脂蛋白脂酶基因 Ser447stop多態(tài)性與腦出血的關(guān)系

林慧瓊, 李呂力, 劉曉春, 鐘維章, 滕曉茗, 羅永堅, 張德敏

研究提示,Ser447Stop是一種保護(hù)性因素,具有抑制冠心病發(fā)展的作用[1]。研究表明,脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase,LPL)基因 Ser447→終止密碼突變(Ser447Stop)多態(tài)性在動脈粥樣硬化形成中發(fā)揮重要作用。我們的研究發(fā)現(xiàn),脂蛋白脂酶Ser447stop多態(tài)性與腦梗死發(fā)病有一定相關(guān)性,G等位基因是腦梗死的一個保護(hù)性因素[2]。本研究應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)和限制性片段長度多態(tài)性方法(restiction fragment length polymorphism,RFLP),研究 LPLSer447Stop多態(tài)性與腦出血相關(guān)性,通過比較 Ser447Stop等位基因在腦出血組(CH)組和對照組中的頻率,探討 LPL Ser447Stop突變與 CH是否存在相關(guān)性,為 CH的預(yù)防和基因治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 資料

腦出血組：腦出血患者共 69例,為廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科患者,以全國第四屆腦血管病學(xué)術(shù)會議診斷標(biāo)準(zhǔn)(1986)為診斷依據(jù),經(jīng)頭顱CT或 MRI證實,其中,男性 51例,女性 18例,平均年齡 57.12±11.61歲。以上病例均排除糖尿病、嚴(yán)重腎、肝疾病、甲狀腺疾病等。66例正常對照者由健康體檢者中選出,其中男性 46例,女性 20例,平均年齡 53.86±15.71歲,血脂、血糖正常者,排除心腦血管疾病、高血壓病、甲狀腺疾病及糖尿病。兩組研究對象的基本條件互相匹配,具有可比性?？崭?2h后,抽靜脈血 3m l,留取血清置 -80℃保存;抽靜脈血 3ml,ACD抗凝,置 -20℃保存。

dNTPs、TaqDNA聚合酶、MnlI限制性內(nèi)切酶(上海生工生物工程有限公司);Ser447stop RFLP引物由上海生工生物工程有限公司合成;甘油三酯(TG)、總膽固醇 (TC)、HDL-c、LDL-c(日本協(xié)和藥品株式會社)、Lp(a)、ApoAⅠ、ApoB100(中生北控公司)、PE5700擴(kuò)增儀、ADVIA1650全自動生化分析儀。

1.2 方法

1.2.1 血清脂質(zhì)的檢測 將所收集的血清標(biāo)本解凍后 1h內(nèi)完成檢測。酶法測定 TC和TG,選擇性遮蔽法直接測定高密度脂蛋白膽固醇(HDL-c),直接測定法低密度脂蛋白膽固醇(LDL-c),免疫比濁法測定 ApoAⅠ、ApoB100。以上均為 ADVIA1650全自動生化分析儀進(jìn)行。

1.2.2 PCR-RFLP法進(jìn)行基因分型 (1)外周全血白細(xì)胞 DNA的抽提：采用酚/氯仿法抽提DNA,用雙蒸水溶解,-20℃保存。(2)RFLP擴(kuò)增：PCR反應(yīng)體系為：10×buffer 4μl,4×2mmol/L dNTPs 4μl,引物序列參照文獻(xiàn)[1],5pmol/μl Primer混合物 4μl,2.5U/μl TaqDNA聚合酶 0.6μl,DDW 25.4μl,DNA 2μl,以上操作均在冰浴上進(jìn)行。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性 5m in,94℃ 60s,57℃ 60s,72℃60s共 30循環(huán),72℃ 10min。反應(yīng)結(jié)束后用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測特異性 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。(3)擴(kuò)增產(chǎn)物酶切及基因型判斷：取 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 10μl加 MnlI限制性內(nèi)切酶 2.5U,總反應(yīng)體積20μl,37℃水浴 4h,水浴結(jié)束后 56℃ 20min以終止反應(yīng);取酶切產(chǎn)物 10μl和 6×上樣緩沖液 2μl進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳,紫外透射儀下觀察結(jié)果。擴(kuò)增產(chǎn)物長 488bp,經(jīng) Mn lI限制性內(nèi)切酶水解后出現(xiàn) 3種多態(tài)性：LPL Ser447stop無突變(CC)型(285bp,203bp);LPL Ser447stop突變雜合子 (CG)型(285bp,246bp,203bp);LPL Ser447stop無突變(GG)型(246bp,203bp)。

1.2.3 統(tǒng)計學(xué)方法 基因型采用頻率計數(shù)法,用 Hardy-Weinberg平衡定律計算出等位基因頻率。組間基因型及等位基因頻率比較采用 χ2檢驗。病例組與對照組間、不同基因型間血清脂質(zhì)比較采用單因素方差分析。以上各檢驗均采用 SPSS 12.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行統(tǒng)計分析。以 P＜0.05表示差異有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義,以 P＜0.01表示差異有極其顯著性統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 腦出血組與對照組 Ser447stop基因型和等位基因頻率分布 見表1。

2.2 腦出血組與對照組血脂和載脂蛋白含量水平比較 見表2。

2.3 對照組不同 LPL Ser447stop基因型血脂和載脂蛋白含量水平比較 見表3。

表1 腦出血組與對照組Ser447stop基因型和等位基因比較

表2 腦出血組與對照組血脂和載脂蛋白含量(±s)比較

表2 腦出血組與對照組血脂和載脂蛋白含量(±s)比較

與對照組相比,腦出血患者組血清TG、LDL-c水平升高(P＜0.01);腦出血組患者血清CHO、ApoAⅠ、ApoB水平降低(P＜0.01)

對照組(66例) 腦出血組(69例) t值 P CHO(mmol/L)TG(mmol/L)HDL-c(mmol/L)LDL-c(mmol/L)ApoAⅠ(g/L)ApoB(g/L)Lpa(mg/L)5.1305±0.2888 1.0268±0.3352 1.046±0.1809 1.7930±0.2238 1.2053±0.1353 1.2638±0.1863 242.45±242.59 4.3004±0.9040 1.6401±1.5323 1.094±0.3572 2.7216±0.8565 1.0907±0.2136 1.0103±0.2920 263.32±234.36 7.25 3.245 1.000 8.68 3.70 6.03 0.508 0.000 0.002 0.320 0.000 0.000 0.000 0.612

表3 對照組不同LPL Ser447stop基因型血脂和載脂蛋白含量(±s)比較

表3 對照組不同LPL Ser447stop基因型血脂和載脂蛋白含量(±s)比較

對照組內(nèi) CC基因型與 CG基因型 HDL-c具有顯著性差異(P＜0.05),其它血脂含量無顯著性差異

CC型(40例) CG型(26例) t P CHO(mmol/L)TG(mmol/L)HDL-c(mmol/L)LDL-c(mmol/L)ApoAⅠ(g/L)ApoB(g/L)Lpa(mg/L)5.15±0.34 0.96±0.34 1.08±0.17 1.81±0.23 1.20±0.12 1.26±0.21 252.2±252.9 5.08±0.14 1.11±0.31 0.98±0.18 1.74±0.19 1.21±0.16 1.26±0.14 229.2±233.2 1.17 1.85 2.25 1.35 0.27 0 0.379 0.272 0.084 0.033 0.228 0.641 0.961 0.363

3 討 論

動脈粥樣硬化(AS)引發(fā)的腦血管疾病,是嚴(yán)重危害人類健康及生命的主要疾病。在形成動脈粥樣硬化過程中,血脂代謝異常起重要作用。由于 LPL參與脂質(zhì)代謝,而脂代謝與動脈粥樣硬化密切相關(guān),因此一些學(xué)者將 LPL基因作為心血管疾病和糖尿病的候選基因之一進(jìn)行研究。人脂蛋白脂酶基因位于染色體 8q22,全長 30kb,由 10個外顯子和 9個內(nèi)含子組成。已發(fā)現(xiàn) LPL存在數(shù)十種基因變異,LPL Ser447stop突變是 LPL常見變異之一,LPLS-er447Stop突變頻率較高,在某些研究中其雜合子頻率可達(dá) 17%～22%[3]。Ser447stop突變是外顯子 9中第 1595位核苷酸 C→G,導(dǎo)致第 447位 Ser變?yōu)榻K止密碼子,從而使 LPL蛋白的 C末端缺少 2個氨基酸 Ser和 Gly。

本研究提示正常廣西地區(qū)人群 LPL Ser447stop C等位基因含量為 80.30%,G等位基因含量為19.70%;與滕亞娟等[4]報道中國青島地區(qū)人群相比分布基本一致,其 LPL Ser447stop等位基因 C等位基因含量為 80%,G等位基因含量為20%;與 Shimo-Nakanishi[5]的日本人群相比,C等位基因含量較高(84.2%),G等位基因含量較低(15.8%),說明 LPL Ser447stop等位基因頻率分布可能存在種屬差異。研究結(jié)果提示,與對照組相比,腦出血患者組 CG基因型含量較對照組少(P=0.008,χ2=6.93);腦出血患者組 G等位基因含量較對照組少(P=0.016,χ2=5.766);提示 LPL Ser447stop多態(tài)性與腦出血發(fā)病有一定相關(guān)性,G等位基因是腦出血的一個保護(hù)性因素。LPLSer447stop突變對腦出血具有保護(hù)作用的機(jī)制尚不清楚,可能與 LPL功能有關(guān)。最近 Clee等[6]和 Sass等[7]的研究表明,LPL Ser447stop基因變異很可能是血管保護(hù)因素,具有改善內(nèi)皮功能和防止內(nèi)皮功能失調(diào)的作用,因此有利于防止動脈粥樣硬化的發(fā)生。頸動脈粥樣硬化是腦出血的重要危險因素,據(jù)報道 20%～30%的腦卒中是由于頸動脈狹窄性病變進(jìn)行性發(fā)展所致。Shimo-Nakanishi等[5]的結(jié)果顯示合并頸內(nèi)動脈粥樣硬化性狹窄的腦卒中患者,G等位基因頻率較低,比不合并頸內(nèi)動脈狹窄的腦卒中患者 G等位基因攜帶率還要低,提示 LPL Ser447 stop對腦出血的保護(hù)作用部分源于它對頸動脈粥樣硬化的阻抑作用。此外,LPL基因變異也可能通過轉(zhuǎn)運膽固醇的維生素 E到神經(jīng)元,從而有助于受損神經(jīng)細(xì)胞膜的再生,因而還有保護(hù)腦細(xì)胞的作用[8]。

LPL突變可能影響其催化功能,造成以三酰甘油水平升高為主要特征的嚴(yán)重高乳糜微粒血癥,并出現(xiàn)一系列臨床癥狀。LPL導(dǎo)致的高三酰甘油血癥與動脈粥樣硬化的關(guān)系尚未被廣泛證實。既往研究表明,Asp9Asn、Asn291Ser、Gly188Glu和其他一些罕見突變通常與血漿高甘油三酯及早發(fā)性冠心病(CAD)呈正相關(guān)。最近有資料提示 Ser447Stop突變是一種保護(hù)性因素,能抑制 CAD的發(fā)展,Ser447Stop突變攜帶者,與三酰甘油水平降低有關(guān),對男性 CAD患者有保護(hù)作用[9]。本研究結(jié)果提示,腦出血患者組血清 TG、LDL-c水平較對照組升高(P＜0.01)。腦出血組患者組血清 CHO、ApoAⅠ、ApoB水平較對照組降低(P＜0.01);對照組內(nèi) CC基因型與 CG基因型 HDL-c具有顯著性差異(P＜0.05),其它血脂含量無顯著性差異。

國內(nèi)有關(guān) LPL Ser447stop基因多態(tài)性與腦出血的相關(guān)性的研究目前還鮮有報道,今后的研究需擴(kuò)大研究地域與研究人群,通過大規(guī)模的樣本研究,進(jìn)一步證實和明確 LPL Ser447stop基因與腦出血發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。

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