從噬菌體展示隨機肽庫中定量篩選人血清白蛋白黏附肽

張 佳 娣，邊 蕾，石 屹 峰

( 大連工業(yè)大學 生物與食品工程學院， 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

最近利用人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)為載體延長蛋白質(zhì)藥物體內(nèi)半衰期的技術(shù)已引起了人們的極大關(guān)注。HSA是人血漿中最豐富的蛋白質(zhì)(占血漿總蛋白的60%左右)，分子質(zhì)量為66～69 ku，半衰期可達到19 d。HSA的生理功能包括維持血漿的膠體滲透壓和正常pH值，是血液中重要的物質(zhì)輸送載體和藥物輸送載體，所以它成為藥物設(shè)計理想的載體蛋白，用于改善藥物的半衰期[1]，同藥物的連接有融合和黏附兩種方式。HSA黏附方法延長蛋白質(zhì)藥物半衰期的關(guān)鍵是選擇有特異性和親和力高的HSA黏附肽[2]。篩選HSA黏附肽使用噬菌體展示表面技術(shù)，此技術(shù)最大的特點就是能對較大容量的文庫進行快速篩選。自從Smith[3]于1985年首次報道運用噬菌體展示至今，噬菌體隨機肽庫作為一種技術(shù)平臺已日趨成熟，并在許多領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用[4]。本文以HSA為靶分子，利用甘氨酸-鹽酸(pH 2.2)為洗脫液對噬菌體隨機七肽庫進行生物淘選，研究同時以回收率和選擇比為優(yōu)化參數(shù)的定量淘選過程，并發(fā)展了一種基于噬菌體滴度測定的相對親和力測定方法，測定其DNA序列后推導(dǎo)出其肽序列。

1 材料與方法

1.1 噬菌體隨機肽庫和菌株

噬菌體隨機七肽庫(Ph.D.-7)和E.coliER2738 宿主菌，購自New England Biolabs公司。Ph.D.-7的復(fù)雜度為2.8×109個轉(zhuǎn)化子。E.coliER2738宿主菌：F′lacIqΔ(lacZ)M15proA+B+zzf：Tn 10 (TetR)/fhuA2supEthiΔ(lac-proAB)Δ(hsdMS-mcrB)5 (rk-m k-McrBC-)。

1.2 試劑和儀器

人血清白蛋白(Sigma A1653)、IPTG(Isopropyl β-D-thiogalactoside)和X-gal(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactopyranoside)，北京賽百盛生物工程公司；甘氨酸，天津市福晨化學試劑廠；Tris(HydroxymethylAminomethane)，國藥集團化學試劑有限公司。所用培養(yǎng)基均為LB培養(yǎng)基(胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl 5 g，溶于1 L去離子水，pH 7)。STS-2型脫色搖床，上海琪特儀器有限公司；96微孔板(聚丙烯)，海門三和新華玻璃儀器廠。

1.3 測定噬菌體滴度

接種E.coliER2738 單菌落于20 mL LB培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)至對數(shù)中期(OD600=0.5)。37 ℃預(yù)溫LB/IPTG/X-gal平板，每個噬菌體稀釋度取一個平板備用。用TBS (50 mmol/L pH 7.5 Tris buffered saline solution)對噬菌體進行10倍系列稀釋。每個稀釋度取10 μL加入到分裝有200 μL的菌體中，快速震蕩混勻，37 ℃溫育1 h后取50 μL涂于LB/IPTG/X-gal 平板上，待平板冷卻5 min后，倒置于37 ℃培養(yǎng)過夜。檢查平板，以約有100個噬菌斑左右的平板上的斑數(shù)計數(shù)，用此數(shù)目乘以稀釋因子即得到單位體積噬菌體的空斑形成單位(pfu)滴度。

1.4 噬菌體肽庫的生物淘選

用300 μL 100 μg/mL HSA和300 μL 0.1 mol/L NaHCO3(pH 8.6)分別包被于96酶聯(lián)孔板，4 ℃過夜，次日取出用0.1% TBST(Tris buffered saline with Tween-20)清洗3次。在孔中加入用TBST稀釋到滴度為2×1011的噬菌體，室溫下放在STS-2型脫色搖床上搖動1 h。用TBST清洗10次，洗去未與HSA結(jié)合的噬菌體，再加100 μL Gly-HCl，室溫搖動15 min；將洗脫液吸出立即加入15 μL pH 9.1的Tris-HCl緩沖液。洗脫液測滴度，擴增后再測滴度，用于下一輪篩選。

將擴增的噬菌體溶液除去菌體后用 PEG/NaCl 沉淀法純化。先將擴增的培養(yǎng)物移至50 mL離心管，10 000 r/min、4 ℃離心10 min；上清液轉(zhuǎn)入另一離心管中，加入1/5體積的PEG/NaCl溶液，4 ℃沉淀最少2 h，然后10 000 r/min、4 ℃離心20 min，去上清完成粗提。沉淀物溶解于4 mL TBS中；加入1/5體積的PEG/NaCl溶液，4 ℃沉淀最少1 h，再以10 000 r/min、4 ℃離心20 min，去掉上清液完成精提。沉淀物重新溶解于200 μL TBS得到洗脫噬菌體用于下一輪淘選或鑒定。

1.5 回收率及選擇比

回收率是洗脫得到的噬菌體量與投入的噬菌體量的比值，選擇比是HSA包被板與對照空白平板上洗脫噬菌體量的比值。

1.6 特異性黏附肽的鑒定

將制備好的單克隆抗體進行擴增，然后進行選擇比測定。具體操作步驟同噬菌體肽庫的淘選實驗。將HSA洗脫液和空白洗脫液分別測滴度，計算選擇比，選擇比越大說明篩選得到的噬菌體特異性越強。

1.7 利用親和力常數(shù)檢測特異性黏附肽

將離心后的噬菌體富集液稀釋成不同濃度，如原液、2倍、5倍、8倍、10倍稀釋度，作為投入噬菌體量(滴度)。經(jīng)過淘選過程，得到洗脫噬菌體量(滴度)。以噬菌體投入量和噬菌體洗脫量為參數(shù)進行雙倒數(shù)作圖，計算得到Kd。

1.8 特異性黏附肽序列的測定

取擴增好的噬菌體20 μL，加入200 μL碘化鈉緩沖液、100 μL氯仿和100 μL苯酚，12 000 r/min離心10 min。除上層苯酚/氯仿后，加入500 μL冰乙醇，室溫溫育10 min，12 000 r/min離心10 min，棄上清。用200 μL 70%的乙醇將沉淀均勻沖開，室溫倒置30 min。用1.1 mL TE溶液將沉淀懸起，即可作為噬菌體測序模板。以-96gIII測序引物5′-HOCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3′進行樣品DNA測序(中美泰和生物技術(shù)(北京)有限公司)。

2 結(jié) 果

2.1 噬菌體肽庫的淘選

為篩選HSA黏附肽，利用噬菌體隨機七肽庫共進行了4輪“吸附-洗脫-擴增”的淘選，測定了噬菌體的投入量與洗脫量，并計算了回收率與選擇比，結(jié)果如表1所示。經(jīng)過4輪淘選后，回收率得到了提高，表示與HSA黏附的噬菌體得到了一定程度的富集。選擇比從第2輪的3.6上升到第4輪的7.1，表示在第4輪洗脫下來的與人血清白蛋白黏附的噬菌體有明顯的特異性。

表1 噬菌體展示肽庫淘選人血清黏附肽的回收率和選擇比

Tab.1 The recovery yield and specificity ratio of human albumin binding peptide panning by phage display

輪次投入量/(pfu·mL-1)洗脫量/(pfu·mL-1)回收率選擇比14.40×10118.68×1051.97× 10-824.16×10114.20× 1061.00× 10-73.631.28×10111.76×1071.375× 10-67.042.20×10113.28×1071.49 × 10-67.1

2.2 親和力公式的推導(dǎo)

根據(jù)質(zhì)量作用定律，藥物與受體的相互作用，可用公式(1)表達：

(1)

式中，D代表藥物，R代表受體，DR代表藥物-受體復(fù)合物。而在本實驗中噬菌體φ代表D，HSA代表R，HSA·φ代表藥物受體復(fù)合物。噬菌體φ與HSA相互作用，如式(2)：

(2)

當反應(yīng)達到平衡時，解離常數(shù)Kd，可用式(3)表示：

Kd=c(φ)c(HSA)/c(HSA·φ)

(3)

式中，c(φ)、c(HSA)和c(HSA·φ)為相應(yīng)物質(zhì)濃度，解離常數(shù)Kd代表親和力。親和力所測定的是單獨的小肽與HSA的黏附能力，而本文所測定的是連接在噬菌體上的七肽與HSA的黏附能力，故所測定的親和力稱為相對親和力。

設(shè)HSA總濃度為游離和結(jié)合噬菌體的濃度之和c(HSA)T=c(HSA)+c(HSA·φ)，代入式(3)則

(4)

經(jīng)推導(dǎo)得

(5)

實驗中與HSA結(jié)合的噬菌體量約等于洗脫的噬菌體量，即

c(HSA·φ) ≈c(φ)e

(6)

實驗條件下投入噬菌體量遠高于洗脫噬菌體量，即

c(φ)=c(φ)T-c(φ)e≈c(φ)T

(7)

經(jīng)推導(dǎo)得

(8)

2.3 特異性黏附肽親和力常數(shù)的測定

從制備好的單克隆抗體中進行特異性黏附肽的篩選，得到4個特異性強的HSA黏附肽，分別編號為HSA-1、HSA-5、HSA-6、HSA-10，對它們進行親和力常數(shù)的測定。以HSA-1為例進行說明：將HSA-1噬菌體進行大量富集，將離心得到的富集液進行不同倍數(shù)的稀釋，利用測滴度方法分別得到噬菌體投入量。同淘選過程一樣，將噬菌體同HSA孵育，先清洗除去未結(jié)合的噬菌體，再Gly-HCl酸性洗脫掉與HSA結(jié)合的噬菌體，利用測滴度的辦法得到不同濃度噬菌體的洗脫量。用Origin7.5軟件進行線性擬合得到相對親和力。如圖1所示，隨著噬菌體投入量的不斷升高其洗脫量也在不斷升高，直線與X軸的交點即為-1/Kd。因此由線性關(guān)系可得到Kd值為7.335 μmol/L，HSA-5、HSA-6、HSA-10人血清白蛋白黏附肽的相對親和力結(jié)果見表2。

圖1 雙倒數(shù)法對人血清白蛋白黏附肽相對親和力常數(shù)的測定

Fig.1 Double reciprocal plot for relative affinity constant measurement of human serum albumin binding peptide [c(φ)eis the output phage，c(φ)Tis the total input phage.]

表2 人血清白蛋白黏附肽相對親和力和序列

Tab.2 Relative affinity constant and peptide sequence of human serum albumin binding peptide

噬菌體HSA黏附肽選擇比相對親和力/(μmol·L-1)肽序列HSA-15.60.73IKLLTLRHSA-5 7.00.42TQRKRRKHSA-64.50.81RRMSTRIHSA-1026.00.15HMSTRMR

2.4 特異性黏附肽序列的測定

對特異性比較強的HSA-1、HSA-5、HSA-6、HSA-10 HSA黏附肽進行序列的測定：分別提取DNA，以-96引物進行樣品DNA測序，得到4個陽性克隆所展示的七肽序列，結(jié)果如表2所示。所挑選出的特異性較強的4個特異性黏附肽，經(jīng)測定其相對親和力達到微摩爾水平，說明它們與HSA具有很強的結(jié)合能力。測定的4個序列和親和力不同，說明了篩選出的4個特異性HSAB(HSA-Binding)黏附肽可能黏附HSA不同部位。

3 討 論

本研究利用噬菌體表面展示技術(shù)對隨機七肽庫進行生物淘洗，以回收率和選擇比為淘選和特異性鑒定的定量標準，以判斷淘選的效率和噬菌體特異性結(jié)合的能力。回收率提高說明對靶分子黏附能力較大的肽得到富集，選擇比大于1而且逐輪提高說明黏附靶分子而不是空白對照孔板上黏附的肽得到富集，因此選擇比也是一個保證淘選成功(不可或缺)的操作參數(shù)。本文將回收率和選擇比同時作為標準進行鑒定，經(jīng)過對噬菌體隨機七肽庫的4輪生物淘選，回收率第4輪比第1輪提高了75.6倍，選擇比也從第2輪的3.6上升到第4輪的7.1，更加有力地證明了HSA特異性黏附肽良好的富集狀況。

另外，本研究以噬菌體滴度測定的方法鑒定HSA黏附肽的相對親和力[5]，由于噬菌體融合HSA黏附肽，此方法測定的親和力是HSA黏附肽相對親和力，但仍然是噬菌體展示肽有效的鑒定標準，而且簡單易操作，不使用抗體(ELISA)和更多儀器。該法得到HSA黏附肽相對親和力為0.73 μmol/L。Dennis等[6]利用表面離子共振技術(shù)測定SA21十二肽段與HSA的親和力為0.467 μmol/L，(SA21具有延長半衰期的功效，可在兔子的靜脈中長達2.3 h，) 親和力常數(shù)在同一數(shù)量級，且較為相近。

比較非共價(黏附)與共價形式與HSA進行連接，兩者都是HSA為載體的有效延長蛋白質(zhì)藥物半衰期的手段，但是HSA融合蛋白質(zhì)生物活性因融合近70 ku的HSA而損失較大，Albuferon-α生物活性降低8倍盡管半衰期延長18倍[3-4]；而與HSA 黏附肽(小肽)融合可以保持與靶蛋白的結(jié)合特性，并延長藥物半衰期，AB.Fab半衰期延長6倍且保持原生物活性，AlbudAb/IL-1ra的半衰期延長129倍[7]。由于HSA在血清中較高的濃度，即使親和力較低的HSA黏附肽融合蛋白也將會有機會結(jié)合HSA，特別是重組藥物蛋白分子質(zhì)量變化不大，可保持生物活性和組織滲透能力。黏附HSA已經(jīng)成為蛋白質(zhì)藥物長效化的一種新策略。

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