大鼠腎小球系膜細(xì)胞活性氧簇JAK2/STAT5通路與TIMP-1之間的關(guān)系及對其凋亡的影響

溫文斌 林洪麗 吳泰華 馬艷梅 夏麗華 單路娟

大鼠腎小球系膜細(xì)胞活性氧簇JAK2/STAT5通路與TIMP-1之間的關(guān)系及對其凋亡的影響

溫文斌1林洪麗2*吳泰華2馬艷梅3夏麗華4單路娟2

目的:探討高糖(HG)條件下大鼠腎小球系膜細(xì)胞(RMC)活性氧簇(ROS)、JAK2/STAT5信號通路與金屬蛋白酶1組織抑制劑(TIMP-1)之間的關(guān)系及對其凋亡的影響。方法:在HG培養(yǎng)條件下的RMC中,根據(jù)是否使用DPI(NADPH氧化酶特異性抑制劑,可抑制ROS產(chǎn)生)和AG490(JAK 2特異性抑制劑)刺激24 h,將 RMC分為 HG組、HG+AG490組、HG+DPI組和 HG+AG490+DPI組四組。采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測各組細(xì)胞的凋亡率,RT-PCR檢測各組RMC Bcl-xl、Cyclin D1、P27kip1、JAK 2和TIMP-1m RNAs的表達(dá),Western blot檢測胞漿中JAK2、STAT5及相應(yīng)磷酸化蛋白的表達(dá)。結(jié)果:HG組、HG+AG490組、HG+DPI組和HG+AG490+DPI組的細(xì)胞總凋亡率分別為:(10.69±0.26)%、(20.52±0.51)%、(24.56±0.36)%和(26.01±0.28)%;加入 AG490和(或)DPI后 RMC總凋亡率明顯升高(P＜0.01),Bcl-xl、Cyclin D1、JAK 2和TIMP-1m RNAs表達(dá)顯著減少,P27kip1mRNA表達(dá)增加。AG490和(或)DPI可使各組RMC P-JAK 2和P-STAT5的表達(dá)顯著減少,尤其在加入DPI后減少更加明顯。結(jié)論:HG條件下JAK 2/STAT5信號通路受ROS調(diào)控;阻斷ROS生成和(或)JAK 2/STA T5信號通路,可使RMC TIMP-1mRNA表達(dá)減少,凋亡增加。

系膜細(xì)胞;活性氧簇;JAK 2/STA T5信號通路;金屬蛋白酶1組織抑制劑;凋亡

近年來隨著我國人均壽命的延長,生活飲食習(xí)慣和結(jié)構(gòu)的改變,糖尿病的患病率迅猛上升。糖尿病腎病是其常見的嚴(yán)重并發(fā)癥,目前已逐漸成為尿毒癥透析患者的主要病因。研究表明,在糖尿病腎病中高糖(HG)可使活性氧簇(ROS)產(chǎn)生增加,引起腎臟氧化應(yīng)激,并可經(jīng)JAK s/STA Ts通路刺激細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生增加[1]。而金屬蛋白酶1組織抑制劑(TIMP-1)可通過抑制組織基質(zhì)金屬蛋白酶的活性,也可導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)積聚。我們前期研究[2]將正義和反義全長TIMP-1 cDNA轉(zhuǎn)染至大鼠腎小球系膜細(xì)胞(RMC),發(fā)現(xiàn)在無血清條件下,TIMP-1可在蛋白水平上激活JAKs/STATs信號通路,導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)積聚和RMC凋亡減少。但在HG刺激下,阻斷ROS生成和JAK 2/STAT5信號通路是否會通過TIMP-1對 RMC凋亡產(chǎn)生影響,目前尚不清楚。本文以 RMC為研究對象,探討HG條件下加入NADPH氧化酶特異性抑制劑DPI和 JAK 2的特異性抑制劑 AG490后,ROS、JAK 2/STAT5信號通路與TIMP-1之間的關(guān)系及對RMC凋亡的影響,以期進(jìn)一步明確糖尿病腎病系膜細(xì)胞增生和細(xì)胞外基質(zhì)積聚的機(jī)制,為糖尿病腎病的治療提供新的可能靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

大鼠腎小球系膜細(xì)胞系(RMC)(解放軍總醫(yī)院腎內(nèi)科暨全軍腎臟病重點(diǎn)實驗室陳香美院士惠贈)。RPM I1640培養(yǎng)基(美國Gibco),胎牛血清(FCS)(天津血研所),96孔板(加拿大JET Biochemicals)。AG490(JAK 2特異性抑制劑)(美國BioSource),DPI(NADPH氧化酶特異性抑制劑)(美國Sigma),M TT(加拿大 Bioshop),凋亡試劑盒(美國BD)。T rizol試劑(美國 Invitrgen),RTPCR試劑盒、大鼠基因引物(大連寶生物)。JAK 2、STAT5及相應(yīng)磷酸化蛋白多克隆抗體,化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)(美國Santa Cruz);小鼠抗大鼠β-actin多克隆抗體(武漢博士德)。PCR儀(美國M J Reserch),凝膠成像分析系統(tǒng)(美國PALL)。

1.2 方法

1.2.1 M TT法確定實驗中AG490和DPI的合適實驗濃度:將常規(guī)培養(yǎng)的RMC,在對數(shù)生長期中制成含0.5%FCS的細(xì)胞懸液,以1×104個/孔接種于96孔板內(nèi),同步化12 h后換10%FCS培養(yǎng)基(分別含 0 μmol/L、25 μm ol/L、50 μmol/L 、100 μm ol/L的 AG490;或者分別含 0μmo l/L、0.16 μm ol/L 、0.32 μmol/L 、0.64 μmol/L 、1.28 μmol/L和 2.56μmol/L的DPI)培養(yǎng)20 h,再在各孔中分別加入M TT繼續(xù)培養(yǎng)4 h后在570 nm波長下檢測各孔吸光度值。

1.2.2 實驗分組:常規(guī)培養(yǎng)的RMC達(dá)80%融合時,將細(xì)胞隨機(jī)分成HG組(Glucose 25 mm ol/L)、HG+AG490組(Glucose 25 mmol/L+AG490 50 μm ol/L)、HG+DPI組(G lucose 25 mmo l/L+DPI 0.32μmol/L)和 HG+AG490+DPI組(Glucose 25mmol/L+AG490 50μmol/L+DPI0.32μm ol/L)四組。以上各組均換用含 0.5%FCS的 RPM I1640培養(yǎng)基同步化12 h后,換用含10%FCS的RPM I1640培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,進(jìn)行實驗。

1.2.3 流式細(xì)胞技術(shù)檢測各組RMC凋亡率:收集各組細(xì)胞,PBS漂洗 2次,用預(yù)冷的 binding bu ffer以106/m L的細(xì)胞密度重懸,加入Annexin-V-FITC和PI試劑各5μL,混勻,室溫避光孵育15 min,加入 binding buffer上機(jī),激發(fā)光波長488 nm,檢測細(xì)胞凋亡率。實驗重復(fù)3次。

1.2.4 RT-PCR 檢測大鼠 TIMP-1、Bcl-x l、Cyclin D 1、P27kip1和JAK 2 mRNA s的表達(dá):用T rizol試劑按標(biāo)準(zhǔn)程序提取各組 RMC總RNA,分光光度計定量總RNA含量。用RT-PCR試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA,在PCR儀上擴(kuò)增。引物序列及反應(yīng)條件見表1。PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳,凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析。

1.2.5 Western b lot檢測各組 RMC JAK 2、STAT5及相應(yīng)磷酸化蛋白的表達(dá):提取各組RMC總蛋白,采用Bradford考馬氏亮藍(lán)法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。蛋白樣本在100℃下變性8 min,用7.5%的聚丙烯酰胺凝膠電泳,半干電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上,5%的脫脂奶粉37℃封閉1 h后加入一抗[兔抗大鼠JAK 2、STAT5多克隆抗體,山羊抗大鼠 P-JAK 2(Tyr1 007/Tyr1 008)、P-STAT5(Tyr694)多克隆抗體,小鼠抗大鼠β-actin多克隆抗體,均為1∶800]4℃過夜。洗膜后37℃結(jié)合二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記兔抗小鼠IgG 1∶1 000,山羊抗兔、兔抗山羊IgG 1∶30 000)1 h,用ECL化學(xué)發(fā)光試劑在X線膠片上曝光、顯影、定影。以βactin為內(nèi)參照,用凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析。

表1 各基因引物序列、擴(kuò)增片段大小和PCR反應(yīng)條件

2 結(jié)果

2.1 M TT法測定實驗中合適的AG490和DPI使用濃度

與正常培養(yǎng)條件下的RMC相比,加入AG490的RMC的吸光度值隨 AG490濃度的增加而減少,當(dāng)AG490濃度≥50μmol/L時,具有統(tǒng)計學(xué)差異;加入DPI的RMC吸光度值隨DPI濃度增大而減小,當(dāng) DPI濃度≥0.32μm ol/L時,與不加 DPI的RMC吸光度值相比,具有統(tǒng)計學(xué)差異(見圖1)。因此我們在本實驗中選取50μmol/L、0.32μmol/L分別作為AG490、DPI的合適實驗濃度。

2.2 流式細(xì)胞技術(shù)檢測RMC凋亡

各組RMC經(jīng)流式細(xì)胞儀凋亡檢測發(fā)現(xiàn),在HG條件下,加入AG490和(或)DPI作用24 h后,各組細(xì)胞的總凋亡率(早期凋亡率+晚期凋亡率)均明顯增加(見表2)。

2.3 RT-PCR 檢 測 RMC Bcl-xl、Cyclin D1、P27kip1、JAK2和 TIMP-1m RNAs的表達(dá)

與HG組RMC相比,加入AG490和(或)DPI后,抑制細(xì)胞凋亡基因Bcl-xl、Cyclin D1 mRNA s表達(dá)顯著減少,促進(jìn)凋亡基因P27kip1 mRNA表達(dá)增加,均有明顯統(tǒng)計學(xué)差別,P＜0.01(見圖2～圖4);JAK 2、TIMP-1 m RNAs表達(dá)顯著降低(P＜0.01)(見圖5～圖6)。

2.4 Western blot檢測JAK 2/STAT5信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)

我們利用Western blot檢測各組RMC,結(jié)果發(fā)現(xiàn),加入 AG490和(或)DPI后,JAK 2及其下游的STAT5在各組細(xì)胞中的表達(dá)均無變化。我們進(jìn)一步檢測了其相應(yīng)磷酸化蛋白的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn):在HG環(huán)境中,加入AG490和(或)DPI刺激24 h后,與HG組RMC相比,各組 RMC P-JAK2和P-STAT 5的表達(dá)均顯著減少(P＜0.01)(見圖7～圖8)。

表2 流式細(xì)胞技術(shù)檢測各組RMC的凋亡率 (%)

3 討論

近年來的研究表明,氧化應(yīng)激在糖尿病腎病的發(fā)生和發(fā)展中具有重要作用。在糖尿病腎病中,HG可使ROS產(chǎn)生增加,激活JAKs/STATs信號通路,引起腎小球系膜細(xì)胞增殖、細(xì)胞外基質(zhì)積聚,導(dǎo)致糖尿病腎臟損害不斷進(jìn)展[1]。TIMP-1通過抑制組織基質(zhì)金屬蛋白酶活性,引起細(xì)胞外基質(zhì)積聚。但在糖尿病腎病的氧化應(yīng)激機(jī)制中是否存在T IMP-1參與,在 HG 條件下 ROS、JAK2/STAT5信號傳導(dǎo)通路和 TIMP-1之間有何關(guān)系,它們對RMC凋亡有何影響,目前尚不清楚。

我們應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測RMC凋亡結(jié)果顯示:在HG條件下,加入 AG490和(或)DPI后,各組RMC的總凋亡率顯著增加,尤其在加入DPI后更為明顯。我們前期研究結(jié)果表明:JAKs/STATs信號通路具有抑制細(xì)胞凋亡的作用,加入AG490對其阻斷后可增加細(xì)胞總凋亡率[2]。氧化應(yīng)激激活后既可活化JAKs/STATs通路[3],還可激活PI3K/AKT通路[4]和M EK/ERK信號傳導(dǎo)通路[5]。上述三條細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路均可發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡的作用[6～8]。因此抑制氧化應(yīng)激的發(fā)生,可同時抑制上述三條信號通路的活化,更加明顯地引起RMC發(fā)生凋亡。

DPI可抑制細(xì)胞中NADPH氧化酶活性,使ROS產(chǎn)生減少,氧化應(yīng)激受到抑制[9]。我們通過RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn),在HG培養(yǎng)條件下的RMC培養(yǎng)基中使用DPI后,JAK 2 mRNA表達(dá)顯著減少(P＜0.01)。上述研究提示:JAK 2/STAT5信號傳導(dǎo)通路受氧化應(yīng)激調(diào)控;在 HG條件下阻斷ROS生成,可抑制JAK 2/STAT5信號通路激活。

我們通過 RT-PCR檢測還發(fā)現(xiàn),在 HG組RMC培養(yǎng)基中加入AG490后TIM P-1 m RNA表達(dá)也顯著減少(P ＜0.01),表明TIMP-1表達(dá)受JAK 2/STAT5信號傳導(dǎo)通路調(diào)控。

細(xì)胞周期蛋白Cyclin D1S可抑制細(xì)胞凋亡,細(xì)胞周期蛋白激酶抑制劑P27kip1則可通過拮抗前者起到抑制細(xì)胞周期、促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用[10]。我們通過RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn),加入AG490和(或)DPI后凋亡抑制基因 Bcl-xl、Cyclin D1 m RNAs表達(dá)顯著減少,凋亡促進(jìn)基因P27kip1 m RNA表達(dá)卻明顯增加。上述研究結(jié)果很可能是HG條件下阻斷JAK 2/STAT5信號通路和(或)ROS產(chǎn)生后引起RMC凋亡的原因之一。

通過Western blot檢測發(fā)現(xiàn),在HG條件下,RMC培養(yǎng)基中加入AG490和(或)DPI,均可使PJAK 2和P-STAT5表達(dá)顯著下調(diào),且在DPI加入后下調(diào)更加明顯。結(jié)合我們前期實驗結(jié)果[3]可知,加入AG490阻斷JAKs/STA Ts信號通路后,TIMP-1表達(dá)下降,從而使T IMP-1在蛋白水平上對上述信號通路的反饋激活受到抑制,更加促進(jìn)了上述磷酸化蛋白表達(dá)減少。加入DPI阻斷ROS生成后,上述蛋白表達(dá)降低較加入AG490后更為明顯,提示氧化應(yīng)激抑制后可能通過除抑制JAK 2/STAT5信號通路外的其它途徑起到下調(diào)上述磷酸化蛋白表達(dá)的作用。

目前國內(nèi)外尚未見到 HG條件下 ROS、JAK 2/STAT5信號傳導(dǎo)通路和TIMP-1關(guān)系的文獻(xiàn)報道。上述研究進(jìn)一步探討了糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展的氧化應(yīng)激機(jī)制,為糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制填充了新的內(nèi)容。

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The Relationship Among ROS,JAK 2/STAT5 Signal Pathway and TIMP-1 and the Ef fect of them on Apoptosis in RatMesangial Cells

W enW enbin,Lin H ongli,Wu Taihua,et al.
Departmento f Nephrology,Heji Hospita l,Changzhi Medical College

Ob jective:To investigate the relationship among Reactive Oxygen Species(ROS),JAK2/STAT5 signal pathw ay and TIMP-1 and the effectof them on apoptosis in ratmesangial cells under the condition of high glucose.Methods:A fter RMC w as stimulated w ith HG,DPI(specific inhibitoro f NADPH oxidase)and AG 490(specific inhibitor of JAK 2)for 24 hours,the tota l apop tosis rate of RMC w asmeasured by flow cy tometry.The exp ression of Bcl-xl,Cyclin D1,P27kip1,JAK 2 and TIMP-1m RNAs was assayed by RT-PCR.The expression of JAK 2,STAT5,P-JAK 2 and P-STAT5 proteinsw as analysed by W estern b lot.Resu lts:The total apop tosis rates of HG,G+AG 490,HG+DPIand HG+AG490+DPIgroupsw ere(10.69±0.26)%,(20.52±0.51)%,(24.56±0.36)%and(26.01±0.28)%,respectively.AG 490 and(or)DPI treatment enhanced the apoptosis(P＜0.01)and the exp ression of P27kip1 mRNA,however,it obviously decreased the exp ression of Bcl-xl,Cyclin D1,JAK 2,TIMP-1mRNAs and the exp ression of P-JAK 2 and P-STAT5 p roteins in RM C.Conclusion:Under the condition of high glucose,JAK 2/STAT5 signal pathw ay could be regulated by ROS;the inhibition of ROSand(or)JAK2/STAT5 signal pathway decreased the exp ression of TIMP-1 mRNA and increased apop tosis rate in RMC.

Mesangial cells;Reactive Oxygen Species;JAK 2/STAT5 signal pathway;Tissue inhibitor o fmelallop roteinase 1;Apop tosis

R587.24

A

1006-(2010)05-321-05

1長治醫(yī)學(xué)院附屬和濟(jì)醫(yī)院腎內(nèi)科(046011) 2大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 3長治醫(yī)學(xué)院附屬和濟(jì)醫(yī)院消化內(nèi)科 4內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院

國家自然科學(xué)基金(30470805)

* 通訊作者

2010-08-14;

2010-08-27)