洗脫劑極性對硅膠柱分離人參皂苷C-K的影響

莊 子 瑜，肖 永 坤，富 瑤 瑤，魚 紅 閃，金 鳳 燮

( 大連工業(yè)大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院， 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

人參皂苷C-K(compound-K)在天然的人參中并不存在，是原人參二醇類皂苷(Rb1、Rb2、Rc、Rd等)在腸道內(nèi)的降解產(chǎn)物，也就是說人參皂苷C-K是原人參二醇類皂苷在人腸道內(nèi)代謝的末端產(chǎn)物[1]，其結(jié)構(gòu)如圖1。近年來諸多研究表明，人參皂苷C-K具有很好的藥理和保健功能，它對多種實體和流體腫瘤細(xì)胞具有殺傷力，同時具有抗突變[2]、抗癌[3]、抗過敏[4-5]、抗搔癢[6]、抗糖尿病[7-8]，增強(qiáng)機(jī)體免疫力等作用。

圖1 人參皂苷C-K的結(jié)構(gòu)

本實驗室進(jìn)行了酶轉(zhuǎn)化生產(chǎn)人參皂苷C-K的研究，魚紅閃等[9]發(fā)現(xiàn)了人參皂苷糖苷酶I型酶，該酶水解人參二醇類皂苷(Protopanaxadiol type ginsenoside，PPD)Rb1、Rb2、Rc和Rd的第3(碳)-O-和20(碳)-O-糖基，生成人參皂苷C-K；王亮等[10]發(fā)現(xiàn)一種新細(xì)菌，能夠?qū)⑷藚⒍碱愒碥辙D(zhuǎn)化為人參皂苷C-K。本實驗室還對大量制備人參皂苷C-K進(jìn)行了研究，鄭長龍[11]研究了硅膠柱層析法分離純化酶解物人參皂苷C-K粗品，得到了純度較高的人參皂苷C-K；李翠翠[12]以工業(yè)化生產(chǎn)為目的，利用粗品人參皂苷C-K為原料，通過大孔吸附樹脂脫色、脫脂及硅膠層析法分離純化，得到純度較高的人參皂苷C-K。上述研究中硅膠柱分離人參皂苷C-K純品得率尚不理想，因此，本論文主要研究了硅膠柱層析法分離純化人參皂苷C-K過程中洗脫劑極性對產(chǎn)品得率的影響，以便提高人參皂苷C-K純品得率。

1 材料與方法

1.1 材 料

酶轉(zhuǎn)化人參皂苷C-K及其標(biāo)準(zhǔn)品，大連生生綠谷提供；薄層層析板Silica gel 60-F254，德國Merck公司產(chǎn)品；高效液相色譜儀 2695-2996，美國Waters公司制造。

1.2 方 法

1.2.1 石油醚除雜

利用索氏提取器，采用石油醚萃取酶轉(zhuǎn)化后的人參皂苷C-K樣品，重復(fù)萃取數(shù)次，每次20 min，薄層層法檢測萃取結(jié)果。

1.2.2 硅膠柱層析分離

稱取30 g除雜后的人參皂苷C-K樣品溶于甲醇中，加入80～100目的硅膠75 g，加熱攪拌，蒸干，制成樣品膠，再取300～400目硅膠450 g作為分離膠。

用3種不同極性的洗脫劑分別洗脫，(1)V(氯仿)∶V(甲醇)=9.5∶0.5；(2)V(氯仿)∶V(甲醇)=9.0∶1.0；(3)先用V(氯仿)∶V(甲醇)=9.5∶0.5洗脫，人參皂苷C-K單點出現(xiàn)后再用V(氯仿)∶V(甲醇)=9.0∶1.0洗脫。收集流出液，每瓶250 mL，薄層層析法跟蹤檢測洗脫結(jié)果。

1.2.3 薄層層析法(TLC)

本實驗采用刻度毛細(xì)管吸取標(biāo)準(zhǔn)品及樣品，點樣于薄層層析板上。將點好樣品的薄層板放入層析缸的展開劑中，所用展開劑為V(氯仿)∶V(甲醇)∶V(水)=7∶3∶0.5，浸入展開劑的深度為距薄層板底邊0.5～1.0 cm (切勿將樣點浸入展開缸中)，密封蓋。待展開至規(guī)定距離后，取出，吹干溶劑，噴灑10%硫酸加熱顯色。

1.2.4 高效液相色譜(HPLC)檢測產(chǎn)品純度

色譜儀，美國Waters 2695儀器；檢測器，Photodiode Array Detector Waters 2996儀器；色譜柱，Hypersil ODS 2 5 μm (4.6 mm×200 mm)；工作溫度，20 ℃；柱溫，35 ℃；體積流量，1.0 mL/min；樣品進(jìn)樣量，10 μL；檢測波長，203 nm。采用乙腈-水體系梯度洗脫，洗脫條件見表1。

表1 高效液相色譜流動相梯度條件

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品除雜

為了獲得更純凈的人參皂苷C-K，借助索氏提取器除雜。稱取酶轉(zhuǎn)化后得到的人參皂苷C-K粗產(chǎn)品120 g，用240 mL石油醚萃取數(shù)次，每次萃取20 min，蒸干，得到樣品102 g，除雜率為15%。采用石油醚萃取可將雜質(zhì)基本除掉，TLC檢測如圖2。

標(biāo)，人參皂苷C-K標(biāo)準(zhǔn)品；樣，人參皂苷C-K樣品；1，萃取人參皂苷C-K樣品后的石油醚溶液；2，萃取后的人皂苷樣品；展開劑為V(氯仿)∶V(甲醇)∶V(水)=7∶3∶0.5，10%H2SO4加熱顯色

圖2 石油醚萃取人參皂苷C-K

Fig.2 Extraction ginsenoside C-K by petroleum ether on TLC

2.2 3種不同極性的洗脫劑對人參皂苷C-K分離效果的比較

2.2.1 采用V(氯仿)∶V(甲醇)=9.5∶0.5洗脫劑洗脫

稱取石油醚萃取、干燥后得到的人參皂苷C-K樣品30 g進(jìn)行硅膠柱分離，使用V(氯仿)∶V(甲醇)=9.5∶0.5作為洗脫劑，第1～13瓶為色素，第14～24瓶為色素與C-K的混合物，第25～55瓶為C-K單點，第56～92瓶為人參皂苷C-K與其他皂苷的混合物，第93～94瓶為混有人參皂苷F2的混合物，TLC檢測結(jié)果如圖3。

根據(jù)TLC檢測結(jié)果，將洗脫出來的人參皂苷分別收集、濃縮、干燥、稱重。各部分皂苷重量見表2。

標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品C-K；樣，分離前樣品；數(shù)字，瓶號；展開劑為V(氯仿)∶V (甲醇)∶V(水)=7∶3∶0.5，以10%H2SO4為顯色劑

表2 以V(氯仿)∶V(甲醇)=9.5∶0.5為洗脫劑的人參皂苷分離收集表

Tab.2 The form of ginsenosides separation collection [V(chloroform)∶V( methanol)=9.5∶0.5]

瓶號分離產(chǎn)物成分m(得到樣品)/g得率/%1～1314～2424～5556～9293～94損失色素色素+C-K C-KC-K+其他皂苷F2(含雜質(zhì))3.04.011.253.957.40.410.0013.3337.5013.1724.671.33

從表2可以觀察到：以V(氯仿)∶V(甲醇)=9.5∶0.5的洗脫劑洗脫，得到人參皂苷C-K 11.25 g，得率為37.5%，得率較高，分離效果較好，達(dá)到了分離要求。

2.2.2 采用V(氯仿)∶V(甲醇)=9.0∶1.0洗脫劑洗脫

稱取石油醚萃取后的人參皂苷C-K樣品30 g進(jìn)行硅膠柱分離，用V(氯仿)∶V(甲醇)=9.0∶1.0的洗脫液洗脫，采用TLC跟蹤檢測，第1～10瓶為色素與C-K的混合物，第11～13瓶為C-K單點，第14～60瓶為C-K與其他皂苷的混合物，第61～65瓶為含人參皂苷F2的混合物。將洗脫出來的人參皂苷分別收集、濃縮、干燥、稱重，各部分皂苷重量見表3。

表3 以V(氯仿)∶V(甲醇)=9.0∶1.0為洗脫劑的人參皂苷分離收集表

Tab.3 The form of ginsenosides separation collection [V(chloroform)∶V(methanol)=9.0∶1.0]

瓶號分離產(chǎn)物成分m(得到樣品)/g得率/%1～1011～1314～6061～65損失色素+C-K C-KC-K+其他皂苷F2(含雜質(zhì))16.653.028.151.980.2055.5010.0727.176.600.67

從表3可以看出，以V(氯仿)∶V(甲醇)=9.0∶1.0的洗脫劑洗脫，僅能得到3.02 g純品C-K，得率為10.07%，得率較低。色素及其他皂苷中含有較高的人參皂苷C-K，分離效果不好，不能達(dá)到分離要求。

2.2.3 采用V(氯仿)∶V(甲醇)=(9.5∶0.5)+[V(氯仿)∶V(甲醇)=(9.0∶1.0)]聯(lián)合作為洗脫劑洗脫

稱取石油醚萃取后的人參皂苷C-K樣品30 g進(jìn)行硅膠柱分離，先用V(氯仿)∶V(甲醇)=9.5∶0.5洗脫，C-K單點出現(xiàn)后再用V(氯仿)∶V(甲醇)=9∶1洗脫，采用TLC跟蹤檢測，第1～13瓶為色素，第14～25瓶為色素與C-K的混合物，第25～55瓶為C-K單點，第56～92瓶為C-K與其他人參皂苷的混合物，第93～95瓶為人參皂苷F2等雜質(zhì)。將洗脫出來的人參皂苷分別收集、濃縮、干燥、稱重，各部分皂苷重量見表4。

表4 以V(氯仿)∶V(甲醇)=(9.5∶0.5)+[V(氯仿)∶V(甲醇)=(9.0∶1.0)]聯(lián)合作為洗脫劑的人參皂苷分離收集表

Tab.4 The form of ginsenosides separation collectionV(chloroform)∶V(methanol)=9.0∶1.0+[V(chloroform)∶V( methanol)=9.5∶0.5]

瓶號分離產(chǎn)物成分m(得到樣品)/g得率/%1～1314～2525～5556～9293～95損失色素色素+C-KC-KC-K+其他皂苷F2(含雜質(zhì))2.894.266.4011.844.280.439.9314.221.3339.4714.171.43

從表4可以看出，人參皂苷C-K的產(chǎn)量為6.40 g，得率為21.33%。以此濃度梯度洗脫，人參皂苷C-K不能與其他皂苷很好地分離，與V(氯仿)∶V(甲醇)=9.5∶0.5作為洗脫劑相比，效果較差。

2.2.4 3種不同極性洗脫劑分離人參皂苷C-K的結(jié)果比較

由表5可見，采用V(氯仿)∶V(甲醇)=9.5∶0.5作為洗脫劑的分離效果最好，產(chǎn)率為37.5%，得到11.25 g人參皂苷C-K；采用V(氯仿)∶V(甲醇)=9.0∶1.0作為洗脫劑的分離效果最差，產(chǎn)率10.07%，僅得到3.02 g人參皂苷C-K，不能達(dá)到分離要求；采用V(氯仿)∶V(甲醇)=9.5∶0.5與V(氯仿)∶V(甲醇)=9.0∶1.0聯(lián)合作為洗脫劑的分離方法，其產(chǎn)率為21.33%，得到人參皂苷C-K 6.40 g，效果一般，因此，無論從得率，還是從得到產(chǎn)品質(zhì)量來看，V(氯仿)∶V(甲醇)=9.5∶0.5都是最優(yōu)洗脫條件，在此洗脫條件下，人參皂苷C-K分離最完全。

表5 3種不同極性洗脫劑分離人參皂苷C-K效果比較表

2.3 高效液相色譜分析人參皂苷C-K純度

為進(jìn)一步確定V(氯仿)∶V(甲醇)=9.5∶0.5的洗脫劑洗脫效果，對其分離出的人參皂苷C-K進(jìn)行高效液相色譜分析。取1 mg人參皂苷C-K溶于1 mL色譜甲醇進(jìn)行HPLC檢測，其色譜圖如圖4所示。

圖4 人參皂苷C-K HPLC圖譜

從圖4可以看出，V(氯仿)∶V(甲醇)=9.5∶0.5的洗脫劑分離效果很好，僅有微量雜峰，達(dá)到了分離要求，分離后的人參皂苷C-K純度在98%以上。

3 結(jié) 論

稀有人參皂苷C-K樣品120 g經(jīng)石油醚除去雜質(zhì)，得到102 g人參皂苷C-K粗產(chǎn)品，除雜率為15%。3種不同極性洗脫劑分別對30 g人參皂苷C-K進(jìn)行分離比較，發(fā)現(xiàn)以V(氯仿)∶V(甲醇)=9.5∶0.5作為洗脫劑，得到人參皂苷C-K 11.25 g，得率為37.5%，得率較高。以V(氯仿)∶V(甲醇)=9.0∶1.0的作為洗脫劑，僅能得到3.02 g純品人參皂苷C-K，得率為10.07%，得率較低。以V(氯仿)∶V(甲醇)=(9.5∶0.5)+[V(氯仿)∶V(甲醇)=(9.0∶1.0)]聯(lián)合作為洗脫劑，人參皂苷C-K的產(chǎn)量為6.40 g，得率為21.33%，效果一般，由此可知，根據(jù)相似相容原理，V(氯仿)∶V(甲醇)=9.5∶0.5的洗脫劑對人參皂苷C-K溶解較好，因此，分離效果較好。用V(氯仿)∶V(甲醇)=9.5∶0.5洗脫劑洗脫得到的稀有人參皂苷C-K經(jīng)高效液相色譜檢測發(fā)現(xiàn)純度可達(dá)98%以上。

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