臨床型奶牛乳腺炎致病菌分析及藥敏試驗

劉 紅，高學軍，車有權，劉 云，陸江寧，劉洪杰，魯兆寧，楊名赫，鄔立剛，齊幫若，高月林

（1.黑龍江農(nóng)業(yè)職業(yè)技術學院，黑龍江 佳木斯 154007；2.東北農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，哈爾濱 150030）

奶牛乳腺炎是一種多因素性疾病。是乳腺受到物理、化學、微生物刺激所發(fā)生的一種炎性變化，乳汁中體細胞含量增加，乳腺組織發(fā)生病理變化，是奶牛飼養(yǎng)場的常發(fā)病之一，影響世界奶牛業(yè)發(fā)展，給乳品生產(chǎn)造成巨大的損失。臨床型乳腺炎是奶牛乳腺炎的一種表現(xiàn)形式，不僅造成奶產(chǎn)量和奶質(zhì)的降低，嚴重者還會導致乳房廢棄，乳區(qū)化膿、壞疽、萎縮，致使患牛永遠失去泌乳能力而被淘汰[1]。在我國，臨床型乳腺炎的發(fā)病率占奶牛乳腺炎總發(fā)病率的21%～23%，因其被淘汰的奶牛約占總淘汰牛的9%～11%[2-3]。導致引起奶牛乳腺炎的因素很多，其中病原微生物是導致乳腺炎的最主要原因。了解奶牛乳腺炎的致病菌的類型、分布及其敏感的藥物對于乳腺炎的預防和治療以及疫苗的研制均有非常重要的指導作用。

佳木斯市奶牛業(yè)比較發(fā)達，是黑龍江省重要的奶源基地。該市奶牛的疾病主要是乳腺炎，每年奶牛場由于乳腺炎尤其是臨床型乳腺炎造成的損失達上億元。因此掌握臨床型乳腺炎的致病菌種類及其敏感的藥物，是提高該市奶牛場經(jīng)濟效益的關鍵。目前國內(nèi)外對奶牛乳腺炎主要采用抗生素治療，抗生素中，眾多報道顯示使用氟喹諾酮類藥物治療乳腺炎的效果優(yōu)于其他抗生素[4-7]。中國采用傳統(tǒng)的中醫(yī)學治療奶牛乳腺炎也收到了較好的效果，近年來許多學者研究出中藥新型制劑如透皮劑，以促進中藥的吸收，提高治療效果[8-9]。通過調(diào)查，掌握佳木斯市治療臨床型奶牛乳腺炎主要使用青霉素類、頭孢菌素類以及氨基糖苷類抗生素，未使用過氟喹諾酮類抗菌藥。由于乳腺炎疾病的發(fā)生和地區(qū)環(huán)境的聯(lián)系非常緊密，無法從其他地區(qū)的報道來分析本地區(qū)的乳腺炎發(fā)病情況。因此，本試驗主要通過對佳木斯市4所奶牛場的17頭患有臨床型乳腺炎的奶牛的20份乳樣進行致病菌分離鑒定，從病原學上研究佳木斯市臨床型奶牛乳腺炎病原的特點，并對分離得到的致病菌進行8種氟喹諾酮類藥物的體外藥敏試驗，篩選出療效好、副作用小的抗生素類藥物，指導該市臨床用藥，為了探討中藥治療乳腺炎的優(yōu)越性，本試驗選擇了文獻報道的治療臨床型乳腺炎效果好的3組中草藥復合方劑，通過體外藥敏試驗選出療效較好的方劑，從中獸醫(yī)的角度來治療乳腺炎，希望通過本試驗的研究能為該市的臨床型奶牛乳腺炎疾病的研究提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 乳樣來源

本試驗檢測的乳汁樣品來源于佳木斯市4所奶牛場17頭患有臨床型乳腺炎的奶牛的不同乳區(qū)，共計20份。其中1號奶牛場采集乳汁樣品7份，2號奶牛場采集乳汁樣品9份，3、4號奶牛場各采集乳汁樣品2份（1、2號奶牛場為大型飼養(yǎng)場；3、4號奶牛場為散戶）。

1.1.2 試劑及培養(yǎng)基

培養(yǎng)基：普通營養(yǎng)瓊脂、兔鮮血瓊脂培養(yǎng)基，麥康凱瓊脂、營養(yǎng)肉湯、血清肉湯、蛋白胨、牛肉浸膏等，配制方法參閱文獻[10]。

細菌微量生化反應管：三糖鐵斜面、葡萄糖、山梨醇、甘露醇、蔗糖、乳糖、水楊苷。

試劑：3%過氧化氫，無菌兔血漿，6.5%氯化鈉瓊脂平板，革蘭氏染色液。

1.1.3 藥品

抗生素：采用杭州天和微生物試劑有限公司生產(chǎn)的諾氟沙星、恩諾沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星、加替沙星、環(huán)丙沙星、氟羅沙星、洛美沙星藥敏紙片。

中藥：購于佳木斯市金天大藥房。

方劑I：當歸、川山甲、金銀花、連翹等12味中藥組成。主藥是當歸、川山甲。

方劑Ⅱ：牛蒡子、連翹、金銀花、紫花地丁等10味中藥組成。主藥是牛蒡子、連翹。

方劑Ⅲ：蒲公英、金銀花、當歸、川芎等11味中藥組成。主藥是蒲公英、金銀花。

1.2 方法

1.2.1 乳樣的采集方法

首先將患病乳房進行消毒處理，用溫水將乳房擦洗干凈，0.2%新潔爾滅擦洗乳房，再用75%的酒精溶液消毒乳頭，然后帶上滅菌手套進行人工榨乳，棄去頭兩把乳，排除污染的雜菌，第三把乳開始用滅菌中等大小試管接住，大約采集5 mL左右，然后迅速將滅菌試管口在酒精燈上火焰消毒，塞上滅菌試管塞，標明牛號、乳室、日期后放入冰桶，送回實驗室進行細菌檢驗。

1.2.2 乳樣的培養(yǎng)方法

用一次性注射器抽取0.5 mL的待檢乳汁傾注到培養(yǎng)平皿的一端，然后勻速晃動平皿并慢慢傾斜平皿使乳汁均勻地覆蓋在整個平皿上，放入37℃溫箱培養(yǎng)。

1.2.3 細菌的分離與鑒定

將20份乳樣接種到普通瓊脂培養(yǎng)基、鮮血瓊脂培養(yǎng)基和麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)18～24 h后取出，觀察長出的菌落形態(tài)，根據(jù)菌落的形態(tài)、大小、顏色等將菌落大致分類，然后配合革蘭氏染色特點、顯微鏡下檢查，觀察細菌的形態(tài)仔細進行分類，排除環(huán)境中常存在的無致病性細菌，一般為革蘭氏染色呈陽性的粗大桿菌。將挑選出來的細菌作進一步的純培養(yǎng)，培養(yǎng)方法同上。純培養(yǎng)后鏡檢無雜菌者保存于試管斜面培養(yǎng)基內(nèi)，即可按有關生化鑒定方法進行生化鑒定。

1.2.4 生化鑒定試驗

將分離純化的細菌進行革蘭氏染色、溶血試驗、各種糖發(fā)酵試驗、過氧化氫試驗、三糖鐵試驗、血漿凝固酶試驗、CAMP試驗、6.5%NaCl試驗、馬尿酸、七葉苷、檸檬酸鹽試驗、吲哚試驗、M.R.試驗、V-P試驗、硫化氫試驗、尿素酶試驗、運動力等檢查。

1.2.5 抗生素藥敏試驗

采用藥物紙片瓊脂擴散法將分離鑒定出的致病菌種，葡萄球菌挑取5個菌落、鏈球菌挑取20個菌落，接種于2 mL肉湯培養(yǎng)基中，37℃增菌16 h（鏈球菌需24 h且接種在血清肉湯內(nèi)），取出后的菌液用生理鹽水稀釋1 000倍，稀釋液取0.8 mL傾于普通瓊脂平板表面（鏈球菌需鮮血瓊脂平板），使其均勻平鋪于表面棄去多余的菌液，置37℃干燥15 min，貼上制備好的藥敏紙片，每個平板最多貼6片，37℃培養(yǎng)18 h后取出，用圓規(guī)和直尺測量抑菌圈的直徑，記錄抑菌圈大小，根據(jù)藥敏試紙說明書判定敏感性（見表1）。

表1 藥敏試驗判定標準Table1 Judging standard of drug susceptivity testing

1.2.6 中藥藥敏試驗

1.2.6.1 中藥針劑的制作方法

采用水提醇沉淀法提取[11]。

1.2.6.2 中藥藥敏試驗方法

將購買的藥敏試驗濾紙片裝入一個潔凈干燥的青霉素小瓶中，高壓蒸汽滅菌30 min，取出后放入溫箱，干燥備用。用微量移液器向裝有紙片的小瓶中分別加入中藥藥液0.5 mL，相當于每片含藥量為0.0125 g。用無菌鑷子輕輕翻動，使濾紙片均勻吸凈藥液，放入4℃冰箱冷藏3 h取出，將藥敏片放入滅菌青霉素小瓶中加蓋滅菌橡皮塞，4℃保存?zhèn)溆肹12]。采用藥物紙片瓊脂擴散法進行藥敏試驗，方法同抗生素藥敏試驗。

2 結果與分析

2.1 致病菌的分離純化結果

在20個乳汁樣品中共分離得到致病菌508株。通過初步的細菌分離試驗結合顯微鏡下檢查發(fā)現(xiàn)，分離得到的致病均為葡萄球菌和鏈球菌。其中葡萄球菌共分離得到234株，鏈球菌共分離得到274株，分別占致病菌總數(shù)的46.06%（234/508）、53.94%（274/508）。其中分離得到的234株葡萄球菌中，金黃色葡萄球菌有180株，表皮葡萄球菌有54株，分別占致病菌總數(shù)的35.43%、10.63%；分離得到的274株鏈球菌中，無乳鏈球菌有203株，乳房鏈球菌有57株，化膿鏈球菌有14株，分別占致病菌總數(shù)的39.96%、11.22%、2.76%（見表 2）。

表2 臨床型乳腺炎的主要致病菌種類及其分離率Table2 Important pathogen classification and percentage of clinical mastitis

2.1.1 金黃色葡萄球菌的生化鑒定

金黃色葡萄球菌革蘭氏陽性球菌，在普通瓊脂平板上形成濕潤、光滑、隆起的圓形菌落，隨培養(yǎng)時間和菌株的不同菌落顏色稍有差異，有金黃色和黃白色，其在血液瓊脂平板上培養(yǎng)時有溶血現(xiàn)象。其生化特性為：兔血漿凝固酶試驗呈陽性、過氧化氫試驗呈陽性、在有氧和厭氧條件下均可分解甘露醇、三糖鐵培養(yǎng)基底部變黃。

2.1.2 表皮葡萄球菌的生化鑒定

表皮葡萄球菌革蘭氏陽性球菌，在普通瓊脂平板上形成濕潤、光滑、隆起的圓形菌落，邊緣整齊或略有不齊，菌落顏色有白色、奶白色、淡黃色，其生化特性為：兔血漿凝固酶試驗陰性、過氧化氫試驗陰性或弱陽性，三糖鐵培養(yǎng)基底部變黃，在厭氧條件下不分解甘露醇，但在有氧條件下有些菌株可以分解。

2.1.3 無乳鏈球菌的生化鑒定

無乳鏈球菌是革蘭氏陽性球菌，在血清肉湯中常呈長鏈排列，在固體培養(yǎng)基生長或病料涂片常呈現(xiàn)短鏈狀或成對出現(xiàn)。在普通瓊脂培養(yǎng)基上生長不良或不生長，在血液瓊脂培養(yǎng)基上生長形成半透明的灰色、隆起、閃光的小菌落，在血平板上，菌落周圍能產(chǎn)生狹窄而清晰的β型或α型溶血帶，其生化特性為CAMP試驗陽性，這是無乳鏈球菌區(qū)別于其他鏈球菌的最主要的特性，另外在高鹽瓊脂中不生長、可分解乳糖、不分解甘露醇和山梨醇。

2.1.4 乳房鏈球菌的生化鑒定

乳房鏈球菌革蘭氏染色為陽性，呈短鏈狀，在普通瓊脂培養(yǎng)基上生長不良或不生長，在血液瓊脂培養(yǎng)基上生長形成半透明的灰色、隆起、閃光的小菌落，不產(chǎn)生溶血情況，其生化特性為CAMP試驗陰性、在高鹽瓊脂中不生長、分解乳糖，分解甘露醇和山梨醇。

2.1.5 化膿鏈球菌的生化鑒定

鏈球菌革蘭氏染色為陽性，呈成對或短鏈狀，在普通瓊脂培養(yǎng)基上即可生長，在血液瓊脂培養(yǎng)基上生長更好，形成半透明的灰色、隆起、閃光的菌落，產(chǎn)生β型溶血情況，其生化特性為CAMP試驗陰性、在高鹽瓊脂中不生長、不分解乳糖，不分解甘露醇和山梨醇。

2.2 藥敏試驗結果

2.2.1 抗生素藥敏試驗結果

選擇的8種氟喹諾酮類抗菌藥對臨床分離得到的致病菌的抑菌效果均較好。其中，加替沙星對表皮葡萄球菌、無乳鏈球菌、化膿鏈球菌的抑菌效果最好，對金黃色葡萄球菌的抑菌效果不如恩諾沙星，但統(tǒng)計學分析差異不顯著（P>0.05）。因此，加替沙星對分離的臨床型奶牛乳腺炎的致病菌的抑菌效果最好（見表3）。

表3 抗生藥藥敏試驗結果Table3 Results of antibiotic susceptivity testing （mm）

2.2.2 中藥藥敏試驗結果

選擇的3組中藥方劑中，方劑I對乳房鏈球菌的抑制效果最好，其次為無乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌，對化膿鏈球菌的抑制作用較弱，對表皮葡萄球菌無抑制作用；方劑Ⅱ?qū)Ψ蛛x得到的致病菌無抑菌作用；方劑Ⅲ的抑菌效果弱于方劑Ⅰ，強于方劑Ⅱ，對表皮葡萄球菌和化膿鏈球菌無抑菌效果，對其他3種致病菌的抑制效果同方劑Ⅰ（見表4）。

表4 中藥藥敏試驗結果Table4 Results of Chinese traditional medicine susceptivity testing （mm）

3 討論與結論

3.1 細菌學分析

本試驗從20份乳樣中，共分離508株細菌，包括葡萄球菌和鏈球菌兩大類。與報道的奶牛乳腺炎的主要致病菌為葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌不一致[13-14]?？赡苁遣煌貐^(qū)有不同的致病菌，也可能與采集乳汁樣品的時間有關系，本試驗采集乳汁樣品是在12月份，天氣比較寒冷，不利于腸桿菌屬的生長，且泌乳奶牛即將進入干奶期，由于鐵結合蛋白-乳鐵蛋白的抗菌活性作用可能抑制了大腸桿菌的生長[15]。本試驗檢出的致病菌中葡萄球菌和鏈球菌分別占檢出數(shù)的46.06%和53.94%，所占致病菌檢出數(shù)的比率相當。這與陳坤永等[16]、許丹寧[12]報道的引起臨床型乳腺炎的致病菌主要為鏈球菌不一致。分離得到的臨床型乳腺炎的主要致病菌中金黃色葡萄球菌檢出率為35.43%、無乳鏈球菌的檢出率為39.94%，二者占臨床乳腺炎致病菌檢出數(shù)的75.37%。說明佳木斯市奶牛臨床型乳腺炎的主要致病菌為金黃色葡萄球菌和無乳鏈球菌。這與黃瑛等報道的引起奶牛乳腺炎的主要致病菌為無乳鏈球菌[17]，部分為大腸桿菌不同。在被檢的20個乳區(qū)中，單獨感染葡萄球菌的乳區(qū)有3個，感染鏈球菌的乳區(qū)2個，其余均為葡萄球菌和鏈球菌混合感染，混感現(xiàn)象嚴重。

3.2 藥敏試驗分析

藥敏試驗表明，分離得到的致病菌對8種氟喹諾酮類藥物均敏感，其中對加替沙星的敏感度最高，可見，氟喹諾酮類藥物，尤為加替沙星可用于治療佳木斯市臨床型奶牛乳腺炎。3組中藥方劑中方劑Ⅰ的抑菌效果最好，但由于國內(nèi)對于用中藥進行藥敏紙片法測定抑菌效果還沒有一定的規(guī)范的標準，目前還只能根據(jù)有無抑菌圈進行判定，抑菌圈越大說明效果就越好[7]，所以本試驗分離得到的致病菌對選用的3組中藥方劑的敏感度無法判定。由于本試驗中，3組中藥方劑的抑菌圈均較小甚至無抑菌圈，所以該3組方劑不是治療佳木斯市奶牛臨床乳腺炎的最理想的中藥制劑，因此，該市臨床型奶牛乳腺炎的中藥制劑德治療還需要進一步研究。

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