響應(yīng)面法優(yōu)化采油菌株Bacillus FH-1-2產(chǎn)脂肽發(fā)酵培養(yǎng)基

王 建 偉，孫 玉 梅，曹 芳，王 培 忠

( 大連工業(yè)大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院， 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

生物表面活性劑是微生物在一定條件下產(chǎn)生的集親水性和親油性結(jié)構(gòu)于一體的代謝產(chǎn)物[1]，它能降低油水界面張力并乳化原油，從而提高石油采收率[2]。生物表面活性劑主要包括糖脂和脂肽，脂肽是由β-氨基或β-羥基長(zhǎng)鏈脂肪酸和環(huán)肽構(gòu)成[3]。

臨界膠束濃度與脂肽含量具有線性關(guān)系[4]。利用表面張力法測(cè)定臨界膠束濃度，可以簡(jiǎn)單、快速地反映脂肽含量和表面張力值的關(guān)系。表面張力測(cè)定方法主要有表面張力法、界面張力法、血平板法、原油平板法、液滴法和傅里葉變換紅外光譜法。血平板法的缺點(diǎn)是如果血平板制作不好則不易發(fā)現(xiàn)溶血圈，直接影響到實(shí)驗(yàn)結(jié)果的觀察；原油平板法只適合能利用石油烴類物質(zhì)產(chǎn)生生物表面活性劑的微生物；液滴法需要的樣品數(shù)量過多[5]。

響應(yīng)面法是一種優(yōu)化過程的綜合技術(shù)，具有試驗(yàn)次數(shù)少、結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，是降低開發(fā)成本、優(yōu)化生產(chǎn)條件、提高產(chǎn)量的一種有效方法，已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于培養(yǎng)基優(yōu)化研究。已有人采用響應(yīng)面法利用血平板測(cè)定脂肽含量[6]。

采油菌株BacillusFH-1-2能夠產(chǎn)生脂肽類生物表面活性劑，本文通過表面張力表征菌株發(fā)酵所產(chǎn)脂肽含量，并采用響應(yīng)面分析法對(duì)其產(chǎn)脂肽培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，以期為脂肽增產(chǎn)促進(jìn)原油采收提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌 種

菌種BacillusFH-1-2，遼河油田豐華應(yīng)用技術(shù)綜合廠提供。

1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基(g/L)：NaCl 5，牛肉膏 5，蛋白胨 10，瓊脂 20，pH 7.0。

LB種子培養(yǎng)基(g/L)：NaCl 5，牛肉膏 5，蛋白胨 10，pH 7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：KH2PO43.4，Na2HPO41.5，NaNO34，MgSO4·7H2O 0.7，酵母粉0.2，液蠟25，pH 7.0[7]。

以上培養(yǎng)基均于121 ℃滅菌20 min。

1.3 菌體培養(yǎng)

菌種保存及活化：BacillusFH-1-2菌株在4 ℃保存于瓊脂斜面并每3個(gè)月轉(zhuǎn)接。取保存菌株接種于LB瓊脂斜面，30 ℃活化培養(yǎng)36 h。

種子液制備：從斜面取2環(huán)菌體接入100 mL種子培養(yǎng)基中(250 mL三角瓶)，于30 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)24 h。

發(fā)酵液制備：于100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中(250 mL三角瓶)接種5%(體積分?jǐn)?shù))種子培養(yǎng)液，30 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)48 h。移除發(fā)酵液上層油相，于3 000g離心20 min，收集上清液。

1.4 表面張力(γ)測(cè)定

采用環(huán)形表面張力儀(承德大華試驗(yàn)機(jī)有限公司)測(cè)定發(fā)酵上清液表面張力。

1.5 脂肽表面活性劑純品制備

將發(fā)酵上清液與氯仿甲醇溶液(體積比為1∶1)等體積混合，萃取3次(分液漏斗)合并有機(jī)相。取下層氯仿相離心得到表面活性劑粗品，用正己烷洗滌表面活性劑粗品除去有機(jī)酸，萃取后離心得表面活性劑純品，于60 ℃烘干[8]。

所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果均通過3次平行實(shí)驗(yàn)獲得。

2 結(jié)果與分析

2.1 脂肽濃度與表面張力的關(guān)系

測(cè)定0～900 mg/L脂肽表面活性劑純品溶液的表面張力。由圖1可知，脂肽溶液的表面張力隨脂肽濃度增大逐漸降低，當(dāng)脂肽溶液的表面張力降至34.1 mN/m后，表面張力不再隨脂肽濃度的增大而降低，基本保持不變，此時(shí)對(duì)應(yīng)的脂肽質(zhì)量濃度500 mg/L即為臨界膠束濃度。

圖1 表面張力與脂肽質(zhì)量濃度關(guān)系圖

Fig.1 The relation of surface tension and lipopeptide concentration

對(duì)0～500 mg/L脂肽溶液質(zhì)量濃度與表面張力進(jìn)行線性回歸，得線性回歸方程：y=-0.073 8x+71.257，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.996?？梢娭馁|(zhì)量濃度與表面張力有良好的線性關(guān)系，可以通過表面張力表示脂肽含量[4]。

2.2 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在文獻(xiàn)[7]的培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加入了FeSO4、MnSO4。采用N=12的Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)分析KH2PO4、Na2HPO4、NaNO3、酵母粉、MgSO4·7H2O、MnSO4、FeSO4、液體石蠟8個(gè)因素對(duì)脂肽產(chǎn)量的影響。因?yàn)椴煌M分配比的發(fā)酵液初始表面張力(γ)均不相同，本文以Δγ為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面分析[9]，Δγ=γ1-γ2(γ1為發(fā)酵初始發(fā)酵液的表面張力值，γ2為發(fā)酵48 h后發(fā)酵液的表面張力值)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表1，利用Minitab軟件對(duì)Plackett-Burman試驗(yàn)的各因素的分析結(jié)果見表2。由表2的分析結(jié)果可知FeSO4、MnSO4和酵母粉對(duì)Δγ影響顯著，MnSO4、酵母粉為正效應(yīng)，應(yīng)增加，F(xiàn)eSO4為負(fù)效應(yīng)，應(yīng)減少。FeSO4、MnSO4和酵母粉3個(gè)因素的可信度均在90%以上，因此以這3個(gè)因素作為主要影響因素進(jìn)行下一步研究。

2.3 最陡爬坡試驗(yàn)

設(shè)定FeSO4的步長(zhǎng)為0.003 g/L，MnSO4步長(zhǎng)為0.1 g/L，酵母粉的步長(zhǎng)為0.1 g/L，進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)。由表3可知，第2組的響應(yīng)值最大，因此以第2組為中心進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

2.4 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以FeSO4、MnSO4和酵母粉作為自變量，采用三因素三水平的Box-Behnken響應(yīng)面分析法對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)因素水平見表4，設(shè)計(jì)見表5，試驗(yàn)結(jié)果分析見表6。

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)(N=12)及響應(yīng)值表

表2 Plackett-Burman試驗(yàn)因素水平及其主效應(yīng)分析

表3 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表4 Box-Behnken試驗(yàn)因素水平

Tab.4 Experimental variables and levels for Box-Behnken design

因素符號(hào)水平-101FeSO4X10.0080.0110.014MnSO4X20.10.20.3酵母粉X30.10.20.3注:X1=(ρ1-0.011)/0.003,X2=(ρ2-0.2)/0.1,X3=(ρ3-0.2)/0.1 (ρx為各物質(zhì)的質(zhì)量濃度)。

表5 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表6 回歸方程系數(shù)表

將各系數(shù)帶入方程：

式中，Y為響應(yīng)值，β0為截距，βi為線性系數(shù)，βij為交互作用系數(shù)。得到回歸方程：

Y=27-0.137 5X1-0.112 5X2+0.05X3+

0.375X1X3+0.475X2X3

由表7可知，模型在α=0.01水平上回歸顯著，P=0.311>0.1，失擬不顯著，因此模型選擇正確。同時(shí)，一次項(xiàng)、平方項(xiàng)、交叉項(xiàng)均對(duì)響應(yīng)值有顯著性影響，其中復(fù)相關(guān)系數(shù)的平方R2=0.963 1，說明模型可以解釋96.31%實(shí)驗(yàn)所得脂肽產(chǎn)量的變化，表明方程擬合較好。CV(Y的變異系數(shù))表示實(shí)驗(yàn)的精確度，CV值越高，實(shí)驗(yàn)的可靠性越低，本實(shí)驗(yàn)中CV=3.609 138，較低，說明實(shí)驗(yàn)操作可信?；貧w方程為BacillusFH-1-2發(fā)酵產(chǎn)脂肽提供了一個(gè)合適的模型。

表7 回歸方程的方差分析

2.5 響應(yīng)面分析及各組分最佳質(zhì)量濃度的確定

利用回歸方程求得各組分最佳質(zhì)量濃度，并繪制分析圖，響應(yīng)面立體分析圖和相應(yīng)等高圖見圖2～4。對(duì)回歸方程求一階偏導(dǎo)數(shù)：

0.137 5-2.4X1-0.55X2-0.375X3=0

(1)

0.112 5-0.55X1-2.9X2+0.475X3=0

(2)

0.05-0.125X1+0.475X2-1.65X3=0

(3)

X1=(ρ1-0.011)/0.003，X2=(ρ2-0.2)/0.1，X3=(ρ3-0.2)/0.1,(X1,X2,X3)的編碼值分別為(-0.073 5,0.038 7,0.047)，從編碼值可知，F(xiàn)eSO4、MnSO4和酵母粉的最佳質(zhì)量濃度分別為0.011、0.204、0.205 g/L。

2.6 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

采用優(yōu)化后的培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，測(cè)定表面張力值，γ1=(66.7±0.2) mN/m，γ2=(38.4±0.2) mN/m，提取脂肽后測(cè)得質(zhì)量分別為400、411、392 mg/L，均值401 mg/L，與優(yōu)化值419 mg/L非常接近，與原培養(yǎng)基脂肽產(chǎn)量335 mg/L相比，增產(chǎn)66 mg/L，在原基礎(chǔ)上提高了19.7%。

圖2 Y=f(X1，X2)響應(yīng)面立體分析圖和相應(yīng)等高線圖

圖3 Y=f(X1，X3)響應(yīng)面立體分析圖和相應(yīng)等高線圖

圖4 Y=f(X2，X3)響應(yīng)面立體分析圖和相應(yīng)等高線圖

3 結(jié) 論

采用響應(yīng)面分析法對(duì)BacillusFH-1-2產(chǎn)脂肽發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，運(yùn)用Plackett-Burman法確定FeSO4、MnSO4和酵母粉為重要影響因素；通過最陡爬坡試驗(yàn)逼近最佳響應(yīng)面區(qū)域；采用Box-Behnken設(shè)計(jì)得出回歸方程，回歸方程方差分析顯示模型選擇正確，方程擬合良好，說明方程可以真實(shí)地反映各因素對(duì)BacillusFH-1-2產(chǎn)脂肽的影響。優(yōu)化后的培養(yǎng)基組成(g/L)為：FeSO40.011，MnSO40.204，酵母粉0.205，KH2PO43.4，Na2HPO41.5，NaNO34，MgSO4·7H2O 0.2，液體石蠟。采用優(yōu)化后的培養(yǎng)基，脂肽產(chǎn)量在原基礎(chǔ)上提高19.7%。

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