Defensin抗菌肽的序列特性分析

孫雁霞,鄔曉勇,何 鋼,宋 芹,王躍華

(成都大學(xué)藥用微生物資源重點實驗室,四川成都 610106)

Defensin抗菌肽的序列特性分析

孫雁霞,鄔曉勇,何 鋼,宋 芹,王躍華

(成都大學(xué)藥用微生物資源重點實驗室,四川成都 610106)

對defensin抗菌肽進(jìn)行了生物信息學(xué)分析.一級結(jié)構(gòu)表明其具有典型的昆蟲防御素特征.二級結(jié)構(gòu)分析表明defensin抗菌肽中主要的結(jié)構(gòu)元件為α-螺旋,但有例外.信號肽及導(dǎo)肽分析結(jié)果顯示defensin抗菌肽均屬于分泌型蛋白.通過對不同物種defensin抗菌肽的分析結(jié)果表明,非陽離子抗菌肽的作用機(jī)制可能是疏水作用力起主導(dǎo)作用或者是對細(xì)菌胞內(nèi)酶結(jié)構(gòu)與功能、對細(xì)菌胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響有關(guān).

defensin類抗菌肽;序列特性;作用機(jī)制

0 引 言

defensin抗菌肽是昆蟲抗菌肽的代表,屬于昆蟲防御素類.其典型的特征是具有6個半胱氨酸殘基組成的3個分子內(nèi)二硫鍵.它們的作用機(jī)制主要是通過在細(xì)胞膜上形成通道,引起細(xì)胞離子通透性的失衡和胞內(nèi)物質(zhì)的泄露,進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞活動的異常[1].由于其具有分子量小、熱穩(wěn)定性強(qiáng)、水溶性好、無免疫原性、抗菌譜廣、強(qiáng)堿性等特點,是構(gòu)成其自身免疫體系的重要組分,能非特異性地抗細(xì)菌、真菌、病毒、寄生蟲等病原體,對腫瘤細(xì)胞、多重耐藥菌也有明顯的殺傷作用,且對正常生物體細(xì)胞無害,作用的機(jī)理非常獨特[1,2],不易引起微生物的耐藥性,是一類具有巨大發(fā)展?jié)摿Φ男滦涂咕幬?

與傳統(tǒng)抗生素相比,昆蟲抗菌肽的抗菌活性還不夠理想[3,4],改造已有抗菌肽和設(shè)計新抗菌肽分子是創(chuàng)造高活力抗菌肽的有效途徑[5,6].這就需要進(jìn)一步研究抗菌肽結(jié)構(gòu)與活性的關(guān)系和作用機(jī)理,為抗菌肽分子的改造和設(shè)計提供足夠的理論依據(jù).本文擬對家蠅defensin抗菌肽通過生物信息學(xué)手段進(jìn)行分析,以為下一步抗菌肽分子的改造和設(shè)計提供基本的理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 defensin抗菌肽序列的獲得

以家蠅 defensin序列 (GenBank登錄號：AY260152.1)為模板在NCBI中搜索相似序列獲得不同種類的defensin抗菌肽的序列,其如表1所示.

表1 不同種類defensin抗菌肽的一級結(jié)構(gòu)分析

1.2 研究方法

defensin基因及其編碼的蛋白的一級結(jié)構(gòu)用Proparam預(yù)測,導(dǎo)肽預(yù)測使用T arget P1.1 Server;信號肽預(yù)測使用SignalIP工具,二級結(jié)構(gòu)采用 TMHMM2. 0SERVER分析,保守結(jié)構(gòu)域分析采用NCBI鏈接的CDD分析,三維立體結(jié)構(gòu)采用Cn-3D軟件分析等.

2 結(jié)果與分析

2.1 defensin抗菌肽的一級結(jié)構(gòu)分析

由表1中數(shù)據(jù)可以看出,昆蟲的defensin抗菌肽都是由常見的20種氨基酸組成,都不含有O、U、B、Z、X這5種氨基酸,個別還不含有色氨酸(W),一般均含有7個左右的半胱氨酸(Cys)殘基,可形成3個及以上的分子內(nèi)二硫鍵.電荷數(shù)分析表明,不同來源的defensin抗菌肽的電荷數(shù)也不相同,即出現(xiàn)了不帶電或帶負(fù)電荷的defensin抗菌肽.

2.2 defensin抗菌肽的二級結(jié)構(gòu)分析

分析表明,蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)為多肽鏈本身的折疊和盤繞(見表2).

表2 不同種類defensin抗菌肽的二級結(jié)構(gòu)分析

由表2的結(jié)果可知,多數(shù)defensin抗菌肽中,α-螺旋是其主要構(gòu)成元件,少數(shù)如煙草天蛾的主要構(gòu)成元件則是無規(guī)則卷曲.

2.3 defensin抗菌肽的信號肽及導(dǎo)肽的分析

通常,分泌蛋白及細(xì)胞膜蛋白均以前體物質(zhì)多肽的形式合成,其N末端含有作為通過膜時之信號的氨基酸序列,這種氨基酸序列被稱為信號肽或信號序列.對蛋白的信號肽及導(dǎo)肽進(jìn)行預(yù)測可正確認(rèn)識蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位和其作用.用Signal IP和target P分析表明(見表3),defensin抗菌肽均屬于信號肽序列,且信號肽的剪切位點均位于25左右,符合信號肽的概念.

表3 defensin抗菌肽的導(dǎo)肽及信號肽預(yù)測結(jié)果

2.4 defensin抗菌肽跨膜結(jié)構(gòu)的預(yù)測

跨膜結(jié)構(gòu)域是膜中蛋白與膜脂結(jié)合的主要部位,一般由20個左右的疏水氨基酸殘基組成,形成α-螺旋與膜脂相結(jié)合.預(yù)測和分析跨膜結(jié)構(gòu)域,對認(rèn)識蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、功能、分類以及在細(xì)胞中的作用部位均有一定的意義.用TMHMM 2.0 SERVER預(yù)測跨膜結(jié)構(gòu)的結(jié)果表明,家蠅(見圖1)及其他物種的defensin抗菌肽均不跨膜.

圖1 家蠅defensin抗菌肽跨膜結(jié)構(gòu)的預(yù)測

2.5 defensin抗菌肽的保守結(jié)構(gòu)域分析

蛋白質(zhì)由多個模體組成,組成這些模體的氨基酸區(qū)段行使特異的功能,同時還蘊(yùn)含著各自的遺傳進(jìn)化信息.利用NCBI鏈接的CDD分析家蠅及其他物種的defensin抗菌肽序列的保守結(jié)構(gòu)域,得到了一致的結(jié)果(見圖2),屬于Defensin-2 superfamily家族.

圖2 家蠅defensin抗菌肽序列的保守結(jié)構(gòu)域

2.6 defensin抗菌肽的三維結(jié)構(gòu)

defensin抗菌肽的三維結(jié)構(gòu)如圖3所示.

圖3 家蠅defensin抗菌肽的三維結(jié)構(gòu)圖

從圖3中可看出,家蠅及其他物種的defensin抗菌肽中α-螺旋是其最主要的結(jié)構(gòu)元件,并且在其N-端和C-端均有大量的α-螺旋(其余圖未顯示).

3 討論與結(jié)論

抗菌肽一直被認(rèn)為帶有正電荷,并與帶負(fù)電荷的微生物細(xì)胞膜相互作用從而發(fā)揮抗菌功能.然而,從defensin抗菌肽的一級結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn),果蠅和埃及伊蚊不帶電,而廄鰲蠅、家蠶和煙草天蛾甚至帶的是負(fù)電荷.果蠅和埃及伊蚊雖然不帶電荷,但是顯疏水性.據(jù)此推測：既然沒有正負(fù)電荷間的相互作用力,所以疏水性作用力起主要作用,即疏水作用力使此抗菌肽與細(xì)菌細(xì)胞膜靠近接觸,從而發(fā)揮作用.

廄鰲蠅、家蠶的defensin抗菌肽雖然帶的是負(fù)電荷,然而疏水性相對數(shù)值比果蠅和埃及伊蚊大,尤其是負(fù)電荷帶的越多其疏水性數(shù)值越大,由此可以推測：此兩種昆蟲defensin的疏水性作用力大于負(fù)電荷間的相互排斥力,故同樣可以是蛋白和細(xì)菌細(xì)胞膜接觸結(jié)合.

煙草天蛾defensin,不僅帶負(fù)電荷,而且是親水性蛋白.信號肽分析結(jié)果表明,其N端有信號肽鏈,發(fā)揮作用時,信號肽引導(dǎo)其至作用位點,然后在其肽鏈第29～30(SVA-FE)氨基酸之間斷裂.分析其二級結(jié)構(gòu)表明,其主要構(gòu)成元件是無規(guī)則卷曲,這類有序的非重復(fù)性結(jié)構(gòu)經(jīng)常構(gòu)成酶活性部位及蛋白質(zhì)特異的功能部位,故推測其可能為酶類,作用于細(xì)胞膜表面的膜蛋白.經(jīng)過protfun 2.2serve蛋白功能分析,結(jié)果顯示其是一個參與運輸及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的酶類蛋白,而此類抗菌肽的作用機(jī)制很可能與抗菌肽對細(xì)菌胞內(nèi)酶結(jié)構(gòu)與功能對細(xì)菌胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響有關(guān).

[1]王義鵬,賴 仞.昆蟲抗菌肽結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和基因調(diào)控[J].動物學(xué)研究,2010,31(1)：27-34.

[2]蔡 祿.生物信息學(xué)教程[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社, 2007.

[3]吳 希,張雙全.抗菌肽對細(xì)菌殺傷作用的分子機(jī)制[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展,2005,32(12)：1109-1113.

[4]盧曉風(fēng),楊星勇.昆蟲抗菌肽及其研究進(jìn)展[J].藥學(xué)學(xué)報,1999,34(2)：673-678.

[5]耿 華,安春菊,郝友進(jìn),等.昆蟲抗菌肽的結(jié)構(gòu)和功能研究現(xiàn)狀[J].生物學(xué)通報,2004,39(10)：1-4.

[6]王學(xué)理,王興龍,劉 鍇,等.抗菌肽的作用機(jī)制與應(yīng)用前景[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2006,27(9)：42-45.

Sequence Characteristic Analysis of Defensin Antimicrobial Peptides

SUN Yanxia,WU Xiaoyong,HE Gang,SONG Qin,WANG Yuehua

(Key Laboratory of Medical Microbial Resources,Chengdu University,Chengdu 610106,China)

Defensin antimicrobial peptides were analyzed by bioinformatics tools.Primary structure shows that the defensin has typical characteristics of insect defense.Secondary structure analysis shows that the main defensin antimicrobial peptides are alpha helix structure components,but there is an exception.The signal and target peptide analysis shows that defensin antimicrobial peptides belong to secrete protein.After the analysis of different species of defensin antimicrobial peptides,the results show that the mechanism of non-cation antimicrobial peptides is that hydrophobic force plays a leading role or antimicrobial peptides influence the structure and function of enzymes and signal transduction in bacteria cell.

defensin antimicrobial peptides;sequence characteristics;mechanism

Q74

：A

1004-5422(2010)02-0101-03

2009-12-25.

成都大學(xué)科技基金資助項目.

孫雁霞(1976—),女,博士研究生,講師,從事生物技術(shù)研究.