園參根不同部位雙向電泳圖譜的比較分析

孫立偉,馬朋濤,2,麻 銳,雷秀娟,陳雪楠,祁 超

（1.北華大學生命科學中心,吉林132013;2.華中師范大學生命科學學院,武漢替換為 430079）

園參根不同部位雙向電泳圖譜的比較分析

孫立偉1,馬朋濤1,2,麻 銳1,雷秀娟1,陳雪楠1,祁 超2＊

（1.北華大學生命科學中心,吉林132013;2.華中師范大學生命科學學院,武漢替換為 430079）

通過對經(jīng)典 TCA-丙酮提取法加以優(yōu)化,結(jié)合超聲破碎技術(shù),建立了園參蘆頭、主根、須根、表皮等4個不同部位的雙向電泳圖譜,采用Image Master 2D Platinum 6.0對其進行比較分析,發(fā)現(xiàn)了人參不同部位13個相同的蛋白點,并在主根中發(fā)現(xiàn)了2個特異點,在蘆頭和表皮中發(fā)現(xiàn)了1個特異點,在須根中發(fā)現(xiàn)了1組特異點群（3個點）.另外,還發(fā)現(xiàn)了2個蛋白出現(xiàn)明顯表達差異的區(qū)域,從而為建立在蛋白分子水平上人參內(nèi)在質(zhì)量評價和鑒定方法提供依據(jù),豐富了其內(nèi)在質(zhì)量評價標準體系.

人參不同部位;雙向電泳;質(zhì)量標準評價

人參 （Panax ginsengC.A.Meyer）是一種傳統(tǒng)名貴中藥,主要以根部入藥,其藥理學活性成分以人參皂苷為主,具有抗衰老,抗輻射,抗乳癌（雌激素活性）,促進血管生成,治療心腦血管疾病等作用[1-6].據(jù)神農(nóng)本草經(jīng)和現(xiàn)代人參研究表明,人參根部各部分藥效成分和含量不盡相同,具有不同的藥理學效用[7-9].目前我國市場上出售的主要是種植人參,也稱園參,其質(zhì)量標準的評價主要以外觀和人參皂苷含量為主[10-13].但僅以這些指標對其進行科學的質(zhì)量評價還不夠完善,尤其對這些具有同一基因型個體的不同部位還很難進行有效質(zhì)量評價.所以制定一個科學、有效的人參質(zhì)量標準評價體系十分必要.

蛋白質(zhì)作為植物體內(nèi)基因表達的最終產(chǎn)物能夠在蛋白分子水平真實反應(yīng)生物體內(nèi)基因表達的變化.近年來隨著植物蛋白質(zhì)組學的迅速發(fā)展和植物基因組數(shù)據(jù)庫的不斷完善,利用蛋白質(zhì)組學技術(shù)對植物體不同部位的基因動態(tài)表達情況進行研究,對于探尋不同部位科學有效的質(zhì)量評價方法是十分必要的[14-16].

2002 年John等[9]首次利用雙向電泳（2-DE）技術(shù)對高麗參不同部位和美國產(chǎn)西洋參主根蛋白表達圖譜進行了比較研究.研究表明利用各2-DE圖譜模式的不同,可以鑒別高麗參不同部位和美國產(chǎn)西洋參主根.這也為中國園參不同部位的鑒別和質(zhì)量標準制定提供了參考和可行性.但由于當時提取方法和質(zhì)譜靈敏度的限制,其得到的2-DE圖譜僅有較少的蛋白點,并且只針對其中6個相同點進行了質(zhì)譜鑒定和分析,遠遠達不到對園參不同部位蛋白表達差異研究的需求.為此,針對中國園參富含多糖、多酚、皂苷、核酸等干擾物質(zhì)的特點[17],優(yōu)化了其蛋白提取方法,得到了園參不同部位的2-DE圖譜,并對其進行了系統(tǒng)的比較分析,為園參根不同部位的鑒別提供了科學有效的理論依據(jù),并為其內(nèi)在質(zhì)量評價標準體系的完善奠定了蛋白分子水平基礎(chǔ).

1 實驗材料和方法

1.1 實驗材料

新鮮5年生園參樣品產(chǎn)自吉林撫松地區(qū).參考John等[9]的分部位方法,將樣品分為須根、蘆頭、主根、表皮4部位.各部位樣品用去離子水洗凈晾干后,加入液氮研磨,待成粉末后,放于-80℃冰箱凍存待用.

1.2 主要試劑

Acr、Bis、Glycine、SDS、Tris、TEMED、Urea、Glycerol、β-Mercaptoethanol、SB3-10、TCEP 均購自美國 Amresco公司;AP、Thiourea、CHAPS、PMSF、CBB R-250、CBB G-250、Bromophenol blue購自美國 Sigma公司;Protein inhibitors、Agar-ose、Marker購自美國 Promega公司;DTT、IAA購自德國 Merck公司;BSA購自日本 TaKaRa公司.

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品蛋白提取 稱取分部位樣品粉末各0.25 g,分別加入7倍體積（w/v）-20℃預(yù)冷丙酮（含體積分數(shù)為10%的TCA和體積分數(shù)為0.07%β-巰基乙醇）,旋渦混勻后于 -20℃放置 2 h,15 000 r/min、4℃條件下離心15 min棄上清,取沉淀,沉淀用預(yù)冷丙酮清洗至少3次,-20℃放置待沉淀中丙酮完全揮發(fā)后,加入4倍體積裂解液（7 mol Urea,2 mol Thiourea,2%CHAPS,2%SB3-10,1%PMSF,1%蛋白酶抑制劑）,旋渦混勻,100 W超聲40 min后,15 000 r/min、4℃條件下離心15 min,收集蛋白上清液.

1.3.2 蛋白含量測定 本實驗以BSA為標準物,參照Bradford法[18]稍做改進,進行蛋白質(zhì)含量測定.

1.3.3 2-DE 取適量蛋白上清液（250μg）,加入樣品再水化液（5 mol Urea,2 mol Thiourea,2%CHAPS,2%SB3-10,0.65%3-10IPG buffer,0.35%4-7 IPG buffer）至終體積125μL后,加入到IPG膠條槽,進行樣品再水化和等電聚焦（IEF）.IPG膠條規(guī)格為7 cm p H 3～10 L（GE Healthcare）,等電聚焦選用Ettan IPGPhorII（Amersham Biosciences）等電聚焦儀,聚焦程序設(shè)置如下:step 1:Step 30 V 11 h;step 2:Step 100 V 1 h;step 3:Grad 500 V 1 h;step 4:Grad 1 000 V 2 h;step 5:Grad 5 000 V 4 000 Vhr;step 6:Step 5 000 V 6 000 Vhr;二向 SDS-PAGE,選用 Hofer Mini-VE（Amersham Biosciences）電泳槽,12.5%分離膠（10×11×0.1）,5 mA/gel,轉(zhuǎn)移 15 min,10 mA/gel分離3 h后,考馬斯亮藍R-250染色.

1.3.4 圖像掃描及對比分析 使用 Image scanner掃描儀進行圖像掃描.掃描儀參數(shù)設(shè)置為256階灰度、600 dpi分辨率,圖像保存為 TIFF格式.掃描后的圖像用Image Master 2D Platinum Software Version 6.0進行處理、分析,包括蛋白點的檢測、匹配、數(shù)據(jù)分析和輸出等,找出各部位的差異點,并對其進行初步分析.

2 結(jié)果與討論

2.1 園參蛋白提取方法的優(yōu)化

蛋白提取的質(zhì)量是2-DE成功分離蛋白的前提和關(guān)鍵.作為一種具有廣泛藥理學活性的中藥,園參根富含皂苷、多糖、揮發(fā)油等多種次生代謝物質(zhì),同時作為一種植物儲存器官,其根細胞又含有較厚的細胞壁和大量的淀粉、多酚、核酸、色素等化學成分[17].多種次生代謝物質(zhì)和化學成分的存在使得很難利用常規(guī)的蛋白提取方法制備出高純度的樣品總蛋白,嚴重影響了2-DE圖譜的質(zhì)量[19-21].為此,本實驗結(jié)合上述園參的特性,對常規(guī)的 TCA/丙酮沉淀法進行了大量的條件摸索與優(yōu)化（結(jié)果未顯示）,比較了不同的細胞破碎方法和裂解液配方之間的組合效果,最終確定了采用超聲方法細胞破碎和優(yōu)化的TCA/丙酮沉淀法相結(jié)合的蛋白提取方法.超聲波是一種強有力的物理波,它產(chǎn)生的剪切力在將細胞壁徹底破碎的同時也能將核酸、多糖等大分子干擾物質(zhì)剪切成小片段,優(yōu)化的 TCA/丙酮沉淀法則具有進一步除糖、有效降低次生代謝物質(zhì)干擾和減少蛋白降解的優(yōu)點,因此,兩者結(jié)合能使樣品除雜更徹底,雙向電泳效果更好.

2.2 園參不同部位蛋白提取量的分析比較

本實驗采用Bradford法對提取得到的園參根不同部位蛋白進行濃度測定,隨后對其蛋白提取量進行了比較分析,結(jié)果見表1.表1表明,4部位中須根蛋白提取量明顯高于其他3部位,達到27.0±0.11 mg/g鮮重,蘆頭（14.7±0.09 mg/g鮮重）和表皮（12.8±0.12 mg/g鮮重）次之,主根（10.6±0.08 mg/g鮮重）最低,僅為蘆頭蛋白提取量的39.3%.所以,僅從蛋白提取量方面也能看出4部位存在著明顯的區(qū)別,提示4部位之間藥理學成分合成量與成分之間的區(qū)別,可做為4部位質(zhì)量標準鑒定與評價的潛在指標.

表1 園參不同部位蛋白提取量Tab.1 Protein yield of different parts of ginseng

2.3 園參不同部位蛋白SDS-PAGE圖譜的分析比較

SDS-PA GE電泳圖譜如圖1所示,可以看出,4部位SDS-PAGE圖譜中均存在3條較高豐度的帶,其灰度占總條帶灰度的95%以上,這將對后續(xù)的2-DE圖譜的獲得帶來很大困難,造成高豐度蛋白區(qū)域?qū)Φ拓S度蛋白的掩蓋,以及低豐度蛋白由于過低豐度造成蛋白點在低豐區(qū)域無法顯現(xiàn),為此我們摸索了不同細胞破碎方法和裂解液配方的有效組合,確定了最佳的適合低豐度蛋白提取的方法（結(jié)果未顯現(xiàn)）.比較4部位 SDS-PAGE圖譜可以看出,在20 100～31 000區(qū)域,蘆頭與其他3部位存在2條豐度明顯不同的條帶,在66 200附近存在1條豐度明顯低于其他3部位的條帶,且在31 000～66 200區(qū)域之間的低豐度蛋白條帶數(shù)目明顯多于其他3部位.表皮的66 200以上區(qū)域條帶明顯少于蘆頭和須根,但多于主根,且在31 000～66 200低豐度蛋白區(qū)域條帶的豐度要稍高于其他3部位.須根在20 100～31 000區(qū)域只存在2條高豐度蛋白,且豐度明顯高于蘆頭,稍高于表皮,并且在2條高豐度度條帶下方較其他3部位明顯少1條豐度明顯的條帶.而主根在66 200以上區(qū)域與其他3部位相比出現(xiàn)明顯條帶空白.通過以上比較分析說明,園不同部位僅從SDS-PAGE圖譜看就存在較大區(qū)別,說明其蛋白組成有著較大的差異,可能會對藥效成分的合成產(chǎn)生影響,可做為其質(zhì)量標準評價與鑒定的參考.

圖1 園參不同部位的SDS-PAGE圖譜Fig.1 SDS-PAGE pattern of different parts of ginseng root

2.4 園參不同部位2-DE圖譜的比較分析

圖2所示為經(jīng)過3次重復(fù)實驗所得的園參根不同部位蛋白2-DE圖譜.據(jù)軟件分析可知,園參主根蛋白點約有90%涵蓋于須根蛋白點之中.文獻報導稱人參須根比主根功效好,是因為參須含人參皂甙的量是主根的3倍多[22].而實驗結(jié)果也證明,園參主根中的蛋白點也遠少于須根,僅有須根蛋白點的三分之二.因此,園參須根比主根功效好,是否不僅與人參皂甙含量有關(guān),還與人參蛋白有關(guān);或者由于所含的園參蛋白不同導致其皂苷含量不同,需要進一步實驗證明;而園參表皮也有90%以上的蛋白點涵蓋于須根蛋白點之中,這可能是由于細長的參須肉少皮多,表皮的面積占了多數(shù)所致.據(jù)《本草便讀》記載,人參,須則橫行支絡(luò),補而下行;蘆堪嘔吐虛痰,苦能上達.而現(xiàn)在臨床實驗表明人參蘆頭并沒有嘔吐之副作用,實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),園參蘆頭和須根在蛋白組成上僅有一些差別（如圖3和圖4所示,且在蘆頭蛋白圖譜中發(fā)現(xiàn)了一個特殊的點 RH,其分子量在25 000～20 000之間,pI偏堿性,至于這些差異點是否與蘆頭嘔吐功效相關(guān),還需進行質(zhì)譜鑒定.另外,文獻已報導高麗參每個部位及西洋參的主根中都存在P1-P6 6個點,且這些點可以被很好地分離.其pI大約在5.1～6.1,分子量在21 000～40 000之間[9].在園參的每個部位也同樣發(fā)現(xiàn)了這6個點.高麗參每個部位及西洋參的主根中也存在C1-C3 3個點,其pI大約在4.28～4.44,分子量約為18 000.園參中在這3個共同點的位置上發(fā)現(xiàn)了蛋白點團,園參不同部位還發(fā)現(xiàn)了一些共同的蛋白點和蛋白團,分子量在15 000～25 000之間,已標出13個點,如圖中白色粗線圓圈所示.另外,在主根圖譜中發(fā)現(xiàn)了2個特異點MR1和MR2,它們的分子量在25 000～20 000之間,pI偏酸性,大約為3.0.蘆頭圖譜中發(fā)現(xiàn)了1個特異點 RH,其分子量在25 000～20 000之間,pI偏堿性,大約為8.0.表皮中發(fā)現(xiàn)了1個特異點RS,其分子量大小約為14 400,pI偏酸性,大約為5.5.在須根中發(fā)現(xiàn)了1個特異點群 RXG（包括豐度明顯的1個點和豐度偏小的2個點）,35 000左右,pI偏堿性,大約為8.5.以上這些蛋白點的異同可對不同參種和園參不同部位的質(zhì)量評價和鑒定提供參考.

圖2 園參不同部位的2-DE圖譜Fig.2 The 2-DE patterns of different parts of ginseng root

對比4部位2-DE圖譜,在一些區(qū)域還發(fā)現(xiàn)了明顯的蛋白表達發(fā)生變化的區(qū)域,列舉如圖3和圖4所示:圖3為分子量在97 400～66 200,等電點在4.5～5.5的一段蛋白區(qū)域,園參各部位在此處的蛋白點模式和蛋白濃度各不相同（箭頭處標示）.須根和蘆頭在此處各有兩個明顯的點,但須根點的濃度遠遠高于蘆頭.表皮和主根在此處各有一個明顯的點,但兩者的蛋白濃度也存在很大差別.圖4所示為園參各部位蛋白在偏堿性區(qū)域的明顯不同,它們?yōu)榉肿恿吭?6 200～20 100之間的一組蛋白.以上區(qū)域蛋白表達豐度的變化可進一步說明園參4部位在蛋白表達譜上存在明顯差異,可能會對藥效成分的合成產(chǎn)生影響,造成4部位藥效的差異,可做為園參不同部位質(zhì)量評價和鑒定的標準.

圖3 不同部位人參蛋白蛋白表達差異點（區(qū)域Ⅰ）Fig.3 Different protein sports of the ginseng different parts（RegionⅠ）

圖4 園參不同部位蛋白蛋白表達差異點（區(qū)域Ⅱ）Fig.4 Different protein sports of the ginseng different parts（RegionⅡ）

3 結(jié)論

本實驗通過對園參不同部位蛋白提取量、SDS-PAGE和2-DE圖譜的比較,發(fā)現(xiàn)了園參主根、須根、表皮和蘆頭之間的共性及差異,可以為園參內(nèi)在質(zhì)量評價標準的制定提供一定的實驗基礎(chǔ)和理論指導,為各部位的鑒定提供方法指導,也將為其它中藥質(zhì)量評價的研究提供新思路.同時,后續(xù)的質(zhì)譜鑒定工作也在進行中,可為園參藥用機制的探討打下基礎(chǔ),推進我國人參產(chǎn)業(yè)的全面發(fā)展.

[1]Leung K W,Yung K K,Mak N K.Angiomodulatory and neurological effects of ginsenosides[J].Curr Med Chem.2007,14（12）:1371-1380.

[2]Wang Y Z,Chen J,Chu S F,et al.Improvement of memory in mice and increase of hippocampal excitability in rats by ginsenoside Rg1’s metabolites ginsenoside Rh1 and protopanaxatriol[J].J Pharmacol Sci.,2009,109（4）:504-510.

[3]Cai B X,Jin S L,Luo D,et al.Ginsenoside Rb1 suppresses ultraviolet radiation-induced apoptosis by inducing DNA repair[J].Biol Pharm Bull,2009,32（5）:837-841.

[4]Lau W S,Chan R Y,Guo D A,et al.Ginsenoside Rg1 exerts estrogen-like activities via ligand-independent activation of ERalpha pathway[J].Journal of Steroid Biochemistry&Molecular Biology,2008,108（1-2）:64-71.

[5]Jin J,Shahi S,Kang H K,et al.Metabolites of ginsenosides as novel BCRP inhibitors[J].Biochemical and Biophysical Research Communicat-ions,2006,345（4）:1308-1314.

[6]Cai B X,Li X Y,Chen J H,et al.Ginsenoside-Rd,a new voltage-independent Ca2+entry blocker,reverses basilar hypertrophic remodeling in stroke-prone renovascular hypertensive rats[J].European Journal of Pharmacology,2009,606（1-3）:142-149.

[7]江蘇中醫(yī)學院.中藥大辭典[M].上海:上?？茖W技術(shù)出版社,1986:2232.

[8]李紅艷,趙 雨,楊士慧,等.人參不同部位超氧化物歧化酶活力比較[J].時珍國醫(yī)國藥,2010,21（3）:513-514.

[9]John Hon-Kei Lum,Ka-Lee Fung,Pik-Yuen Cheung,et al.Proteome of Oriental ginseng Panax ginseng C.A.Meyer and the potential to use it as an identification tool[J].Proteomics,2002,2:1123-1130.

[10]張崇禧,鄭友蘭,李向高,等.規(guī)范化栽培的吉林人參質(zhì)量評價研究[J].吉林農(nóng)業(yè)大學學報,2003,25（4）:404-406.

[11]潘堅揚,程翼宇,王毅,等.9種人參皂苷同時測定方法及在人參質(zhì)量鑒別中的應(yīng)用[J].分析化學,2005,33（5）:1565-1568.

[12]徐 晶,竇德強.人參的質(zhì)量標準研究[J].中國現(xiàn)代中藥,2008,10（3）:21-24.

[13]鄭友蘭,張崇禧,李向高,等.吉林人參的質(zhì)量評價指標與方法[J].人參研究,2001,13（2）:12-14.

[14]Gygi S P,Corthals GL,Zhang Y,et al.Evaluation of twodimensionalgelelectrophoresis-based proteome analysis technology[J].Proc Natl Acad Sci USA,2000,97（17）:9390-9395.

[15]Silke Oeljeklaus,Helmut E.Meyer,Bettina Warscheid.Advancements in plant proteomics using quantitative mass spectrometry[J].Journal of Proteomics,2009,72（3）:545-554.

[16]Celis J E,Ostergaard M,Jensen N A,et al.Human and mouse proteomic databases:novel resources in the protein universe[J],Febs Lett,1998,430（1-2）:64-72.

[17]張崇喜.人參、西洋參和三七化學成分的研究[D].中國博士論文庫:吉林農(nóng)業(yè)大學,2004.

[18]Bradford M.A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J].Anal Biochem,1996,72:248-254.

[19]Saravanan R S,Rose J K.A critical evaluation of sample extraction techniques for enhanced proteomic analysis of recalcitrant plant tissues[J].Proteomics,2004,4（9）:2522-2532.

[20]Tsugita A,Kamo M.2-D electrophoresis of plant proteins[J].Methods Mol Biol,1999,112:95-97.

[21]Rabilloud T.Solubilization of proteins for electrophoretic analyses[J].Electrophoresis,1996,17（5）:813-829.

[22]胡獻國.為什么參須比參主根功效好[J].中國食品,1992（2）:48.

Abstract:This research aimed at establishing the 2-DE maps of ginseng rhizome,main root,lateral root and skin respectively,and comparing the differentially expressed proteins of different parts of ginseng.By the optimized TCA/acetone extraction method and the ultrasonication technology,four parts 2-DE maps of ginseng were obtained,and 13 spots were found in all parts of ginseng.Meanwhile,two special spots were found only in the main root,and one special spot in the rhizome,one special spot in the skin and one special spot group（three spots）respectively.In addition,two areas of differentially expressed proteins were also found in the 2-DE maps.These all provide the theoretical basis for the establishment of internal quality evaluation and identification for ginseng at the protein level,which could enrich the quality evaluation standard system.

Key words:different parts of ginseng;Two-dimensional gel electrophoresis（2-DE）;quality evaluation standards

Two-dimensional electrophoresis analysis for different parts of Panax ginsengC.A.Meyer root

SUN Liwei1,MA Pengtao1,2,MA Rui2,L EI Xiujuan2,CHEN Xuenan1,QI Chao2
（1.Life Science Research Center,Beihua University,Jilin 132031;2.College of Life Science,Huazhong Normal University,Wuhan 430070）

Q946

A

1000-1190（2010）04-0639-05

2010-06-10.

國家科技支撐項目（2007BAI38B02）;吉林市科技發(fā)展計劃（200813）.

＊E-mail:qichao@mail.ccnu.edu.cn.