超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測蜂蜜中氯霉素殘留

馮雷，張學(xué)忠，牛之瑞，祝紅昆，李波

（云南省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院，云南昆明650223）

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測蜂蜜中氯霉素殘留

馮雷，張學(xué)忠，牛之瑞，祝紅昆，李波

（云南省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院，云南昆明650223）

研究一種針對蜂蜜中氯霉素殘留量的液質(zhì)聯(lián)用分析方法。采用水溶解蜂蜜，用乙酸乙酯萃取蜂蜜水溶液中的氯霉素，氮吹至干后用水溶解樣品殘渣，然后用HLB小柱進行固相萃取，對樣品中的氯霉素進行凈化前處理。以乙腈-水作為流動相，C18色譜柱對蜂蜜的氯霉素進行分離，然后用電噴霧質(zhì)譜負(fù)離子多反應(yīng)監(jiān)測模式[ESI(-)-MRM]對氯霉素進行檢測，縮短了色譜分離時間，提高了檢測靈敏度和分析結(jié)果可靠性，具有準(zhǔn)確、快速以及高靈敏度和高選擇性的特點，能夠適應(yīng)大規(guī)模樣品的快速分析要求。

氯霉素；蜂蜜；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用；分析

氯霉素屬胺苯醇類廣譜抗生素，由Ehrlich等在1947年首次從微生物代謝產(chǎn)物中分離得到，目前用人工方法合成,已廣泛用于動物各種傳染性疾病的治療[1]。氯霉素對人體有嚴(yán)重的副作用，它能抑制人體骨髓造血功能而引起再生障礙性貧血癥和粒狀白細(xì)胞缺乏癥等疾病[2]，因此動物性食品中的氯霉素殘留對人類的健康構(gòu)成了潛在的危害。美國僅允許氯霉素用于非食用動物,規(guī)定在動物性食品中不得檢出氯霉素，歐盟（EEC）規(guī)定在雞蛋和乳牛中禁止使用氯霉素，在雞肉、肝、腎中的氯霉素殘留量不得超過0.01 mg/kg[2-3]。我國由于檢測技術(shù)與國外先進檢測機構(gòu)存在一定差距，因此常常遇到出口食品氯霉素超標(biāo)問題，每年出口損失高達(dá)數(shù)10億美元[2]。因此研究一種高效、靈敏的氯霉素殘留量檢測方法勢在必行，對我國的進出口貿(mào)易以及人民的食品安全意義重大。

氯霉素殘留量的測定方法有酶聯(lián)免疫法[4]、氣相色譜法[5]、氣質(zhì)聯(lián)用法[6]、液相色譜法[7]和液質(zhì)聯(lián)用法[8-10]等多種方法。酶聯(lián)免疫法具有快速簡便的特點，但僅適用于樣品的快速篩查，在定性及定量的準(zhǔn)確度方面存在一定的局限性。氣相色譜法和氣質(zhì)聯(lián)用法均需要對氯霉素樣品進行衍生化才能進行分析，其前處理繁瑣且耗時較長。液相色譜方法的靈敏度較差，選擇性不好，容易出現(xiàn)假陽性結(jié)果。液質(zhì)聯(lián)用方法則是一種高靈敏度、高選擇性的檢測方法，特別是液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)通過多反應(yīng)監(jiān)測模式則可進一步提高檢測的靈敏度和選擇性，大大降低了檢測限和假陽性檢測結(jié)果的出現(xiàn)幾率。

本研究開發(fā)了一種超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)分析蜂蜜中的氯霉素方法，采用超高效液相色譜作為分離手段，有效地節(jié)省了分析時間和流動相的消耗量，采用串聯(lián)質(zhì)譜對氯霉素進行檢測，降低了假陽性檢測結(jié)果的出現(xiàn)機率，提高了檢測的準(zhǔn)確性和檢測靈敏度，本方法運用到實際樣品的檢測中結(jié)果令人滿意。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

氯霉素標(biāo)樣：美國Sigma公司；乙腈、甲醇、乙酸乙酯：色譜純，美國Fisher公司；18.2 MΩ超純水：賽多利斯超純水機生產(chǎn)；蜂蜜樣品：云南白塔蜂業(yè)有限公司提供。

1.2 儀器及工作條件

1.2.1 主要儀器及設(shè)備

GL-12B高速離心機：上海安亭科學(xué)儀器廠；NEVAP氮吹儀：美國Organomation公司；CPA225D電子天平：德國Sartorius公司；ACQUITY超高效液相色譜（色譜柱為 ACQUITY UPLC BEH C18 1.7μm 2.1×100 mm）：美國Waters公司；API-3200串聯(lián)質(zhì)譜儀、質(zhì)譜工作站為Analyst質(zhì)譜工作站：美國AB公司。

1.2.2 色譜條件

流動相A為水溶液，流動相B為乙腈，流動相梯度見表1，流動相流速為0.4mL/min，柱溫30℃，進樣量 5μL。

表1 氯霉素的梯度洗脫程序Table 1 Gradient of mobile phase

1.2.3 串聯(lián)質(zhì)譜條件

UPLC/MS/MS接口為電噴霧接口（ESI）負(fù)離子模式，離子監(jiān)測模式為多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM），噴霧電壓（IS）-4 000 V，噴霧氣（GS1）、輔助氣（GS2）、氣簾氣（CUR）、碰撞氣（CAD）均為高純氮氣，噴霧氣氣壓為60 psi（1 psi=6.895 kPa），輔助氣氣壓為65 psi，氣簾氣氣壓為20 psi，碰撞氣氣壓為5 psi，輔助噴霧氣溫度為600℃，去簇電壓（DP）為-32.0 V，入口電壓（EP）為-8.0 V，其他參考條件參見表2。

表2 氯霉素定性離子對、定量離子對、采集時間、碰撞能量和碰撞室出口電壓Table 2 Transitions for confirmation and quantification,time,CE,CXP

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取10 mg氯霉素標(biāo)準(zhǔn)樣品于燒杯中，用甲醇溶解定容至100mL，得到100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，稀釋100倍后得到1 000 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。用流動相（水∶乙腈=8∶2）逐級稀釋得到標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。標(biāo)準(zhǔn)溶液需避光保存在-18℃的冰箱中，標(biāo)準(zhǔn)儲備液可穩(wěn)定保存6個月，標(biāo)準(zhǔn)工作溶液可穩(wěn)定保存1個月。

1.4 樣品前處理

稱取蜂蜜樣品 5 g（精確至 0.01 g），置于 50mL 聚丙烯離心管中，加入10mL水于漩渦振蕩器上振蕩1min使蜂蜜完全溶解。準(zhǔn)確加入15mL乙酸乙酯，在振蕩器上振蕩10 min，準(zhǔn)確吸取上層乙酸乙酯10mL轉(zhuǎn)入比色管中，在氮吹儀上55℃氮吹至干，加入5mL水溶解殘渣。將上述5mL水溶液全部轉(zhuǎn)入經(jīng)5mL甲醇和5mL水活化過后的HLB固相萃取柱，以3mL/min的流速通過固相萃取柱后，用10mL水分2次清洗比色管并過柱，然后再用 5mL 乙腈+水（1∶7）淋洗 HLB 小柱，棄去全部淋洗液，在負(fù)壓下對HLB小柱減壓抽干10min，最后用5mL乙酸乙酯洗脫，收集洗脫液于10mL比色管中，于 50℃用氮吹儀吹干，用乙腈+水（2∶8）定容至1mL，經(jīng)0.22μm有機濾膜過濾后即可進樣。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的選擇

氯霉素分子式為C11H12Cl2N2O5，在電噴霧源（ESI）中易失去一個氫原子而帶負(fù)電荷，因此選擇ESI負(fù)離子模式對其進行檢測。氯霉素一級質(zhì)譜圖見圖1。

圖1 氯霉素一級質(zhì)譜圖Fig.1 The mass spectrum of chloramphenicol

其分子中含有氯元素，因此同位素準(zhǔn)分子離子峰分別為m/z320.8和m/z322.8。對320.8的準(zhǔn)分子離子進行二級質(zhì)譜掃描，發(fā)現(xiàn)其碎片主要有121.0、151.9、175.9、194.0和257.0，見圖2。本方法選取子離子151.9、175.9和257.0進行多反應(yīng)監(jiān)測（MRM），以320.8/151.9作為定量離子對，其他2個離子對作為定性離子對。經(jīng)優(yōu)化的質(zhì)譜條件參數(shù)見1.2.3。

圖2 氯霉素二級質(zhì)譜圖Fig.2 The MS2 spectrum of chloramphenicol

2.2 色譜條件優(yōu)化

試驗中比較了不同流動相對分離度、峰形、靈敏度等的影響。發(fā)現(xiàn)對于水相來說，水相的酸堿度對于氯霉素分離影響不大，對質(zhì)譜監(jiān)測也無明顯影響。而有機相用乙腈比用甲醇時的氯霉素峰形更好，而且使用乙腈作為有機流動相更有利于ESI源中溶劑去除。因此試驗中采用了水-乙腈的流動相體系。

2.3 定量回歸方程及相關(guān)系數(shù)

配制氯霉素濃度分別為 0.1、0.2、1.0、5.0、10.0、50.0 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，依次進樣后以定量離子對的峰面積為Y軸，濃度為X軸，進行線性回歸得到氯霉素的定量方程為Y=4 020X-19.1，相關(guān)系數(shù)r=0.999 8。說明采用外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法對樣品中的氯霉素進行定量具有較好的線性響應(yīng)范圍。

2.4 方法精密度、回收率及檢出限

試驗以未檢出氯霉素的蜂蜜作為空白樣品，采用空白樣品加標(biāo)進行回收率的測定，分別進行了0.1、0.5、5.0 μg/kg 3個水平的空白加標(biāo)樣品進行回收率試驗，每個水平做5次平行試驗，得到平均回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差見表3。

表3 方法精密度和回收率（n＝5）Tabble 3 The recovery and precision of method（n＝5）

以本方法進樣0.1 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液時，定量離子對的信噪比為30.7（圖3），若以信噪比（S/N）等于3時計算氯霉素檢出限為0.01 ng/mL，根據(jù)取樣量以及定容體積可計算出本方法運用于實際蜂蜜樣品時的檢出限為0.002 5 μg/kg。說明此方法回收率、精密度基本令人滿意，并且具有很高的靈敏度。

圖3 氯霉素標(biāo)樣（0.1 ng/mL）定量離子色譜圖Fig.3 The mass chromatography of chloramphenicol standard(0.1 ng/mL)

2.5 樣品檢測結(jié)果

按照本文所述方法對實際樣品進行分析，圖4為蜂蜜樣品中氯霉素的定量離子色譜圖，從圖4中可以看出，樣品中的氯霉素很好地被分離，基本無干擾峰，且分析時間很短，只需6 min即可完成一次分析。說明本方法運用到實際樣品的檢測中可以得到較好的分離分析結(jié)果。

圖4 蜂蜜樣品定量離子色譜圖Fig.4 The mass chromatography of honey sample

3 結(jié)論

本方法采用固相萃取技術(shù)對蜂蜜樣品進行前處理，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)聯(lián)用方法檢測蜂蜜的氯霉素殘留量。本方法6 min完成一個樣品分析，分析速度快。多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）技術(shù)的應(yīng)用，使方法具有了很高的選擇性和靈敏度。本方法具有準(zhǔn)確、快速、高靈敏度和高選擇性的特點，能夠適應(yīng)大規(guī)模樣品的快速分析要求。

[1]張龍.獸醫(yī)藥物化學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1999：280-282

[2]徐理奇,盧春香.動物食品中氯霉素類藥物的殘留狀況及檢測方法比較[J].飼料工業(yè)，2008,29(15):15,41-42

[3]蔣定國,楊大進.動物性食品中氯霉素殘留檢測技術(shù)的研究概況[J].中國食品衛(wèi)生雜志，2002,14(2):44-47

[4]何佳琪,段振娟,張燕,等.氯霉素殘留ELISA檢測方法[J].中國獸醫(yī)雜志，2008,44(2):88-89

[5]鐘惠英,楊佳鋒,徐開達(dá).氣相色譜法定量分析水產(chǎn)品中的氯霉素（CAP）殘留量[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2006,16(2):183-185

[6]魏林陽,徐金晶,吳紅軍.水產(chǎn)品中氯霉素殘留的氣質(zhì)聯(lián)用法檢測[J].光譜實驗室,2007,24(2):201-205

[7]何方奕,李鐵純，李學(xué)程.固相萃取—高效液相色譜法測定肌肉中氯霉素的殘留[J].食品科學(xué),2006,27(12):629-630

[8]劉艷琴,王皓,殷曉燕,等.高效液相色譜—電噴霧離子阱質(zhì)譜測定乳品中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素殘留的[J].食品科學(xué)2008,29(4):344-346

[9]周萍,胡福良,鞏珊,等.液液萃取法結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定蜂王漿中的氯霉素殘留量[J].食品科學(xué),2008,29(5):341-343

[10]李丹妮,嚴(yán)鳳,張文剛,等.超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法對奶粉中氯霉素殘留的檢測[J].分析測試學(xué)報,2008,27(11):161-163

Determination of Chloramphenicol Residues in Honey by UPLC-MS/MS

FENG Lei，ZHANG Xue-zhong，NIU Zhi-rui，ZHU Hong-kun，LI Bo
（Yunnan Institute of Product Quality Supervision and Inspection，Kunming 650223，Yunnan，China）

This thesis concerns about a new analytical approach development of chloramphenicol in honey.Solid-Phase Extraction was used as pretreatment method.After separated by Ultra Performance Liquid Chromatography with acetronitrile-water as mobile phase,than detected the Chloramphenicol residues by MS/MS in the ESI（－）-MRM mode.The pretreatment is efficient.The analytical approach has highly sensitivity and highly selective,the precision is acceptable.So,this new analytical approach has referable value.

chloramphenicol；honey；UPLC-MS/MS；analysis

云南省科技平臺項目（2009DA022）

馮雷（1979—），男（漢），工程師，碩士，研究方向：食品中農(nóng)獸藥殘留、非法添加劑的檢測。

2010-07-13