋白作為診斷急性心肌梗死(AMI)及心肌損傷兩類重要心血管疾病的重要指標[1，2]成為近些年國內外研究的熱點，相關研究發(fā)現(xiàn)心肌肌鈣蛋白在鑒定急性心肌梗塞(AMI)溶栓治療后再灌注是否成功、非ST段抬高急性冠脈綜合征危險分層，病毒性心肌炎診斷，預測心衰死亡，識別具有短期內死亡和不良事件的高危急性肺梗死患者等臨床領域具有重要作用。

人心肌肌鈣蛋白(human cardiac troponin，hcTn)是一種與心肌收縮有關的調節(jié)蛋白，由TnI、TnT、TnC 3個亞單位組成。cTnI為可編碼209個氨基酸的蛋白質[3]，相對分子量約29 kD，等電點9.87。cT-nI分子質量比較小，對心肌損傷很敏感，當心肌細胞膜的完整性受破壞，cTnI先從胞漿內釋放，“微型心肌損傷”cTnI即可出現(xiàn)陽性結果，而與cTnT及cTnC亞單位結合的cTnI相對分子質量大，從心肌細胞緩慢持續(xù)的釋放，持續(xù)時間可達7-10 d[4]。由于cTnI可以較早出現(xiàn)在血中，且持續(xù)時間長，故檢測心肌型肌鈣蛋白I(cTnI)可以作為早期監(jiān)測急性心肌損傷的標志性蛋白[5]。

盡管cTnI對心肌細胞有高度特異性，但由于難以找到通用的校準品，各廠家的cTnI檢測不一致。本研究用基因工程方法在原核表達系統(tǒng)中獲得高效表達的人重組cTnI蛋白，為進一步制備高質量抗體及建立相關臨床檢測方法奠定了實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑 大腸桿菌JM109、M15[pREP4]、原核表達質粒pQE30由本室保存。pGEM-T easy載體購于美國promega公司，各種內切酶和T4 DNA連接酶均為TAKARA公司產品。質粒提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒均為Vitagene公司產品。鎳離子親和層析柱(Ni2+-NTA)購自Qiagen公司。生物素標記的馬抗小鼠IgG及辣根過氧化物酶標記的親和素均購自北京鼎國生物公司。BCA蛋白檢測試劑盒購自PIERCE公司。抗hcTnI單克隆抗體購自Santa Cruse公司?；瘜W試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR擴增hcTnI基因 TRIZOL試劑從人心肌組織中提取總RNA。紫外分光光度計測RNA的OD值并計算含量，根據(jù)promega公司AMV逆轉錄酶使用說明書操作逆轉錄合成單鏈cDNA，以人心肌基因組 cDNA為模板進行PCR。上游引物P1：5′-TAAGGA TCCATG GCGGACGGTAGCAGC-3′；下游引物 P2：5′-GCGTCGACCTAGCTCTCAAACTTCTTC-3′，其中上游和下游引物分別加入BamHⅠ和SalⅠ酶切位點(劃線部分)。94℃預變性5 min；94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸 1 min，共 35個循環(huán) ；72℃延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收PCR產物。

1.2.2 hcTnI基因測序鑒定 將回收的PCR產物與pGEM-T easy載體4℃過夜連接后轉化大腸桿菌感受態(tài)JM109，進行藍白篩選。挑選白色單菌落，在LB(Amp+)培養(yǎng)液中擴增后提取質粒，用BamHⅠ和SalⅠ雙酶切和 PCR鑒定初篩陽性克隆菌株，TAKARA公司測序。

1.2.3 重組表達載體的構建和鑒定 將測序正確的重組克隆質粒pGEM-hcTnI與原核表達質粒pQE30均用BamHⅠ和SalⅠ雙酶切和凝膠回收處理，切取的目的基因片段通過T4 DNA連接酶插入pQE30構建重組表達質粒pQE30-TnI，并轉化大腸桿菌感受態(tài)M15，挑選單菌落，在 LB(Amp+，Kana+)培養(yǎng)液中擴增后提取質粒，進行PCR鑒定，篩選帶有插入片段的克隆。

1.2.4 hcTnI重組蛋白的誘導表達 將轉化的大腸桿菌M15接種于LB(Amp+、Kana+)固體培養(yǎng)基37℃過夜培養(yǎng)，挑選4個振搖重組菌單菌落分別接種于5 ml LB(Amp+、Kana+)液體培養(yǎng)基，37℃、160 r?min-1振搖過夜 ，次日以 1∶50 接種于 1 L LB(Amp+、Kana+)液體培養(yǎng)基中，37 ℃，230 r?min-1振蕩培養(yǎng)至A600=0.6左右，加入終濃度為1.0 mmol?L-1的IPTG，繼續(xù)振搖誘導表達5 h，收集少量菌液并同高速離心后菌液沉淀進行SDS-PAGE電泳確定穩(wěn)定表達菌株。

1.2.5 hcTnI蛋白的免疫鑒定 選擇高表達目的蛋白的菌株，誘導表達hcTnI蛋白，進行SDS-PAGE及Western blot。用半干式轉移電泳儀電轉硝酸纖維素膜2 h，3%BSA 封閉液 4℃過夜，1×PBS洗膜 ，加入鼠抗人TnI單抗(1∶1 000)，37℃結合 2 h，洗膜 ，加入馬抗小鼠 IgG(1∶1 000)，37℃結合 2 h，洗膜，加入辣根過氧化物酶標記的親和素(1∶1 000)，37℃結合2 h，充分洗滌后DAB顯色鑒定表達產物。

1.2.6 重組TnI包涵體的提取及純化 誘導1 000 mL陽性表達菌液，離心收集菌體沉淀，超聲裂解菌體，離心得到的蛋白包涵體用變形裂解緩沖液重懸，4℃過夜變性至溶液清亮后經鎳凝膠親和層析法純化，SDS-PAGE電泳鑒定。

1.2.7 BCA法測定重組TnI表達量 變性后的包涵體上清SDS-PAGE電泳圖像經凝膠電泳圖像分析儀掃描得到TnI相對含量。應用BCA蛋白檢測試劑盒在562 nm可見光下測定標準蛋白(BSA)和純化的hcTnI的OD值，繪制BSA蛋白標準曲線，確定其純品濃度。

2 結果

2.1 RT-PCR獲得目的基因 將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，可見約633 bp的片段，大小與(GeneBank M64247)公布的人心肌肌鈣蛋白基因一致。

圖1 TnI PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳

2.2 hcTnI的測序鑒定 重組質粒pGEM T-hcTnI經BamHⅠ和SalⅠ雙酶切后可見約3 000 bp和633 bp大小的片段，PCR產物大約為633 bp與預期的大小一致。測序結果顯示與GeneBank上基因序列一致。

2.3 重組表達載體的構建和鑒定 以重組表達質粒pQE30-hcTnI為模板進行PCR鑒定，可獲得大小約為633 bp基因片段，證明hcTnI基因已連接到表達載體pQE30中。

圖2 pGEM T-hcTnI質粒酶切和PCR鑒定

圖3 pQE30-hcTnI 質粒酶切和PCR鑒定

2.4 重組蛋白的表達及純化 含重組表達質粒pQE30-hcTnI的大腸桿菌M15經1 mmol?L-1IPTG誘導后可表達一條相對分子量約29 KD的蛋白，表達量約占菌體總蛋白的28.7%，主要以包涵體形式存在，SDS-PAGE結果見圖4。鎳柱親和層析后獲得純度較高的hcTnI蛋白結果見圖5。

2.5 Western blot雜交 將純化的蛋白進行SDSPAGE電泳后進行Western blot印跡，在相對分子量約為29 KD處可見特異性著色帶，初步證實所表達的蛋白是帶六個組氨酸的融合蛋白，結果如圖6。

2.6 BCA法蛋白定量 BCA法測定純化后的hcT-nI蛋白在562 nm下吸光度為0.223 7，根據(jù)標準曲線可知蛋白含量為233.5 mg?L-1，結果如圖7。

3 討論

cTnI為心肌損傷敏感性和特異性最強的標志物之一，但是，目前臨床檢測cTnI的試劑盒多為進口產品，價格昂貴。采用傳統(tǒng)的方法，獲取人心肌樣品，從心肌組織中分離、純化cTnI過程非常復雜且產量有限，而基因工程技術提供了方便高效的蛋白制備方法。

圖4 hcTnI蛋白在大腸桿菌M15中的表達

圖5 hcTnI蛋白純化的 SDS-PAGE分析

圖6 hcTnI蛋白的 Western blot ting印記分析

本實驗通過Qiagen的pQE蛋白表達系統(tǒng)成功構建了原核表達載體pQE30-hcTnI，在大腸桿菌M15中經IPTG誘導后高效表達相對分子量約為29 KD的hcTnI蛋白，hcTnI蛋白約占菌體蛋白的25%左右。該蛋白主要以包涵體形式存在，所表達的融合蛋白帶有6個組氨酸標簽，這6個組氨酸沒有免疫原性，在pH8.0時最小，不帶電荷，一般不影響分泌或融合蛋白的折疊。一般情況下，組氨酸不干擾重組蛋白的結構和功能，并且有利于應用鎳凝膠親和層析對重組蛋白進行純化。

圖7 BCA法蛋白定量分析

天然cTnI很不穩(wěn)定，易被蛋白水解酶迅速降解[6]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，重組蛋白在表達時，即使形成了結構致密的包涵體，也會有部分降解，即使在下游的處理過程中加入蛋白酶抑制劑，低溫條件下重組cTnI蛋白在一周以后依然出現(xiàn)降解現(xiàn)象。提示對于重組cTnI蛋白制備需要在純化過程保持低溫環(huán)境條件，定時補充PMSF、DTT等蛋白酶抑制劑和純化后蛋白及時用于免疫。

本實驗獲得的大量純化hcTnI蛋白主要以包涵體形式存在，經Western blotting檢測證明抗體特異性良好。重組人心肌肌鈣蛋白的成功克隆、高效表達與純化將為下一步制備單克隆抗體，研制cTnI檢測試劑和早期診斷AMI奠定基礎。

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