金屬銅配合物的體外抗腫瘤作用構(gòu)效關(guān)系

雷潔瓊，白 巖，李文廣，張小郁，張兆翠

（1.甘肅省腫瘤醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050；2.甘肅省婦幼保健院，甘肅 蘭州 730050；3.蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；4.蘭州大學(xué)甘肅省新藥臨床前研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000；5.甘肅省人民醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000）

金屬銅配合物的體外抗腫瘤作用構(gòu)效關(guān)系

雷潔瓊1，白 巖2，李文廣3，4，張小郁3，4，張兆翠5

（1.甘肅省腫瘤醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050；2.甘肅省婦幼保健院，甘肅 蘭州 730050；3.蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；4.蘭州大學(xué)甘肅省新藥臨床前研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000；5.甘肅省人民醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000）

目的 研究金屬銅配合物的體外抗腫瘤作用并進(jìn)行構(gòu)效關(guān)系分析。方法 采用MTT比色法測定金屬銅配合物對卵巢癌細(xì)胞株3AO、食管鱗癌細(xì)胞株ECA109、肺癌細(xì)胞株GLC-82、胃癌細(xì)胞株SGC-7901細(xì)胞增殖的抑制作用。結(jié)果 Cu（Ⅱ）1，3-二羥基噸酮（Cu-DHX）和 Cu（Ⅱ）1，3，8-三羥基噸酮（Cu-THX）的配體相似，均對 3AO、ECA109、SGC-7901細(xì)胞有濃度依賴性的抑制作用，而對GLC-82細(xì)胞無明顯抑制作用。Cu（Ⅱ）1-羥基-3-丁氧基噸酮（Cu-HZX）和Cu（Ⅱ）1-羥基-3-芐基噸酮（Cu-HEX）的配體相似，前者只對ECA109細(xì)胞有一定選擇性，且敏感性和卡鉑相當(dāng)；而后者對GLC-82和SGC-7901細(xì)胞有一定選擇性，但敏感性低于卡鉑。Zn（Ⅱ）1-羥基-6-（2-（1-哌啶基）乙氧基）噸酮（Zn-HBX）只對ECA109細(xì)胞有一定選擇性，且敏感性較卡鉑低。結(jié)論 金屬離子或配體并不是決定金屬配合物對腫瘤細(xì)胞的選擇性和敏感性的主要因素，金屬配合物對腫瘤細(xì)胞的選擇性和敏感性與金屬離子和配體均有密切關(guān)系，構(gòu)效關(guān)系分析并不能有效地預(yù)測。

金屬銅配合物；抗腫瘤作用；構(gòu)效關(guān)系

藥物治療腫瘤有著悠久的歷史，是目前治療惡性腫瘤的三大方法之一。金屬配合物順式二氯二氨合鉑（簡稱順鉑）自1969年盧森堡通過實(shí)驗(yàn)確定具有抗腫瘤活性[1]，1978年被批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床治療睪丸腫瘤和卵巢癌，現(xiàn)已成為世界上治療癌癥應(yīng)用最為廣泛的3種藥物之一[2]。順鉑的成功應(yīng)用使廣大科學(xué)家對鉑類金屬配合物類抗癌劑進(jìn)行了大量研究，并取得了一系列科研成果，先后研發(fā)出卡鉑、奧沙利鉑、洛鉑等藥物，并且大約有30多種金屬鉑配合物正處于臨床實(shí)驗(yàn)階段[3]。由于順鉑類抗腫瘤藥物成功地應(yīng)用于臨床，特別是對臨床上占絕大多數(shù)、且治療效果和預(yù)后差的實(shí)體瘤，如卵巢癌、睪丸癌、肺癌、胃癌等有較好的療效，金屬配合物的抗腫瘤作用引起人們的極大興趣，成為研發(fā)抗腫瘤藥物的嶄新領(lǐng)域。

金屬銅廣泛存在于生命體系中，具有特殊的生物活性。研究發(fā)現(xiàn)，苯乙酮縮氨基硫脲與金屬銅（Ⅱ）形成二齒配合物，對小鼠移植性腫瘤S180腹水癌細(xì)胞生長有良好的抑制作用[4]。當(dāng)表阿霉素、絲裂霉素C與銅配合物聯(lián)合作用時(shí)，對HeLa-S3人宮頸癌細(xì)胞的生長有顯著的協(xié)同抑制作用[5]；銅和丙二酸衍生物的配合物與表阿霉素、順鉑聯(lián)用對人乳腺癌和宮頸癌細(xì)胞的生長也有明顯的協(xié)同抑制作用[6]。由于鉑類配合物的嚴(yán)重毒性和耐藥性，以及銅配合物的良好抗腫瘤活性，金屬銅配合物成為無機(jī)抗癌配合物的研究重點(diǎn)。為此，蘭州大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院在對卡鉑、順鉑等經(jīng)典藥物進(jìn)行研究的基礎(chǔ)上，以銅為核心合成了一系列金屬銅配合物，研究發(fā)現(xiàn)其中Cu（Ⅱ）1-羥基-3-（2-環(huán)氧基）噸酮和Cu（Ⅱ）噸酮冠醚在體外有較好的抗腫瘤活性，其中對卵巢癌3AO細(xì)胞較卡鉑有較高的選擇性和敏感性，說明金屬銅配合物對不同的腫瘤有不同的選擇性和針對性，有望研發(fā)對不同腫瘤有較高選擇性和針對性而毒性較低的新型抗腫瘤藥。為此，本實(shí)驗(yàn)對新合成的金屬配合物進(jìn)行體外抗腫瘤篩選，并進(jìn)行構(gòu)效關(guān)系分析，為研發(fā)抗腫瘤金屬配合物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑

Cu（Ⅱ）1，3-二羥基噸酮（Cu-DHX），Cu（Ⅱ）1，3，8-三羥基噸酮（Cu-THX），Zn（Ⅱ）1-羥基-6-（2-（1-哌啶基）乙氧基）噸酮（Zn-HBX），Cu（Ⅱ）1-羥基-3-丁氧基噸酮（Cu-HZX），Cu（Ⅱ）1-羥基-3-芐基噸酮（Cu-HEX）均由蘭州大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院提供；注射用卡鉑，齊魯制藥有限公司生產(chǎn)，批號：5090061DA；RPMI1640培養(yǎng)基，Gibco公司產(chǎn)品；新生小牛血清，杭州四季青生物工程有限公司生產(chǎn)；噻唑藍(lán)（MTT），F(xiàn)luka公司生產(chǎn)；胰蛋白酶，Gibco BRL公司生產(chǎn)；十二烷基硫酸鈉（SDS），Sigma公司產(chǎn)品；碘化丙啶（PI），Sigma公司產(chǎn)品。

1.2 靶細(xì)胞

卵巢癌細(xì)胞株3AO、食管鱗癌細(xì)胞株ECA109、肺癌細(xì)胞株GLC-82、胃癌細(xì)胞株SGC-7901購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞學(xué)研究所。用含體積分?jǐn)?shù)為10%的小牛血清、2mmol/L L-谷氨酰胺、1×105U/L青霉素和100mg/L鏈霉素的RPMI 1640完全培養(yǎng)液，在37°C、5%CO2及飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞均為貼壁生長，傳代時(shí)先用0.25%胰蛋白酶（Try）消化2～4min，傾棄Try，再用培養(yǎng)液將細(xì)胞吹打成單個(gè)懸浮細(xì)胞。每2～3d傳代一次，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 MTT比色法測定腫瘤細(xì)胞增殖活性

實(shí)驗(yàn)時(shí)收集對數(shù)生長期的腫瘤細(xì)胞并制成1×105/ml單細(xì)胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔90μl。實(shí)驗(yàn)組分別加入不同濃度的實(shí)驗(yàn)藥物和卡鉑10μl，對照組加入等量溶媒（終濃度0.5%DMSO），調(diào)零孔加不含細(xì)胞的完全培養(yǎng)液100μl，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。在37°C、5%CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h，培養(yǎng)結(jié)束前4h每孔加入5 g/L MTT 10μl，繼續(xù)培養(yǎng)4h后加入細(xì)胞裂解液10%SDS 100μl/well終止反應(yīng)，過夜，振蕩搖勻后，用全自動酶聯(lián)免疫檢測儀（ELx800型，美國Bio-TEK產(chǎn)品）測定各孔在570nm波長的OD值，讀取3孔OD值并求其平均值，計(jì)算細(xì)胞生長抑制率和IC50值。

細(xì)胞生長抑制率（IR）=（1-OD實(shí)驗(yàn)組/OD對照組）×100%

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Cu-DHX抑制腫瘤細(xì)胞增值作用（見表1）

由表 1 可見，3.125～50μg/ml Cu-DHX 對 3AO、ECA109、SGC-7901細(xì)胞有濃度依賴性的抑制作用，但作用較卡鉑弱，而對GLC-82細(xì)胞無明顯抑制作用。說明Cu-DHX對3AO、ECA109、SGC-7901細(xì)胞有一定選擇性，但敏感性較卡鉑低。

2.2 Cu-THX抑制腫瘤細(xì)胞增值作用（見表2）

表1 Cu-DHX 的抗腫瘤作用（±s，n=3）

表1 Cu-DHX 的抗腫瘤作用（±s，n=3）

注：與對照組比較，aP＜0.05，bP＜0.01

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表2 Cu-THX 的抗腫瘤作用（±s，n=3）

表2 Cu-THX 的抗腫瘤作用（±s，n=3）

注：與對照組比較，aP＜0.05，bP＜0.01

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由表2 可見，3.125～50μg/ml Cu-THX 對 3AO、ECA109、SGC-7901細(xì)胞有濃度依賴性的抑制作用，其中對3AO細(xì)胞的作用和卡鉑相當(dāng)，而對ECA109和SGC-7901細(xì)胞的作用較卡鉑弱，對GLC-82細(xì)胞無明顯抑制作用。說明Cu-THX對3AO、ECA109、SGC-7901細(xì)胞有一定選擇性，對3AO細(xì)胞的敏感性和卡鉑相當(dāng)，而對ECA109和SGC-7901細(xì)胞的敏感性較卡鉑低。

2.3 Zn-HBX抑制腫瘤細(xì)胞增值作用（見表3）

表3 Zn-HBX 的抗腫瘤作用（±s，n=3）

表3 Zn-HBX 的抗腫瘤作用（±s，n=3）

注：與對照組比較，aP＜0.05，bP＜0.01

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由表3可見，3.125～50μg/ml Zn-HBX對ECA109細(xì)胞有濃度依賴性的抑制作用，但作用較卡鉑弱，而對3AO、GLC-82、SGC-7901細(xì)胞無明顯抑制作用。說明Zn-HBX對ECA109細(xì)胞有一定選擇性，但敏感性較卡鉑低。

表4 Cu-HZX 的抗腫瘤作用（±s，n=3）

表4 Cu-HZX 的抗腫瘤作用（±s，n=3）

注：與對照組比較，aP＜0.05，bP＜0.01

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2.4 Cu-HZX抑制腫瘤細(xì)胞增值作用（見表4）

由表4可見，3.125～50μg/ml Cu-HZX對ECA109細(xì)胞有濃度依賴性的抑制作用，作用和卡鉑相當(dāng)，而對3AO、GLC-82、SGC-7901細(xì)胞無明顯抑制作用。說明Cu-HZX對ECA109細(xì)胞有一定選擇性，敏感性和卡鉑相當(dāng)。

2.5 Cu-HEX抑制腫瘤細(xì)胞增值作用（見表5）

由表5可見，3.125～50μg/ml Cu-HEX對GLC-82和SGC-7901細(xì)胞有濃度依賴性的抑制作用，但作用較卡鉑弱，而對3AO和ECA109細(xì)胞無明顯抑制作用。說明Cu-HEX對GLC-82和SGC-7901細(xì)胞有一定選擇性，敏感性較卡鉑低。

2.6 藥物抗腫瘤構(gòu)效關(guān)系分析

Cu-DHX和Cu-THX的配體相似，均對3AO、ECA109、SGC-7901細(xì)胞有濃度依賴性的抑制作用，而對GLC-82細(xì)胞無明顯抑制作用，其抗瘤譜和抗腫瘤活性均低于卡鉑。說明配體中的羥基數(shù)量并不影響配合物對腫瘤細(xì)胞的選擇性和敏感性。

Cu-HZX和Cu-HEX的配體相似，前者只對ECA109細(xì)胞有一定選擇性，且敏感性和卡鉑相當(dāng)；而后者對GLC-82和SGC-7901細(xì)胞有一定選擇性，但敏感性低于卡鉑。說明配體中的丁氧基或芐基可影響配合物對腫瘤細(xì)胞的選擇性和敏感性。Zn-HBX也對ECA109細(xì)胞有一定選擇性，但敏感性較卡鉑低，說明金屬離子并不是決定金屬配合物對腫瘤細(xì)胞的選擇性和敏感性的主要因素。由此可知，金屬配合物對腫瘤細(xì)胞的選擇性和敏感性與金屬離子和配體均有密切關(guān)系。

表5 Cu-HEX 的抗腫瘤作用（±s，n=3）

表5 Cu-HEX 的抗腫瘤作用（±s，n=3）

注：與對照組比較，aP＜0.05，bP＜0.01

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3 討論

對金屬配合物的研究是化學(xué)學(xué)科中發(fā)展最迅速的一個(gè)領(lǐng)域。金屬配合物的發(fā)展不僅大大促進(jìn)和深化了人們對化學(xué)結(jié)構(gòu)和化學(xué)鍵理論的認(rèn)識，也與開發(fā)新型化學(xué)反應(yīng)、研究新的合成方法、合成新型材料、開辟新能源、環(huán)境保護(hù)、探索生命現(xiàn)象的本質(zhì)和研發(fā)新型抗癌藥物關(guān)系密切。其中鉑類配合物已成功應(yīng)用于臨床，并大大影響了腫瘤的內(nèi)科治療，改變了多數(shù)實(shí)體瘤，如卵巢癌、睪丸癌以及頭頸部腫瘤等的治療策略。鉑類是目前臨床應(yīng)用最有效和最廣泛的抗腫瘤藥物之一，對大多數(shù)實(shí)體瘤有效。盡管如此，鉑類配合物對腎臟、骨髓等的毒性，尤其是細(xì)胞的耐藥性限制了其臨床應(yīng)用和療效發(fā)揮。尋找更有效的鉑類或其他金屬配合物，以克服毒性和細(xì)胞耐藥性而增強(qiáng)療效是當(dāng)務(wù)之急。研究發(fā)現(xiàn)，金屬銅配合物有良好的抗腫瘤活性，現(xiàn)已成為無機(jī)抗癌配合物的研究熱點(diǎn)。隨著人們對金屬配合物的抗癌機(jī)理以及其構(gòu)效關(guān)系的進(jìn)一步認(rèn)識，人們必將合成出更多高效低毒的金屬配合物，金屬配合物的抗癌前景將更加廣闊。

前期研究發(fā)現(xiàn)，金屬 Cu（Ⅱ）1-羥基-3-（2-（1-哌啶基）乙氧基）噸酮和銅配合物Cu（Ⅱ）噸酮冠醚對3AO、ECA109、GLC-82、SGC-7901等細(xì)胞均有抑制作用，作用和卡鉑相似或稍強(qiáng)，而Cu（Ⅱ）1-羥基-3-（2-環(huán)氧基）噸酮對ECA109細(xì)胞無明顯抑制作用。說明金屬銅配合物對不同腫瘤細(xì)胞的選擇性和敏感性不同，這與其配體有密切關(guān)系。因此，通過對金屬配合物抗腫瘤構(gòu)效關(guān)系的研究，有助于尋找最適合的配體，合成新型高效低毒的抗腫瘤金屬配合物。本實(shí)驗(yàn)對5種新合成的金屬銅配合物體外抗腫瘤研究結(jié)果顯示，Cu-DHX和Cu-THX配體相似，他們均對3AO、ECA109、SGC-7901細(xì)胞有濃度依賴性的抑制作用，而對GLC-82細(xì)胞無明顯抑制作用；Cu-HZX和Cu-HEX的配體相似，前者只對ECA109細(xì)胞有一定選擇性，且敏感性和卡鉑相當(dāng)；而后者對GLC-82和SGC-7901細(xì)胞有一定選擇性，但敏感性低于卡鉑。Zn-HBX只對ECA109細(xì)胞有一定選擇性，且敏感性較卡鉑低，而 Cu（Ⅱ）1-羥基-3-（2-（1-哌啶基）乙氧基）噸酮對 3AO、ECA109、GLC-82、SGC-7901等細(xì)胞均有抑制作用，作用和卡鉑相似或稍強(qiáng)。上述結(jié)果說明，配體相似而配合物對腫瘤細(xì)胞的選擇性和敏感性可以完全不同，金屬離子或配體并不是決定金屬配合物對腫瘤細(xì)胞的選擇性和敏感性的主要因素，金屬配合物對腫瘤細(xì)胞的選擇性和敏感性與金屬離子和配體均有密切關(guān)系。研究表明，雖然金屬配合物的抗腫瘤活性與其結(jié)構(gòu)之間存在一定的關(guān)系，但目前仍不能有效預(yù)測和設(shè)計(jì)廣譜、高效、低毒的抗癌金屬配合物，這可能因?yàn)榕浜衔锏目拱┗钚耘c其空間構(gòu)型、中心離子價(jià)態(tài)、配合物電子結(jié)構(gòu)以及配體種類有密切關(guān)系[7]?？傊?，金屬銅配合物對不同腫瘤細(xì)胞有不同的選擇性和敏感性，與金屬離子和配體均有密切關(guān)系，構(gòu)效關(guān)系分析并不能有效地預(yù)測，因此，對新的金屬配合物的抗腫瘤篩選應(yīng)以實(shí)驗(yàn)為依據(jù)，以免遺漏有價(jià)值的金屬配合物。

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R730.231

B

1671-1246（2010）13-0080-05

注：本文為甘肅省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（0710RJZA037）和蘭州大學(xué)醫(yī)學(xué)科研基金資助項(xiàng)目（LZUYX200608）