青海省綿羊弓形蟲病的ELISA診斷方法的建立及血清學(xué)調(diào)查

蔡其剛，馬利青

(青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，青海西寧810016)

龔地弓形蟲(Toxoplasma gondii)是一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生的重要機(jī)會(huì)致病性原蟲，可寄生于人和動(dòng)物的除紅細(xì)胞外的有核細(xì)胞內(nèi)，引起弓形蟲病(Toxoplasmosis)[1]。貓及貓科動(dòng)物是惟一可從糞便排出弓形蟲卵囊的動(dòng)物，貓?jiān)诠蜗x傳播給綿羊和其他動(dòng)物中起著重要作用。

P30蛋白又稱表面抗原1(SAG1)，為龔地弓形蟲速殖子期特異性蛋白，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生IgG、IgM及多種細(xì)胞因子，具有重要的抗原性[2]。Dzierszinski F等根據(jù)基因敲除試驗(yàn)認(rèn)為P30可能是決定蟲株毒力的重要因素之一[3]。為了摸清青海省綿羊中弓形蟲病的感染情況，我們運(yùn)用分子生物學(xué)方法克隆、表達(dá)、純化重組 GST-SAG1，然后以GST-SAG1作為 ELISA診斷抗原，建立了 ELISA診斷試劑盒，利用建立的 ELISA方法對(duì)采自青海省的綿羊進(jìn)行了弓形蟲病的血清學(xué)診斷，結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 抗原：GST-SAG1由日本國(guó)家原生動(dòng)物疾病研究控制中心提供，青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院獸醫(yī)研究所生物技術(shù)研究室保存。

陰、陽(yáng)性血清：均為日本國(guó)家原生動(dòng)物疾病研究中心玄學(xué)南教授惠贈(zèng)，青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院獸醫(yī)生物技術(shù)室保存。

被檢血清：2 402份被檢血清均采自青海省，以頸靜脈采集，采集后立即離心(3 000 r/min離心15 min)，血清析出后進(jìn)行收集，-20℃冷凍保存待檢。

其他試劑和耗材：均購(gòu)自國(guó)內(nèi)和Sigma公司供應(yīng)商。

1.2 重組蛋白的表達(dá)、純化 將編碼 T.gondii SAG1的基因克隆至pGEX-4T-3質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)化到E.coli，獲得 GST-SAG1融合蛋白。GST-SAG1融合蛋白再用8 mol/L的尿素緩沖液透析復(fù)性，然后用于T.gondii的 ELISA診斷中。

1.3 抗原的包被 抗原GST-SAG1和GST，分別按5 μ g/mL劑量加到包被液中(50 mmol/L Carbonate-Bicarbonate Buffer，pH 9.6)，混勻后加到96孔平底微量板(Castor)的孔里，每孔 50 μ L，并且在4℃條件下培養(yǎng)過夜。

1.4 封阻 用含有0.05%Tween-20的 1×PBS沖洗1次后，用含3%脫脂乳的封阻液(3 g脫脂奶粉+90 mL蒸餾水+10 mL 10×PBS)進(jìn)行封阻，每孔 100 μ L，并在 37℃條件下培養(yǎng) 1 h。

1.5 加樣 微量板用PBS沖洗1次，在封阻液中按1∶100滴度稀釋陰、陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)血清、被檢血清后，每個(gè)樣品平行加到微量板的兩個(gè)孔中，每孔50 μ L，并在37℃條件下培養(yǎng)1 h。

1.6 加二抗 用PBS沖洗 6次后，在封阻液中按1∶4 000滴度稀釋辣根過氧化物酶標(biāo)記兔抗羊的IgG 抗體(Bethyl Laboratories，USA)，稀釋后每孔加 50 μ L，并在 37℃條件下培養(yǎng) 1 h。

1.7 底物 用PBS沖洗6次后，每孔加 100 μ L底物(每1 mL 底物中含有 0.3 μ g ABTS，0.1 mol/L檸檬酸緩沖液pH 4.0和 0.003%H2O2)，在室溫陰暗處放置1 h后讀數(shù)。

1.8 讀數(shù) 用 Wellscan MK 3酶標(biāo)儀(Labsystems Dragon，F(xiàn)inland)在 OD415 nm條件下測(cè)定光吸收值(OD)。

1.9 判定標(biāo)準(zhǔn) ELISA滴度表示成最大稀釋度的倒數(shù)，且展示ELISA值是等于或大于0.1，在抗原GST-SAG1孔和GST孔之間的光密度吸收值是不同的，兩孔陰性血清對(duì)照孔的平均值必須低于0.1，樣品ELISA抗體滴度值等于或大于0.1為陽(yáng)性，低于0.1為陰性。

2 結(jié)果

對(duì)所收集的2 402份綿羊血清樣品應(yīng)用所建立的ELISA診斷試劑盒進(jìn)行血清學(xué)診斷，其中：土種綿羊血清 1 392份，檢出 25份陽(yáng)性，陽(yáng)性率為1.80%；改良綿羊血清786份，檢出27份陽(yáng)性，陽(yáng)性率為3.44%；小尾寒羊血清224份，檢出4份陽(yáng)性，陽(yáng)性率為1.79%。表明青海省的綿羊群中存在弓形蟲病的感染，見表1。

表1 弓形蟲ELISA診斷試劑盒的檢測(cè)結(jié)果

3 討論

3.1 本次共檢驗(yàn)2 402份綿羊血清，檢出陽(yáng)性數(shù)56份，陽(yáng)性率為2.33%。其中：土種綿羊、改良綿羊和小尾寒羊的陽(yáng)性率分別為 1.80%、3.44%和1.79%，本次調(diào)查結(jié)果表明，在青海省的綿羊群中存在弓形蟲的感染。弓形蟲的感染是否存在不同種群的易感性，有待于今后進(jìn)一步的研究。

3.2 加強(qiáng)弓形蟲病的檢疫淘汰，加強(qiáng)牧戶中貓的管理、搞好環(huán)境衛(wèi)生，力爭(zhēng)將弓形蟲病的危害降到最低程度。據(jù)報(bào)道，感染了弓形蟲的羊在人類弓形蟲病的傳播上有特殊作用[4]。因此，做好羊的弓形蟲病檢測(cè)及控制對(duì)防止人類弓形蟲病的發(fā)生有著重要的意義。

3.3 對(duì)弓形蟲病的治療藥物仍以磺胺類藥物和抗菌增效劑聯(lián)合使用療效最好。一些新的化療藥物對(duì)治療弓形蟲病具有良好的效果，但目前治療藥物的研究主要針對(duì)人弓形蟲病及小鼠弓形蟲病的模型建立，在弓形蟲病的治療方法上進(jìn)展不大，所以應(yīng)盡快評(píng)價(jià)這些藥物治療弓形蟲病的效果。

3.4 目前，國(guó)內(nèi)外專家學(xué)者已對(duì)弓形蟲病的流行、病原形態(tài)、生活史、診斷和免疫等方面做了大量研究工作，并取得了一定成績(jī)。但用于預(yù)防弓形蟲病發(fā)生的有效生物制劑尚需進(jìn)一步研究，對(duì)其發(fā)病機(jī)理和動(dòng)物模型的研究，是為進(jìn)一步開發(fā)診斷試劑和建立有效控制方法的基礎(chǔ)。

[1] El Kouni M H.Adenosine metabolism in Toxoplasma gondii：potential targets for chemotherapy[J].CurrPharJ-Teisai Des，2007，13(6)：581-597.

[2] Seng S，Makala L H，Yokoyama M ，et al.SAG1 is a hosttargeted antigen for protection against Toxoplasma gondii infection[J].Pathobiology，2004，71(3)：144-151.

[3] Dzierszinski F，Mortuaire M，Cesbron-Delauw M F，et al.Targeted disruption of the glycosylpho sphatidy linositol-anchored surface antigen SAG3 gene in Toxoplasma gondii decreases host cell adhesion and drastically reduces virulence in mice[J].Mol Microbiol，2000，37(3)：574-582.

[4] 原永海，馬利青.小尾寒羊弓形蟲病血清抗體檢測(cè)[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志，2007，43(8)：44.