河南省耐多藥結(jié)核分枝桿菌鏈霉素耐藥相關(guān)基因rpsL和rrs突變分析

賈瓊 石大偉 趙玉玲 李輝 陳彥丞 李亮 朱國峰

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)研究所 北京 100176;2.河南省疾病預(yù)防控制中心 鄭州 450016;3.國家科學(xué)技術(shù)部辦公廳 北京 100862;4.北京結(jié)核病胸部腫瘤研究所 北京 101149)

鏈霉素是第一個用于治療結(jié)核病的藥物[1]。由于用于治療結(jié)核病歷史較長,鏈霉素耐藥在全球較為嚴重。在我國鏈霉素的耐藥率為20.5%,在4種常用一線抗結(jié)核藥物的耐藥率中最高[2]。雖然鏈霉素的高耐藥率及其耳毒性限制了該藥在治療耐多藥結(jié)核中的應(yīng)用,但是在按階梯原則使用注射類抗結(jié)核藥時鏈霉素仍是首選[3]。因此,使用分子生物學(xué)技術(shù)早期快速檢測結(jié)核分枝桿菌的鏈霉素耐藥性對于及時制定和調(diào)整耐多藥(MDR)結(jié)核病的治療方案具有重要意義。結(jié)核分枝桿菌rpsL和rrs基因的突變與鏈霉素耐藥有關(guān),但多數(shù)研究[1,4-6]顯示檢測此2個基因突變最多可發(fā)現(xiàn)80%左右的鏈霉素耐藥菌株。本研究通過對來自于河南省的較大樣本的耐多藥結(jié)核分枝桿菌的鏈霉素相關(guān)基因rpsL的編碼區(qū)全長和rrs高頻突變區(qū)中的突變進行分析,力圖為開發(fā)和應(yīng)用適合該地區(qū)乃至更大范圍的快速檢測耐多藥結(jié)核分枝桿菌鏈霉素耐藥性的分子診斷工具提供更多的數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌株來源 115株耐多藥結(jié)核分枝桿菌株來源于河南省疾病預(yù)防控制中心,分離培養(yǎng)自2007至2009年河南省結(jié)核病患者(包括新發(fā)和復(fù)發(fā)患者,男82例,女33例,年齡15到86歲)的痰標(biāo)本。另收集了22株對利福平、異煙肼、乙胺丁醇和鏈霉素全敏感菌株作為對照。

1.2 菌株的分離培養(yǎng)、菌種鑒定和藥物敏感性實驗菌株分離培養(yǎng)、菌種鑒定按照中國防癆協(xié)會2006年修訂并出版的《結(jié)核病診斷實驗室檢驗規(guī)程》中推薦的實驗方法進行。藥敏實驗為WHO推薦的比例法。

1.3 結(jié)核分枝桿菌基因組DNA提取和rpsL、rrs基因的PCR擴增和測序 采用煮沸法提取結(jié)核分枝桿菌基因組DNA。使用Phusion熱啟動高保真DNA聚合酶擴增rpsL、rrs基因全長序列。PCR擴增和測序所用引物序列見表1。測序工作由北京諾賽基因組研究中心有限公司完成。

1.4 測序數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計分析 分別使用軟件Seqman pro(version 7.1,DNAstar Lasergene,Inc.,USA)和SPSS for windows(version 10.0,SPSS,Inc.,USA)進行測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。參比序列為結(jié)核分枝桿菌H37Rv標(biāo)準株DNA序列。

2 結(jié)果

115株耐多藥(MDR)結(jié)核分枝桿菌株中有114株獲得良好的擴增產(chǎn)物和測序數(shù)據(jù)。114株中99株為鏈霉素耐藥,15株為鏈霉素敏感。

表1 rpsL和rrs基因PCR擴增和測序相關(guān)信息

表2 鏈霉素耐藥相關(guān)基因rpsL和rrs突變特征(按突變位點分析)

在完成分析的114株 MDR結(jié)核分枝桿菌的rpsL和rrs基因中,共檢測到10個突變位點(以密碼子編號計算),詳見表2。其中同義突變?yōu)閞psL39(1株)和rpsL121(114株)。在結(jié)核分枝桿菌耐藥相關(guān)基因突變和多態(tài)性數(shù)據(jù)庫(www.tbdreamdb.com)中檢索發(fā)現(xiàn)的10個突變位點,有4個突變位點未見記錄：非同義突變 rpsL2(1株)、rrs1443(1株)和同義突變rpsL39、rpsL121。所有MDR菌株和22株全敏感菌株均發(fā)生rpsL121位突變,檢索TBDB數(shù)據(jù)庫(www.tbdb.org)顯示 rpsL 121位AAA→AAG為多態(tài)性改變,與鏈霉素耐藥性無關(guān)。

rpsL和rrs基因的突變類型均為點突變,未發(fā)現(xiàn)插入或缺失。rpsL 43位點的突變類型有兩種：AAG→ACG(1株)和AAG→AGG(62株),主要為AAG→AGG(K43R),均為密碼子第二個堿基的突變。rpsL 88位點的突變類型為：AAG→ACG(2株)、AAG→AGG(11株)、AAG →ATG(1株)。rrs基因的各突變位點只發(fā)現(xiàn)一種突變類型(表2)。

除去僅發(fā)生同義突變和多態(tài)性位點的菌株,共有80.7%(92/114)的MDR結(jié)核分枝桿菌的 rpsL和rrs基因發(fā)生突變(發(fā)生1個及1個以上位點突變的菌株)。不考慮單點同義突變和多態(tài)性位點,發(fā)生rpsL 43突變的菌株比例最高,為55.3%;其次是rpsL 88,為 12.3%;再次是 rrs1440,為 9.6%,但其中10株為合并rpsL 43突變。發(fā)生rrs513突變的菌株有10株,其中有9株是 rrs基因單點突變;發(fā)生rrs516突變的菌株有4株,均為rrs基因單點突變(表2)。

單獨檢測rpsL基因突變可以發(fā)現(xiàn)74.7%對鏈霉素耐藥的MDR菌株,加入rrs基因后靈敏度提高至 88.9%(88/99)。有 63株 MDR菌株發(fā)生rpsL43突變,但這些菌株中有3株是鏈霉素敏感菌株,另有1株鏈霉素敏感的MDR菌株發(fā)生 rrs513突變。

3 討論

本研究中rpsL基因的突變主要發(fā)生在rpsL43和 rpsL88,rpsL43的主要突變類型為 AAG→AGG,其次是AAG→ACG,但后者只有1株發(fā)生該突變,這與已有研究的結(jié)果一致[4,7-8]。雖發(fā)現(xiàn)2個新突變位點(rpsL2和 rrs1443),但各只有1株,且與rpsL43突變同時發(fā)生,其在鏈霉素耐藥產(chǎn)生中的作用需要進一步研究。

99株鏈霉素耐藥株中有74株發(fā)生 rpsL43或rpsL88突變,即 rpsL基因突變可解釋74.7%的MDR菌株的鏈霉素耐藥性,這個比例略高于某些研究的結(jié)果,但與中國中部的研究相近(76.5%)[4]。本研究中,rpsL和rrs基因突變總共可以解釋88.9%的MDR菌株鏈霉素耐藥,同樣高于某些研究的結(jié)果：美洲(56%～68%)[9],德國(48%)[10],和日本(77.8%)[6],但與中國中部的研究接近(85.2%)[4]。鏈霉素耐藥株的 rpsL和rrs基因的高突變頻率提示在河南地區(qū)通過檢測上述位點預(yù)測鏈霉素耐藥性有較高的潛在應(yīng)用價值。

rpsL 43突變菌株被認為多數(shù)為鏈霉素高水平耐藥[1],但在本研究中發(fā)現(xiàn)有3株鏈霉素敏感菌株發(fā)生了 rpsL 43突變。此外還有1株敏感株發(fā)生rrs513突變。這些敏感株發(fā)生的突變降低了檢測的特異度。國內(nèi)也有研究報道[11-12]少數(shù)鏈霉素敏感株也發(fā)生rpsL和rrs基因突變的現(xiàn)象,但多被認為是突變檢測或耐藥性檢測的誤差導(dǎo)致。我們認為,這種現(xiàn)象與對乙胺丁醇敏感的MDR菌株中發(fā)生embB306突變相似[13-14],其原因可能與菌株對利福平或/和異煙肼耐藥有關(guān)。這4株結(jié)核分枝桿菌均為乙胺丁醇敏感,因此突變與乙胺丁醇耐藥有關(guān)的可能性不大。另一方面,鑒于所檢測樣品為均為MDR菌株,其中部分菌株很可能具有對二線藥的耐藥性,且已有研究表明 rrs突變和二線藥物卡那霉素的耐藥有關(guān)[15],因此不能排除上述4株鏈霉素敏感菌株的突變和菌株對二線藥物的耐藥有關(guān)。我們將檢測上述鏈霉素敏感菌株對卡那霉素、阿米卡星等藥物的耐藥性并進一步擴大樣本量以驗證鏈霉素敏感菌株發(fā)生rpsL和rrs基因突變現(xiàn)象的普遍性。

本研究中約有11%的鏈霉素耐藥菌株沒有發(fā)生rpsL和rrs基因的突變,有研究這指出這些菌株的耐藥性較低而使藥物敏感實驗檢測時易于出現(xiàn)誤差[16],其耐藥機制也可能是細胞膜通透性的改變,但也不能排除還存在鏈霉素耐藥的其他機制。有研究報道gidB基因和鏈霉素耐藥有關(guān),[17],但有研究指出該基因突變在敏感菌株也會出現(xiàn)[18]。因此,鏈霉素耐藥的分子機制及耐藥分子指標(biāo)還需深入研究以進一步闡明。

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