堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子在大鼠哮喘氣道重塑模型中的表達(dá)及地塞米松的干預(yù)作用

鞏雪芳 薄建萍 陳俊艷

大量的研究證明許多成纖維細(xì)胞因子(fibroblast growth factors，F(xiàn)GFs)在慢性炎癥和組織重塑進(jìn)程以及慢性氣道疾病如哮喘的纖維化中起作用[1]。堿性成纖維細(xì)胞因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)是FGFs龐大家族中的一員，而且是在哮喘病理生理學(xué)中研究最多的一員。這個(gè)生長(zhǎng)因子最早在牛垂體抽提物中發(fā)現(xiàn)，基于其刺激成纖維細(xì)胞細(xì)胞株NIH3T3增殖的能力及其高等電點(diǎn)(PI=9.6)而得名[2]。它在血管發(fā)生過程中血管內(nèi)皮、平滑肌細(xì)胞的增殖，損傷愈合過程中成纖維細(xì)胞的遷移和增殖，成肌纖維細(xì)胞表型的逆轉(zhuǎn)，以及氣道上皮細(xì)胞的遷移和增殖中起作用[3]。本文通過觀察在不同程度氣道重塑情況下血清中bFGF含量的變化，探討bFGF與氣道重塑嚴(yán)重程度的相關(guān)性及地塞米松干預(yù)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 彩云JWC-201D型超聲霧化器：鞍山市同信醫(yī)用儀器廠；BH-2型光學(xué)顯微鏡：日本Olympus公司；LY-SUPER HP CCD萬能成像裝置：成都勵(lì)揚(yáng)精密機(jī)電有限公司；80-2B型低速臺(tái)式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；ZS-2板式酶標(biāo)儀：北京新風(fēng)機(jī)械廠；IMS6.0彩色圖像分析系統(tǒng)：上海申騰信息技術(shù)有限公司。

1.1.2 試劑 卵白蛋白(Ovalbumin，OVA)：美國(guó)Sigma公司；氫氧化鋁(Aluminum hydroxide，Al(OH)3)：天津化學(xué)試劑三廠；bFGF ELISA試劑盒：美國(guó)R&D systems公司。

1.1.3 動(dòng)物 雄性Wistar大鼠40只，2～3月齡，體重160～180g，清潔級(jí)，購(gòu)于河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，室溫20℃飼養(yǎng)，自由進(jìn)食與飲水。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組 按隨機(jī)數(shù)字表法將40只大鼠分為早期干預(yù)組(early-intervention group)、晚期干預(yù)組(lateintervention group)、不干預(yù)組(non-intervention group)及對(duì)照組(control group)，每組10只。

1.2.2 模型建立 實(shí)驗(yàn)第1天，E組、L組和N組每只大鼠腹腔注射10%卵白蛋白抗原混懸液(內(nèi)含生理鹽水加卵蛋白100mg，氫氧化鋁干粉100mg)1ml致敏；C組腹腔注射等量生理鹽水。8天后E組、L組和N組每只大鼠再次腹腔注射10%抗原混懸液1ml；C組腹腔注射等量生理鹽水。第15天，E組、L組和N組開始用1%卵蛋白超聲霧化吸入激發(fā)哮喘，每天1次，每次20min，共8周；C組用生理鹽水霧化吸入，每天1次，每次20min，共8周。其中，E組在每次霧化前1h，每只大鼠首先腹腔注射地塞米松0.5mg/kg；從霧化第15天始，L組在每次霧化前1h，每只大鼠首先腹腔注射地塞米松0.5mg/kg；C組用生理鹽水代替，注射劑量相同。

1.2.3 標(biāo)本制備 每只大鼠于最后一次霧化后24h內(nèi)用10%水合氯醛3.5ml/kg腹腔注射麻醉，開胸，右心室取血約2ml，于室溫放置2小時(shí)后，1000r/min，離心10min，取上清液分裝，-20℃保存待測(cè)。同時(shí)，取右肺中葉，4%多聚甲醛溶液中固定1周，常規(guī)石蠟包埋，切片，做HE染色。

1.2.4 圖像分析 HE染色切片上100倍光鏡下選擇完整支氣管橫斷面測(cè)量支氣管基底膜周徑(Pbm)、支氣管總面積(At)、管腔面積(Ac)、平滑肌外緣內(nèi)氣管面積(AMe)、平滑肌內(nèi)緣內(nèi)氣管面積(AMi)。

計(jì)算公式：

支氣管壁厚度=(At-Ac)/Pbm

平滑肌厚度=(AMe-AMi)/Pbm

衡量氣道重塑程度[4]。

1.2.5 檢測(cè)血清bFGF水平 使用ELISA法，按試劑盒說明測(cè)定血清中bFGF濃度值。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，兩個(gè)變量間的關(guān)系采用線性相關(guān)分析，結(jié)果用(±s)表示，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 一般情況觀察 N組、E組、L組大鼠初次霧化結(jié)束時(shí)即出現(xiàn)大汗淋漓，口唇輕度紫紺，腹部翕動(dòng)，煩躁不安，易激惹，飲水增加。C組大鼠行動(dòng)敏捷，未見異常。

2.2 計(jì)算機(jī)圖像分析

2.2.1 HE染色形態(tài)學(xué)改變 N組肺組織中支氣管上皮細(xì)胞脫落，支氣管黏膜皺襞增多，中斷，呼吸道壁增厚，管腔狹窄，黏膜下、管壁及肺泡間質(zhì)均見有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(以嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞為主)；E組支氣管上皮結(jié)構(gòu)基本正常，上皮細(xì)胞偶有脫落，黏膜相對(duì)完整，呼吸道壁增厚及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)均明顯輕于N組；L組的變化介于上述兩組之間；C組肺組織中幾乎無上述病理改變。

2.2.2 各組大鼠支氣管管壁厚度和平滑肌厚度測(cè)定(表1)

2.3 血清中bFGF濃度(見表2，3)

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果

2.4.1 各組大鼠支氣管管壁厚度和平滑肌厚度比較 各組大鼠支氣管壁厚度數(shù)據(jù)由方差分析得F=518.49，P＜0.01；進(jìn)一步經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，任何兩組間支氣管壁厚度上的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。同樣，各組大鼠氣道平滑肌厚度數(shù)據(jù)由方差分析得F=271.26，P＜0.01；進(jìn)一步經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，任何兩組間支氣管壁厚度上的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.4.2 各組大鼠血清中bFGF濃度比較 由方差分析得F=132.70，P＜0.01；進(jìn)一步經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，任何兩組間血清中bFGF濃度上的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.4.3 各組大鼠血清中bFGF濃度與支氣管壁厚度及平滑肌厚度之間的關(guān)聯(lián)性分析 繪散點(diǎn)圖知，血清中bFGF濃度與支氣管壁厚度呈線性趨勢(shì)，Pearson相關(guān)系數(shù)r=0.93(t=6.16，P＜0.001)，表明血清中bFGF濃度與支氣管壁厚度間呈線性正相關(guān)；同樣，繪散點(diǎn)圖知，血清中bFGF濃度與平滑肌厚度也呈線性趨勢(shì)，Pearson相關(guān)系數(shù)r=0.95(t=18.75，P＜0.001)，表明血清中bFGF濃度與平滑肌厚度間也呈線性正相關(guān)。

表1 各組大鼠支氣管壁及平滑肌厚度(μm，±s)

表1 各組大鼠支氣管壁及平滑肌厚度(μm，±s)

分組 n 支氣管壁厚度 平滑肌厚度N組 10 139.34±5.80 36.93±1.52 E組 10 101.53±2.33 22.22±1.32 L組 10 117.77±1.20 29.24±0.97 C組 10 80.19±2.79 18.47±2.19

表2 各組大鼠血清中堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)的濃度(±s，ng/ml)

表2 各組大鼠血清中堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)的濃度(±s，ng/ml)

分組 n 血清中bFGF含量(ng/ml)N組 10 0.53±0.04 E組 10 0.34±0.02 L組 10 0.43±0.03 C組 10 0.30±0.03

表3 各組大鼠血清中堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)濃度的變異度

3 討論

哮喘氣道重塑最重要的病理變化是上皮剝脫、杯狀細(xì)胞化生、上皮下肥厚、氣道平滑肌增生、支氣管腺體肥大、血管生成和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)成分改變[5]。在這些病理變化中，氣道平滑肌增生是哮喘氣道重塑最顯著的特征[6]。有研究表明，bFGF誘導(dǎo)哮喘氣道平滑肌增生[2]，通過增加人氣道平滑肌細(xì)胞增殖和遷移、改變其收縮性表型在哮喘氣道重塑中起重要作用[1]。本實(shí)驗(yàn)中，從早期干預(yù)組、晚期干預(yù)組至不干預(yù)組，氣道重塑程度(支氣管壁厚度、平滑肌厚度)逐漸增加，而bFGF濃度也呈上升趨勢(shì)，提示bFGF與哮喘氣道重塑嚴(yán)重程度相關(guān)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩者呈線性正相關(guān)，由此推測(cè)bFGF未來可能成為評(píng)價(jià)氣道重塑程度、診斷和治療哮喘氣道重塑的關(guān)鍵因子。在哮喘治療中糖皮質(zhì)激素是最有效的抗炎藥物[7]，在本實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)用地塞米松后，早期干預(yù)組氣道重塑程度明顯較晚期干預(yù)組及不干預(yù)組為輕，提示早期地塞米松治療可部分逆轉(zhuǎn)哮喘氣道重塑，其可能通過下調(diào)bFGF起作用。另外本實(shí)驗(yàn)中，早期應(yīng)用地塞米松效果明顯，可預(yù)見用藥時(shí)機(jī)的選擇是治療哮喘氣道重塑的關(guān)鍵之一，在未來可考慮檢測(cè)哮喘患者血清bFGF來指導(dǎo)臨床用藥，從這個(gè)意義上來說，本實(shí)驗(yàn)可作為一個(gè)初步參考，一個(gè)因子要作為診斷標(biāo)準(zhǔn)還需進(jìn)行大量臨床工作，且本實(shí)驗(yàn)為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，要在人群中明確bFGF是否為哮喘氣道重塑的關(guān)鍵因子也需要進(jìn)一步的臨床研究。

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