慢性肝病患者血中一氧化碳的測(cè)定及其臨床意義

黃艷 田江 李丹 吳

目前慢性病毒性肝炎及其導(dǎo)致的肝硬化、肝衰竭及肝癌仍然是危害我國(guó)國(guó)民健康的常見(jiàn)疾患，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,細(xì)機(jī)理還不完全清楚,治療效果仍不令人滿意。繼一氧化氮(NO)之后，大量證據(jù)表明內(nèi)源性一氧化碳(CO)也是體內(nèi)廣泛分布的多功能氣體信號(hào)分子。與NO相似，CO也具有擴(kuò)張血管和抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖的作用。但CO不是自由基，它具有抗炎癥、抗凋亡和免疫調(diào)節(jié)等細(xì)胞保護(hù)作用[1]。近來(lái)研究顯示CO作為一種多效性信使分子，與肝硬化門(mén)脈高壓(PH)、肝臟的炎癥及應(yīng)激、肝臟微循環(huán)等有著密切關(guān)系[2]。但其詳細(xì)的作用機(jī)制仍不完全清楚。本研究旨在了解CO在慢性肝病中的變化，分析CO在慢性肝病發(fā)生發(fā)展中所起的作用。

1 資料與方法

1.1 病歷來(lái)源 研究對(duì)象為2005年3月～12月期間在新疆醫(yī)科大學(xué)一附院肝病中心住院的患者，其中55例慢性病毒性肝炎，66例肝硬化。診斷標(biāo)準(zhǔn)按照2000年西安肝病會(huì)議制定的慢性病毒性肝炎、肝硬化診斷標(biāo)準(zhǔn)。正常對(duì)照組來(lái)自肝病中心科室工作人員以及醫(yī)科大學(xué)成教院學(xué)生。詳細(xì)情況見(jiàn)表1。

1.2 排除標(biāo)準(zhǔn)

a)有吸煙史者：每日吸煙量＞2支者，以及有相關(guān)職業(yè)接觸史者，如煉剛工人；

b)有慢性肺部疾病，如慢支、肺心病、支氣管哮喘病史；

c)有冠心病、高血壓病史。

d)溶血性疾病患者。

1.3 檢測(cè)方法

入選病人均于清晨8點(diǎn)左右抽取靜脈血2ml存放于加有抗凝劑EDTA管中，具體操作步驟為：

1.3.1 取10ml具塞試管2支(一支為試劑空白管，另一支為測(cè)定管)；各放入2粒玻璃珠并加滿Tris液(約13～15ml，體積差異不影響測(cè)定準(zhǔn)確度)，空白管加入經(jīng)Tris液2ml稀釋的EDTA管液5μl,再加入40mg連二亞硫酸鈉，顛倒混勻。

1.3.2 用移液器吸待檢血標(biāo)本5μl，放入測(cè)定管中，加連二亞硫酸鈉40mg；補(bǔ)滿Tris稀釋液后蓋塞(勿迸氣泡)，顛倒混勻,l0～l5min后比色。

1.3.3 將試劑空白管和測(cè)定管待測(cè)液分別倒入lcm比色皿中,以試劑空白液調(diào)零點(diǎn)，記錄測(cè)定液420nm和432nm吸光度值(即A420、A432)。

1.3.4 為減少測(cè)定樣品的誤差,所有測(cè)定樣品均在同一儀器重復(fù)測(cè)定兩次以上,取均值。

1.4 飽和度計(jì)算

COHb飽和度按下列公式計(jì)算[3]:

式中：

aHb420-為Hb在420nm波長(zhǎng)的吸光度;

aHb432-為Hb在432nm波長(zhǎng)的吸光度;

aCOHb420-為COHb在420nm波長(zhǎng)的吸光度;

aCOHb432-為COHb在432nm波長(zhǎng)的吸光度。

1.5 吸光系數(shù)的測(cè)定

1.6 統(tǒng)計(jì)處理

采用SPSS12.0軟件,選用單因素方差分析、秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析a＝0.05。

2 結(jié)果

2.1 慢性肝病組與對(duì)照組之間COHb水平的比較

慢性肝炎組、肝硬化組及對(duì)照組COHb水平比較結(jié)果顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)一步經(jīng)兩兩比較顯示肝炎組、肝硬化組與對(duì)照組COHb水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表2、3。

2.2 不同程度肝硬化患者COHb水平比較

入選的66例肝硬化患者按照Child-Pugh積分分為A、B、C三組，各組COHb水平采用秩和檢驗(yàn)K-W法統(tǒng)計(jì)分析顯示，雖然隨著肝硬化損害程度加重各組的平均秩呈現(xiàn)出增加的趨勢(shì),但各組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表4。

表1 各組臨床資料比較

表2 三組COHb方差分析

表3 三組COHb兩兩比較

表4 肝硬化Child-Pugh積分A.B.C三組COHb水平比較

3 討論

目前已證實(shí)哺乳動(dòng)物體內(nèi)的CO主要來(lái)源于血紅素氧化酶(hemeoxygenase, HO)催化血紅素氧化分解，形成等分子的膽綠素和CO。HO在體內(nèi)廣泛存在，已被證實(shí)幾乎分布于所有的器官和組織，涉及整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，顯示機(jī)體產(chǎn)生CO的部位相當(dāng)廣泛。HO是哺乳動(dòng)物和嚙齒動(dòng)物組織細(xì)胞微粒體中的一種蛋白酶，它有3種異構(gòu)型：HO-1、HO-2和HO-3[4]。HO-1為誘生型，HO-2和HO-3為原生型。HO-1主要分布在脾、肝、骨髓、單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)、平滑肌，主要參與血紅素的代謝，以脾臟中活性最高。HO-1可被各種誘導(dǎo)劑激活，如應(yīng)激、饑餓、缺氧、熱休克、內(nèi)毒素、細(xì)胞因子(如白細(xì)胞介素-1、白細(xì)胞介素-6)、激素(胰島素、腎上腺素、胰高血糖素等)、金屬離子、氧化反應(yīng)、氧自由基等等[5]。HO-1與目前所發(fā)現(xiàn)的任何基因相比，能對(duì)更多種類和形式的刺激產(chǎn)生反應(yīng)。

本項(xiàng)結(jié)果表明，在病毒性肝炎、肝硬化等肝臟病理狀態(tài)下，體內(nèi)COHb水平發(fā)生變化，提示存在HO-1活性的改變。但本項(xiàng)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果有所不同，文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果表明，在炎癥等各種病理狀態(tài)下釋放的各種促炎細(xì)胞因子刺激HO-1的表達(dá)上調(diào)導(dǎo)致CO的生成增多[6]。而在本項(xiàng)研究中，各病例組COHb水平均低于對(duì)照組，分析出現(xiàn)該結(jié)果的原因有以下可能：有研究顯示HO-1的表達(dá)高峰出現(xiàn)在炎癥消退時(shí)[7]，說(shuō)明HO-1的表達(dá)在炎癥的不同時(shí)期程度不同，而本項(xiàng)研究的病例組，大多在入院時(shí)病變活動(dòng)期留取血標(biāo)本，此時(shí)HO-1的活性有可能升高不明顯，從而影響體內(nèi)COHb水平。

關(guān)于HO-CO系統(tǒng)在氧化應(yīng)激狀態(tài)下提供的細(xì)胞保護(hù)作用的機(jī)制目前仍不完全清楚，現(xiàn)認(rèn)為該作用的產(chǎn)生與促炎細(xì)胞因子(TNF-a,IL-1)的下調(diào)及伴有的抗炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-10(IL-10)的增強(qiáng)有關(guān)[2]。

有證據(jù)提示HO-1的過(guò)度表達(dá)產(chǎn)生的保護(hù)性作用限制在一個(gè)相當(dāng)有限的范圍內(nèi)。過(guò)高水平表達(dá)的HO-1通過(guò)釋放活性鐵甚至?xí)黾蛹?xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的敏感性，HO-1基因的轉(zhuǎn)錄激活是細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激反應(yīng)整體中的一部分，它的誘導(dǎo)產(chǎn)生的作用似乎既不是絕對(duì)的細(xì)胞保護(hù)也不是絕對(duì)的細(xì)胞毒性[8]。

在肝硬化組按照Child-Pugh評(píng)分分A、B、C三組，三組的COHb平均秩隨著肝硬化損害程度的加重呈現(xiàn)出上升的趨勢(shì)，該現(xiàn)象和文獻(xiàn)報(bào)道的研究結(jié)果相符[9]，即呼出的CO和靜脈COHb水平之間有密切的相互關(guān)系而且兩者的水平與肝硬化Child-Pugh積分和血漿腎素活性相關(guān)。呼出的CO和靜脈COHb水平在肝硬化組較對(duì)照組顯著升高；且在肝硬化合并原發(fā)性細(xì)菌性腹膜炎時(shí)升高更明顯。本研究A、B、C三組之間未顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異考慮和樣本例數(shù)不足有關(guān)，有待于擴(kuò)大樣本例數(shù)后進(jìn)一步觀察分析。已有的關(guān)于肝硬化的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究顯示，肝硬化門(mén)靜脈高壓時(shí)，肝臟庫(kù)弗細(xì)胞及肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的HO-1被激活，過(guò)度表達(dá)導(dǎo)致CO產(chǎn)生增多，而在特發(fā)性門(mén)靜脈高壓，HO-1在庫(kù)弗細(xì)胞的表達(dá)顯示明顯減少，提示在肝硬化門(mén)靜脈高壓時(shí)，局部血液動(dòng)力循環(huán)的改變影響庫(kù)弗細(xì)胞HO-1的表達(dá)[10]。另有報(bào)道顯示嚴(yán)重肝硬化門(mén)靜脈高壓的患者，肝臟HO-1的活性有明顯升高，HO-1通過(guò)產(chǎn)生CO參與門(mén)靜脈高壓的病理機(jī)制的調(diào)節(jié)[11]。

CO作為氣體信號(hào)分子家系中的一員，由于其獨(dú)特的作用方式和在體內(nèi)的廣泛分布，它在生物體內(nèi)多個(gè)系統(tǒng)生理及病理狀態(tài)下發(fā)揮的多方面的生物學(xué)效應(yīng)日益受到關(guān)注。而肝臟作為機(jī)體內(nèi)的重要代謝器官之一，CO在肝臟中的生理及病理作用也引起人們的關(guān)注。研究表明，CO在肝臟的血液循環(huán)、炎癥、門(mén)靜脈高壓及膽汁分泌中發(fā)揮了一定作用，但是其詳細(xì)的作用機(jī)制仍然不完全清楚。鑒于氣體信號(hào)分子之間密切的相互調(diào)節(jié)關(guān)系，深入研究CO和其他氣體信號(hào)分子之間的相互作用，采用更為先進(jìn)的技術(shù)手段和更靈敏的觀測(cè)指標(biāo)進(jìn)一步研究HO-CO系統(tǒng)的作用機(jī)制，對(duì)于揭示CO在慢性肝病發(fā)病機(jī)制中的作用具有重要意義。

[1]蒲丹,唐朝樞.關(guān)注生物活性小分子物質(zhì)的研究[J].國(guó)外醫(yī)學(xué).生理,病理科學(xué)與臨床分冊(cè),2004,24(5):397-398.

[2]Otterbein LE,Bach FH,Alam J,et al:Carbon monoxide has antiinflammatoryeffects involving the mitogen-activated protein kinase pathway[J].Nat Med,2000,6:422-428.

[3]樂(lè)宏元,宋小興.一氧化碳血紅蛋白雙波長(zhǎng)定量測(cè)量[J].臨床檢驗(yàn)雜志,1996,14(2):87－88.

[4]McCoubrey WK,Huang TJ,Maines MD:Isolation and characterization of a cDNAfrom the rat brain that encodes hemoprotein heme oxygenase-3[J].Eur J Biochem,1997,247:725-732.

[5]Zuckerbraun,B.S.,Billiar,T.R.(2003)Heme oxygenase-1:a cellular Hercules[J].Hepatology,2003,37:742-744.

[6]Michael C.Ott,Jeffrey R,Scott,et al.Otterbein,Inhalation of carbon monoxide prevents liver injury andinflammation following hind limb ischemia/reperfusionThe FASEB Journal express article10.1096/fj.04-2514fje.Published online October,28,2004.

[7]Ana Maria Vicente,Maria Isabel,Guillen,et al.Beneficial effects of heme oxygenase-1 up-regulation in the development of experimental inflammation induced by zymosan[J].The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics,2003,307:1030-1037.

[8]Bauer M,Bauer I.Heme oxygenase-1:redox regulation and role in the hepatic response to oxidative stress[J].Antioxid Redox Signal,2002 Oct,4(5):749-58.

[9]De Las Heras D,Fernandez J,Gines P,Cardenas A,Ortega R,Navasa M,et al.Increased carbon monoxide production in patients with cirrhosis with and without spontaneous bacterial peritonitis 1[J].Hepatology,2003,38:452-459.

[10]Nobuya Makino 1,Makoto Suematsu 1,Altered expression of heme oxygenase-1 in the livers of patients with portal hypertensive diseases[J].J hepatology,2003,33:32-42.

[11]Erario Ma,Gonzales S.et al.Role of heme oxygenase/carbon monoxide pathway on the vascular response to noradrenaline in portal hypertensive rats[J].J Clin Exp Pharmacol Physiol.2005,32(3):196-201.