細胞因子在腹腔灌洗治療重癥急性胰腺炎相關(guān)性急性肺損傷中的作用

赫 曼，柴 琛，曹 農(nóng)，劉永永，王斌生，俞永江

（1.甘肅省人民醫(yī)院麻醉科，甘肅 蘭州 730000；2.蘭州大學(xué)第一醫(yī)院普外科，甘肅 蘭州 730000；3.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院普外科，甘肅 蘭州 730000）

細胞因子在腹腔灌洗治療重癥急性胰腺炎相關(guān)性急性肺損傷中的作用

赫 曼1，柴 琛2，曹 農(nóng)2，劉永永3，王斌生2，俞永江2

（1.甘肅省人民醫(yī)院麻醉科，甘肅 蘭州 730000；2.蘭州大學(xué)第一醫(yī)院普外科，甘肅 蘭州 730000；3.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院普外科，甘肅 蘭州 730000）

目的 探討細胞因子在腹腔灌洗治療重癥急性胰腺炎相關(guān)性急性肺損傷中的作用。方法 成年Wistar大鼠60只，隨機分為4組：（1）陰性對照組（C組）：開腹后僅翻動胰腺組織；（2）重癥急性胰腺炎組（S組）：3.5%牛磺膽酸鈉胰膽管逆行注射制造重癥急性胰腺炎（SAP）模型；（3）腹腔灌洗組（W組）：復(fù)制重癥急性胰腺炎（SAP）模型成功后于胰腺被膜外放置灌洗管，于下腹部留置引流管，生理鹽水行腹腔持續(xù)灌洗；（4）腹腔注射組（E組）：取S組大鼠的胰腺勻漿及腹水，于正常大鼠腹腔內(nèi)注射。于造模后3 h、6 h、12 h分批處死大鼠，取肺組織檢測細胞因子NF-κB、TNF-α、IL-1β；對胰腺及肺組織進行病理評分。結(jié)果 S組及E組肺泡間質(zhì)水腫、出血，并有中性粒細胞、巨噬細胞浸潤。在不同時相，S組、W組和E組NF-κB、TNF-α、IL-1β均高于C組（P＜0.01），W組升高的幅度小于S組（P＜0.05）。結(jié)論 重癥急性胰腺炎相關(guān)性腹水可以導(dǎo)致急性肺損傷，肺組織中NF-κB、TNF-α、IL-1β表達增加，提示這些因子參與急性肺損傷的發(fā)生過程，原因可能與相關(guān)性腹水激活單核-巨噬細胞有關(guān)。早期腹腔灌洗將SAP相關(guān)性腹水進行稀釋并引出體外，減少單核-巨噬細胞的活化，下調(diào)NF-κB、TNF-α、IL-1β，減輕肺損傷的程度，具有較好的治療作用。

細胞因子；重癥急性胰腺炎相關(guān)性腹水；急性肺損傷；腹腔灌洗

重癥急性胰腺炎（SAP）相關(guān)性急性肺損傷是患者早期死亡的主要原因。在發(fā)病過程中，多種細胞因子活化后形成瀑布樣反應(yīng)造成組織和器官的損傷。腹腔灌洗治療在臨床上常能取得較好療效[1]，但其分子生物學(xué)機制并不清楚。本文就腹腔灌洗治療重癥急性胰腺炎相關(guān)性急性肺損傷過程中細胞因子的作用機制進行探討。

1 材料

1.1 實驗動物及分組

成年Wistar大鼠60只，體重250～300克，清潔級，將其隨機分為陰性對照組、重癥急性胰腺炎組、腹腔灌洗組、腹腔注射組，每組15只，雌雄不限。

1.2 主要實驗試劑與儀器

?；悄懰徕c（美國Sigma公司生產(chǎn)），髓過氧化物酶試劑盒（南京建成生物工程公司生產(chǎn)），全自動PCR儀（上海復(fù)生生物工程研究所有限公司生產(chǎn)），Olympus BX-4顯微照相系統(tǒng)（日本Olympus公司生產(chǎn)），TNF-α試劑盒（武漢博士德公司生產(chǎn)），IL-1β試劑盒（武漢博士德公司生產(chǎn)），NF-κB引物（上海生工生物工程有限公司生產(chǎn)），RT-PCR試劑盒（上海生工生物工程有限公司生產(chǎn)）。

2 方法

2.1 模型復(fù)制

2.1.1 陰性對照組（C組）開腹后僅翻動胰腺組織。

2.1.2 重癥急性胰腺炎組（S組） 3.5%?；悄懰徕c胰膽管逆行注射制造重癥急性胰腺炎（SAP）模型。

2.1.3 腹腔灌洗組（W組） 復(fù)制SAP模型成功后于胰腺被膜外放置灌洗管，于下腹部留置引流管，以生理鹽水行腹腔持續(xù)灌洗。

2.1.4 腹腔注射組（E組）取SAP模型大鼠的胰腺組織勻漿及腹水，于正常大鼠腹腔內(nèi)注射。

2.2 標本采集

于造模后3 h、6 h、12 h分批處死大鼠，取肺組織1 g，放入凍存管置液氮中冷凍后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存，待RT-PCR檢測。另取部分胰腺和肺組織以4%甲醛固定后行鏡下評分，并行肺組織腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）免疫組化檢測。

2.3 RT-PCR檢測肺組織核因子-κB（NF-κB）mRNA的表達

引物序列如下[2]：NF-κBp65上游引物：5′-ACGATCTGTTTCC－CCTCATC-3′，下游引物：5′-TGCTTCTCTCCCCAGGAATA-3′（221 bp）；內(nèi)參照β-actin上游引物：5′-CTGTGCCCATCTATGAGGGT-3′，下游引物：5′-CAGTGAGGCCAGGATAGAGC-3′（526 bp）。RT-PCR反應(yīng)體系：反轉(zhuǎn)錄 37℃ 30 min，預(yù)變性94℃ 2 min，變性94℃15 min，退火55℃30 min，延伸72℃ 30 min，共35個循環(huán)。將PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳。

2.4 TNF-α、IL-1β的檢測

采用免疫組化SP法檢測TNF-α、IL-1β，按試劑盒說明進行。工作濃度為1∶200，以PBS緩沖液代替一抗作為對照。凡胞漿、胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒的細胞定為陽性細胞，綜合陽性表達強度及細胞數(shù)（陽性率）評價陽性結(jié)果。高倍視野下隨機選取10個視野，用BI-2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)分析其灰度值以表示陽性強度。

2.5 統(tǒng)計學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 各組動物死亡率和造模成功率比較

C組大鼠無死亡；S組死亡1例（6.7%），按Schmidt評分標準[2]，SAP13例（86.7%），發(fā)生肺損傷12例[3]（80.0%）；W組死亡1例（6.7%），SAP12例（80.0%），發(fā)生肺損傷11例（73.3%）；E組大鼠無死亡，SAP 5例（33.3%），發(fā)生肺損傷11例（73.3%）。S組大鼠胰腺在鏡下表現(xiàn)為間質(zhì)水腫、炎性細胞浸潤、組織灶性出血壞死及皂化斑形成，E組表現(xiàn)為充血、水腫，罕見出血；S組、W組及E組肺間質(zhì)水腫、出血，并有炎性細胞浸潤。

3.2 肺組織NF-κB mRNA、TNF-α和IL-1β表達變化

在不同時相，S組、E 組的肺組織 NF-κB mRNA、TNF-α 和IL-1β表達比C組均有明顯增加，S組與E組相比無明顯變化（見表1、圖1、表2、圖2、表3、圖3）。

表1 不同時相各組NF-κB mRNA的表達（±s）

表1 不同時相各組NF-κB mRNA的表達（±s）

注：與 C 組比較，*P＜0.01；與 W 組比較，△P＜0.05

?

圖1 各組肺組織NF-κB mRNA的表達情況

表2 不同時相各組TNF-α的表達情況（±s）

表2 不同時相各組TNF-α的表達情況（±s）

注：與 C 組比較，*P＜0.01；與 W 組比較，△P＜0.05

65.3±2.570.4±1.358.0±3.2201.6±3.6*△144.3±3.0*194.5±3.1*組別 3 h 6 h 12 h C組S組W組E組156.8±3.6*△102.6±1.9*147.5±2.6*184.7±2.4*△135.5±3.4*176.4±1.9*

圖2 腹腔注射組6 h肺組織TNF-α的表達情況（×200）

表3 不同時相各組IL-1β的表達情況（±s）

表3 不同時相各組IL-1β的表達情況（±s）

注：與 C 組比較，*P＜0.01；與 W 組比較，△P＜0.05

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圖3 重癥急性胰腺炎組6 h肺組織IL-1β的表達情況（×400）

4 討論

發(fā)生SAP時含有細胞因子的血性腹水經(jīng)腹膜吸收后導(dǎo)致急性肺損傷及ARDS。在SAP早期進行腹腔灌洗可以減輕器官損害，本文旨在探討細胞因子在腹腔灌洗治療SAP相關(guān)性急性肺損傷中的作用機制。

4.1 SAP相關(guān)性腹水（PAAF）誘導(dǎo)肺損傷模型的建立

PAAF經(jīng)腹膜吸收后可以誘發(fā)全身多臟器損害[4]。本研究發(fā)現(xiàn)，S組胰腺組織存在不同程度的間質(zhì)水腫、炎性細胞浸潤、胰腺組織灶性或片狀出血壞死及皂化斑形成，伴有血性腹水，呈典型的SAP病理改變[5]。由PAAF誘發(fā)的胰腺病變程度較輕，僅有部分腺體組織水腫，少量炎性細胞浸潤。大鼠腹腔注射PAAF后誘發(fā)了肺損傷，肺臟表現(xiàn)為肺間質(zhì)水腫及出血、肺泡間隔增寬，部分肺泡融合或萎縮，肺間質(zhì)中大量中性粒細胞浸潤及巨噬細胞浸潤，部分小支氣管上皮細胞脫落，可見微血栓。其病理改變與相關(guān)報道一致[6]。

4.2 重癥急性胰腺炎相關(guān)性急性肺損傷（APALI）的發(fā)生機制

已有研究表明，胰酶在SAP相關(guān)性肺損傷中起非常重要的作用[7～8]。除此以外，細胞因子被激活后形成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)致器官的進一步損害。

4.2.1 NF-κB致肺損傷的作用機制 NF-κB活化是眾多炎癥介質(zhì)作用的共同通道[9]。炎癥反應(yīng)過程中，NF-κB被激活后由胞漿進入核內(nèi)，與其靶基因上的啟動子或增強子結(jié)合，進而調(diào)控多種細胞因子和免疫介質(zhì)的表達，進一步促發(fā)炎癥反應(yīng)。

本實驗顯示，陰性對照組肺臟組織中NF-κB mRNA呈低表達；在大鼠腹腔注射SAP相關(guān)性腹水后，肺組織NF-κB mRNA的表達逐漸增強，與陰性對照組相比有顯著性差異。證實SAP相關(guān)性腹水通過腹膜吸收后激活了單核-巨噬細胞，使NF-κB活化而造成肺損傷。腹腔灌洗后，NF-κB mRNA的表達下調(diào)。近年的實驗研究也提示[10～12]，急性重癥胰腺炎時有NF-κB活化及其調(diào)控的細胞因子及趨化因子基因表達的增加。阻斷NF-κB激活通路上的某個環(huán)節(jié)有可能成為治療SAP的重要手段。除了本實驗中的腹腔灌洗外，NF-κB可以被TNF-α抗體、血小板活化因子（PAF）拮抗劑及抗中性粒細胞血清等不同程度地抑制，從而降低血清淀粉酶活性，減輕胰腺組織水腫和肺損傷的程度[13]。

4.2.2 TNF-α致肺損傷的作用機制 TNF-α是由單核-巨噬細胞、T細胞和肥大細胞等產(chǎn)生的一種細胞因子，是免疫的重要介質(zhì)。本研究發(fā)現(xiàn)：在不同時相，重癥急性胰腺炎組、腹腔注射組肺組織TNF-α的表達水平均高于陰性對照組，與其受損害程度相一致，提示TNF-α在SAP的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。同時腹腔注射組TNF-α的高表達也說明了TNF-α是SAP相關(guān)性腹水造成肺損傷的因素之一。經(jīng)過腹腔灌洗后，TNF-α的表達下降，肺損傷程度減輕。TNF-α是胰腺炎時最早升高的細胞因子，它與SAP的嚴重程度密切相關(guān)，是判斷SAP嚴重程度和預(yù)后的重要指標[14～15]。應(yīng)用可溶性TNF受體可阻斷TNF表達，顯著降低胰腺組織水腫，下調(diào)血清淀粉酶、脂肪酶水平，并能顯著降低實驗動物的死亡率[16]。TNF-α可以激活中性粒細胞等炎癥細胞使后者釋放大量介質(zhì)造成組織損傷；激活其他細胞因子如IL-1、IL-6等形成炎癥瀑布反應(yīng)，進一步加重組織損傷；增加肺血管通透性，使肺間質(zhì)水腫，促使ARDS的發(fā)生[17]。

4.2.3 IL-1β致肺損傷的作用機制 IL-1β與SAP關(guān)系密切，主要由單核-巨噬細胞產(chǎn)生。IL-1β可直接刺激胰酶的產(chǎn)生和誘發(fā)其他促炎細胞因子的產(chǎn)生，激活中性粒細胞造成多器官功能衰竭。本研究結(jié)果顯示：在正常大鼠腹腔注射SAP相關(guān)性腹水的早期，IL-1β的表達就有所升高；在不同時相，IL-1β的表達均高于陰性對照組，與肺損傷的嚴重程度相一致。腹腔灌洗后，IL-1β的表達下調(diào)。為拮抗IL-1β對器官的損害，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)給予大劑量IL-1受體拮抗劑后能明顯降低SAP實驗動物的病死率，減少中性粒細胞在肺中的積聚，減輕肺損傷的程度[18～19]。

4.3 腹腔灌洗的治療作用

SAP相關(guān)性腹水含有胰酶等大量的毒性物質(zhì)、血管活性物質(zhì)及蛋白質(zhì)分解產(chǎn)物，這些物質(zhì)通過腹膜不斷吸收后過度激活炎性細胞，使炎性細胞釋放大量的細胞因子及炎性介質(zhì)[20]，促使全身炎性反應(yīng)綜合癥的發(fā)生。因此，在早期進行持續(xù)腹腔灌洗可阻斷炎性因子經(jīng)腹膜吸收途徑，降低病死率，減少并發(fā)癥的發(fā)生[21～22]。本研究發(fā)現(xiàn)：經(jīng)過腹腔灌洗后，血清中細胞因子水平下調(diào)，減輕了肺損傷。Ranson[23]在1990年的隨機對照研究中認為長時間腹腔灌洗不僅可以減少肺部的并發(fā)癥，而且可以降低胰腺壞死組織感染的并發(fā)癥及相關(guān)的病死率。

綜上所述，重癥急性胰腺炎相關(guān)性腹水經(jīng)腹膜吸收后可以導(dǎo)致肺損傷，NF-κB、TNF-α、IL-1β表達升高提示其參與了急性肺損傷的發(fā)生過程，原因可能與重癥急性胰腺炎相關(guān)性腹水激活了單核-巨噬細胞有關(guān)。早期腹腔灌洗將重癥急性胰腺炎相關(guān)性腹水進行稀釋并引出體外，減少了腹膜單核-巨噬細胞的活化，降低了細胞因子的表達水平，減輕了肺損傷的程度，具有較好的治療作用。

[1]郭貴海，朱萱，黃群，等.腹腔灌洗治療重癥急性胰腺炎[J].實用臨床醫(yī)學(xué)，2003，4（5）：5～6.

[2]Schmidt J，Rattner DW，Lewandrowski K，et al.A better model of acute pancreatitis for evaluating therapy[J].Ann Surg，1992，215（1）：44～56.

[3]Derks CM，Jacobovitz·Derks D.Embolic pneumopathy induced by oleic acid.A systematic morphologic study[J].Am J Pathol，1977，87（1）：143～158.

[4]程若川.胰腺炎相關(guān)性腹水誘導(dǎo)大鼠肺損傷的實驗研究[J].肝膽胰外科雜志，2005，17（4）：282～285.

[5]Slavin J，Ghaneh P，Sutton R，et al.Management of necrotizing pancreatitis[J].World J Gastroenterol，2001，7（4）：476～481.

[6]聞慶平，陳海龍，關(guān)風(fēng)林，等.大鼠重癥急性胰腺炎時急性肺損傷的實驗研究[J].中華急診醫(yī)學(xué)雜志，2003，12（10）：673～676.

[7]Wilson C，Imrie CW.Changing patterns of incidence and mortality from acute pancreatitis in Scotland，1961-1985[J].Br J Surg，1990，77（7）：731～734.

[8]Sandler RS，Everhart JE，Donowitz M，et al.The burden of selected digestive diseases in the United States[J].Gastroenterology，2002，122（5）：1500～1511.

[9]鄭仲謹.核轉(zhuǎn)錄因子κB在全身炎癥反應(yīng)綜合征中的作用[J].免疫學(xué)雜志，2001，17（4）：314～318.

[10]李歡送.核因子-κB在急性胰腺炎肺損傷中作用的研究進展[J].國外醫(yī)學(xué)·外科學(xué)分冊，2004，31（1）：44～47.

[11]Hietaranta A，Mustonen H，Puolakkainen P，et al.Proinflammatory effects of pancreatic elastase are mediated through TLR4 and NF-kappaB[J].Biochem Biophys Res Commun，2004，323（1）：192～196.

[12]Jaffray C，Yang J，Carter G，et al.Pancreatic elastase activates pulmonary nuclear factor kappa B and inhibitory kappa B，mimicking pancreatitis-associated adult respiratory distress syndrome[J].Surgery，2000，128（2）：225～231.

[13]Zhou X，Xue C.Ghrelin inhibits the development of acute pancreatitis and nuclear factor kappaB activation in pancreas and liver[J].Pancreas，2009，38（7）：752～757.

[14]Norman JG，F(xiàn)ink GW，F(xiàn)ran ZMG.Acute pancreatitis induces in-trapancreatic tumor necuosis factor gene expression [J].Arch Surg，1995，130（9）：966～970.

[15]Strobel O，Wachter D，Werner J，et al.Effect of a pneumoperitoneum on systemic cytokine levels，bacterial translocation，and organ complications in a rat model of severe acute pancreatitis with infected necrosis[J].Surg Endosc，2006，20（12）：1897～1903.

[16]Kaufmann P，Tilz GP，Lueger A，et al.Elevated plasma levels of soluble tumor necrosis factor receptor （sTNFRp60）reflect severity of acute pancreatitis[J].Demel U Intensive Care Med，1997，23（8）：841～848.

[17]Kambas K，Markiewski MM，Pneumatikos IA，et al.C5a and TNF-alpha up-regulate the expression of tissue factor in intra-alveolar neutrophils of patients with the acute respiratory distress syndrome[J].J Immunol，2008，180（11）：7368～7375.

[18]Zhao X，Andersson R，Wang X，et al.Acute pancreatitis-associatedlung injury：patophysiological mechanisms and potential future therapies[J].Scand J Gastroenterol，2002，37（12）：1351～1358.

[19]張清濱，賈樹信.急性胰腺炎患者血漿TNF-α及sTNFR-P55水平變化的臨床意義[J].山東醫(yī)藥，2005，45（25）：64～65.

[20]張圣道，雷若慶.重癥急性胰腺炎的診治方案及發(fā)展趨勢[J].中華肝膽外科雜志，2004，10（4）：219.

[21]Farkas G，Marton J，Mandi Y，et al.Surgical strategy and management of infected pancreatic necrosis[J].Br J Surg，1996，83（7）：930～933.

[22]廖素清，江東，胡俊川.早期微創(chuàng)腹腔置管灌洗治療重癥急性胰腺炎 46 例分析[J].重慶醫(yī)學(xué)，2009，38（13）：1632～1633.

[23]Ranson JH，Berman RS.Long peritoneal lavage decreases pancreatic sepsis in acute pancreatitis[J].Ann Surg，1990，211（6）：708～716.

G424.31

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1671-1246（2010）14-0136-04

甘肅省科技攻關(guān)計劃項目（0709TCYA057）