開心散與去茯苓開心散改善擬AD動物學習記憶作用比較

高冰冰，徐淑萍，劉新民，王立為

(中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院藥用植物研究所，北京 100193)

開心散與去茯苓開心散改善擬AD動物學習記憶作用比較

高冰冰，徐淑萍，劉新民，王立為

(中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院藥用植物研究所，北京 100193)

目的 比較開心散和去茯苓開心散對AD動物模型學習記憶的改善作用，了解茯苓在開心散復方中的作用。方法 連續(xù)皮下注射D－半乳糖12周，第9周同時給予中藥，第12周開始行為學檢測。比較開心散及去茯苓開心散對擬AD動物學習記憶的改善作用;檢測腦組織皮層區(qū)乙酰膽堿酯酶(AchE)、超氧化物歧化酶(SOD)的活力以及丙二醛(MDA)的含量。結果 開心散能顯著改善模型動物學習記憶能力;降低模型動物腦組織皮層區(qū)乙酰膽堿酯酶活力，升高超氧化物歧化酶活力，降低丙二醛含量;而去除茯苓的開心散對模型動物的學習記憶能力沒有改善作用或作用減弱。結論 開心散復方具有改善擬AD動物模型學習記憶障礙的作用，而茯苓是開心散復方中起重要作用的成分。

擬老年性癡呆模型;D－半乳糖+東莨菪堿模型;昆明小鼠;開心散;茯苓

阿爾茨海默病(Alzheimer＇s disease，AD)已成為嚴重威脅人類健康、影響社會發(fā)展和穩(wěn)定的重要因素。隨著老齡化社會的到來，AD的發(fā)病率逐年升高，老年性疾病已成為社會關注和相關學科研究的熱點。目前 AD仍缺乏有效的治療藥物，尋找有效的AD治療藥物是當前神經藥理學研究的熱點領域之一。

開心散始載于《備急千金藥方》，由人參、遠志、茯苓、菖蒲4味藥材組成，主治“心氣不定，五臟不足，甚者憂愁悲傷不樂，忽忽喜忘，朝差暮劇，暮差朝發(fā)狂眩”。其中，人參用于大補元氣、健腦益智;茯苓用于養(yǎng)心安神、健脾利濕;遠志、菖蒲用于化痰開竅、健腦醒神［1］。經過古人長期的臨床實踐，開心散具有良好的益智作用?，F(xiàn)代藥理研究表明，開心散能夠改善不同擬AD模型動物的學習記憶能力，顯示了在促智方面良好的應用前景［2－5］。本實驗旨在通過比較開心散以及去除茯苓的開心散改善擬AD動物學習記憶作用的不同，來說明茯苓在開心散復方中發(fā)揮的作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級KM雄性小鼠90只，28～30 g，購自中國醫(yī)學科學院實驗動物中心［SCXK(京)2009－0007］，于本所 SPF動物房中飼養(yǎng)，實驗室溫度 22℃～25℃，明暗周期 12 h/12 h。

1.2 實驗用藥及試劑

人參、遠志、石菖蒲、茯苓水煎劑均由本所藥植化室潘瑞樂老師提供;D－半乳糖(D－galactose，D－gal)為Sigma公司產品;東莨菪堿(Scopolamine，Scop)購于 Fluka公司，生產批號:2040506;AchE、SOD、MDA測試試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，生產批號:20091224。

1.3 主要儀器

跳臺以及小鼠圓形水迷宮計算機圖像實時檢測分析處理系統(tǒng)均由中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所、中國航天員科研訓練中心、北京三維拓盟數(shù)字影像技術有限公司聯(lián)合研制。

1.4 動物分組及給藥劑量

將90只KM雄性小鼠隨機分為6組，分別為正常對照組、D－gal+Scop模型組、開心散高劑量組(KXSG:10 g/kg)、開心散低劑量組(KXSD:5 g/kg)、去茯苓開心散高劑量組(QFLKXSG:7 g/kg)、去茯苓開心散低劑量組(QFLKXSD:3.5 g/kg)，15只/組。

1.5 AD動物模型的建立

除正常對照組皮下注射生理鹽水外，其他各組連續(xù)皮下注射 D－gal(150 mg/kg)12 周［6－11］，第 9 周皮下注射D－gal的同時灌胃給予中藥，第12周開始行為學測試，每天測試前30 min腹腔注射Scop(3.0 mg/kg)［12，13］。

1.6 行為學檢測

1.6.1 Morris水迷宮測試［14－16］:給藥第 12 周，開始Morris水迷宮測試，以測定動物的空間學習記憶能力，迷宮水溫控制在25℃ ±1℃，水池外有固定參照物如門、窗、掛件等，每次試驗位置保持不變。測試分為兩個階段，首先是定位航行試驗:試驗前30 min腹腔注射Scop，訓練開始時，將實臺置于固定象限(第四象限)，然后將動物置于平臺上適應環(huán)境20 s，之后分別從第一和第二兩個象限將動物面向池壁放入水池，計算機圖像實時檢測分析處理系統(tǒng)自動記錄動物在60 s內找到平臺的時間(逃避潛伏期)，如果動物在60 s內找不到平臺，則將其引導至平臺上適應10 s，潛伏期記錄為60 s，再進行下次實驗。每天訓練2次，共訓練7 d，計算每天每組動物中找到平臺的小鼠所占百分比即游出率。第8天進行空間探索試驗:在撤除平臺后，從第一象限將動物面向池壁放入水中，計算機圖像實時檢測分析處理系統(tǒng)記錄動物60 s內在原實臺象限的游程比(在第四象限的游程/總游程)和時間比(在第四象限的游泳時間/總時間)。

1.6.2 跳臺測試:Morris水迷宮測試結束后，動物休息兩天進行跳臺測試［17，18］。測試分為兩個階段，即記憶獲得和記憶鞏固。記憶獲得:先將動物輕放入箱內熟悉環(huán)境2 min，測試開始時，將動物置于銅網上，開始通電，記錄動物受到電刺激后第一次逃避到臺上的潛伏期、5 min內停留在臺上的時間(安全區(qū)時間)、受電刺激的時間(錯誤區(qū)時間)，以此作為學習成績。24 h后進行記憶鞏固測試:將動物置于安全平臺上，即刻通電，檢測5 min，記錄動物第一次跳下平臺的時間(潛伏期)、安全區(qū)時間、錯誤區(qū)時間，以此作為記憶成績。

1.7 腦組織生化指標的檢測

跳臺檢測完畢后，將動物斷頭處死，在4℃冰袋上立即將動物腦組織取出，在預冷的生理鹽水中漂洗，除去血液，分離出皮層，稱重后制成10%的組織勻漿液，并用冷凍離心機在 4℃條件下以3000 r/min，離心10 min，取上清置 2mL帶蓋離心管中于－80℃保存，試劑盒檢測 AchE、SOD活力及MDA 含量［3，19，20］。

1.8 統(tǒng)計學方法

使用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析，實驗結果以均數(shù)±標準誤表示。采用兩樣本t檢驗和非參數(shù)檢驗(Mann－Whitney Test)進行兩兩比較，采用單因素方差分析(ANOVA)進行多組間比較，組間差異采用LSD(方差齊)或者 Games－Howell法(方差不齊)。

2 結果

2.1 KXS和QFLKXS對擬AD小鼠空間學習記憶能力的影響

Morris水迷宮定位航行實驗中，隨著訓練時間的延長，各組游出率逐漸升高，但 D－gal+Scop組游出率上升幅度明顯小于正常對照組(P＜0.01)，D－gal+Scop組訓練前5 d游出率不超過10%，第7天僅30%小鼠找到平臺。第3天起KXSG組的游出率較 D－gal+Scop組明顯升高(P＜0.01或 P＜0.05)，而 QFLKXSG和 QFLKXSD組則與 D－gal+Scop組相近，差異不顯著(表1)。同時，D－gal+Scop組小鼠的逃避潛伏期較正常對照組顯著延長(P＜0.01)，提示模型動物的空間位置學習記憶能力均明顯下降。KXSG、KXSD組能不同程度提高D－gal+Scop小鼠的學習記憶能力，表現(xiàn)為潛伏期顯著縮短(P＜0.05);而 QFLKXS組與 D－gal+Scop組比較差異不顯著(表2)。空間探索實驗中，D－gal+Scop組與正常對照組比較空間探索能力明顯較弱(P＜0.01或 P＜0.05)，KXS有改善 D－gal+Scop小鼠的空間探索能力，但差異不顯著(表3)。

表1 KXS和QFLKXS對D－gal+Scop導致的學習記憶障礙小鼠游出率的影響(n=15)Tab.1 Effect of KXS and QFLKXS on the percentage of finding the security desk of ammines mice induceded by D－gal+Scop(n=15)

表2 KXS和QFLKXS對D－gal+Scop導致的學習記憶障礙小鼠潛伏期的影響 (n=15)Tab.2 Effect of KXS and QFLKXS on the escape latency of ammines mice induced by D－gal plus scop(n=15)

表3 KXS和QFLKXS對D－gal+Scop導致的學習記憶障礙小鼠在目標象限游程比、時間比的影響 (n=15)Tab.3 Effect of KXS and QFLKXS on the ratio of swimming distance in target quadrant and total swimming distance，the ratio of swimming time in target quadrant and total swimming time of ammines mice induced by D－gal+scop(n=15)

2.2 跳臺測試結果

記憶獲得階段，D－gal+Scop組較正常對照組潛伏期明顯延長，安全區(qū)時間縮短，錯誤區(qū)時間延長，各指標均有極顯著性差異(P＜0.01)，提示其被動逃避電刺激能力顯著下降;KXSG、KXSD組以及QFLKXSG組均能不同程度提高模型小鼠學習記憶能力，表現(xiàn)為潛伏期縮短，安全區(qū)時間延長，錯誤區(qū)時間減少，差異極顯著(P＜0.01);而QFLKXSD組則無此改善作用(表4)。記憶鞏固測試結果顯示，D－gal+Scop組的記憶保持能力較正常對照組下降，安全區(qū)時間縮短、錯誤區(qū)時間延長，給藥組能夠不同程度改善模型小鼠的學習記憶能力，但沒有統(tǒng)計學差異。

表4 KXS和QFLKXS對D－gal+Scop導致的學習記憶障礙小鼠的記憶獲得能力的影響 (n=15)Tab.4 Effect of KXS and QFLKXS on the memory acquisition of ammines mice induced by D－gal+Scop(n=15)

2.3 腦組織皮層生化指標測定結果

2.3.1 KXS與QFLKXS對模型小鼠大腦皮層AchE活力的影響(表5):D－gal+Scop組AchE活力比正常對照組顯著升高(P＜0.01)，KXSG、KXSD組能夠降低模型組小鼠大腦皮層AchE活力的升高(P＜0.01)，而QFLKXSG、QFLKXSD組的作用減弱(P＜0.05)。

2.3.2 KXS與QFLKXS對模型小鼠大腦皮層SOD活力、MDA含量的影響(表5):與正常對照組比較，D－gal+Scop組SOD活力下降、MDA含量升高，差異非常顯著(P＜0.01);KXSG、KXSD組能顯著升高SOD活力、降低 MDA含量(P＜0.01);相比之下，QFLKXSG、QFLKXSD發(fā)揮的這種作用則要明顯降低(P＜0.01或 P＜0.05)。

表5 腦組織皮層AchE、SOD活力以及MDA含量檢測結果 (n=15)Tab.5 The vitality of AchE and SOD;the level of MDA in cortex(n=15)

3 討論

AD是一種以進行性認知障礙和記憶力損害為主的中樞神經系統(tǒng)退行性疾病，早期主要表現(xiàn)為短時記憶損害、空間辨別能力等障礙。發(fā)病機制已提出的有:膽堿能假說、淀粉樣蛋白假說、基因突變假說、炎癥免疫假說等?；谶@些假說研究者已建立起相應動物模型包括:藥物損傷膽堿能神經系統(tǒng)，腹腔注射東莨菪堿可阻斷乙酰膽堿M受體，引起記憶損失;應用造成代謝紊亂方法制作AD模型:D－半乳糖促使動物快速老化，在短時間內造成亞急性衰老動物模型;腦內注射 β－淀粉樣蛋白;應用神經毒性興奮性氨基酸造成AD動物模型等，但是以上單因素模型造成的損傷不能夠造成動物的病理性損傷，因此很難模擬 AD 患者的臨床特征［6，21］。本實驗通過D－半乳糖+東莨菪堿建立AD復合模型，采用經典的 Morris水迷宮和跳臺實驗，對 KXS和QFLKXS改善AD小鼠空間學習記憶能力進行了評價。實驗結果表明，D－gal+Scop復合模型能夠有效地損傷正常動物的空間學習記憶能力，與正常小鼠比較，學習記憶能力減退，表現(xiàn)為Morris水迷宮逃避潛伏期延長，游出率上升緩慢;跳臺實驗中的逃避電刺激的潛伏期延長、記憶獲得階段第一次跳下平臺的潛伏期縮短等。

中樞學習和記憶以及認知功能的正常發(fā)揮與中樞膽堿能系統(tǒng)有密切關系;SOD是體內天然的抗氧化物，能清除自由基而具有抗自由基損傷作用;MDA是氧化應激反應中脂質過氧化的產物，其含量的變化可間接反映AD病理狀態(tài)下機體脂質過氧化水平的高低，反映組織細胞損傷的程度。大量文獻報道，MDA含量隨增齡而增高，而SOD的活性隨增齡而降低。D－gal誘導的亞急性衰老模型，是基于衰老學說建立的，其在代謝過程中形成的過量超氧陰離子自由基的過氧化反應與人體衰老變化基本一致［22，23］。本實驗結果顯示，連續(xù)皮下注射 D－gal能夠引起AchE活力升高，降低 SOD活力，升高 MDA含量，同時復合腹腔注射Scop能加重損傷效應，使腦組織皮層區(qū)AchE活力升高尤為明顯。

KXS能夠顯著改善模型動物的學習記憶能力減退，Morris水迷宮結果顯示，第三天起KXSG組的游出率較D－gal+scop組明顯升高，而QFLKXS則與D－gal+Scop組相近，同時KXS能夠縮短模型動物的逃避潛伏期，而QFLKXS則沒能改善模型動物的學習記憶能力。跳臺實驗結果顯示，KXS以及QFLKXSG組均能不同程度地提高模型小鼠的記憶獲得能力，而QFLKXSD組無改善作用，說明在同等劑量的條件下QFLKXS改善模型動物學習記憶的能力下降。綜上所述，提示茯苓在復方開心散改善擬AD動物學習記憶障礙中的重要作用。另外，KXS組能顯著降低D－gal+Scop復合模型小鼠大腦皮層的AchE活力，升高SOD活力，降低MDA含量，在抗氧化方面有明顯的作用，而QFLKXS組在同等劑量表現(xiàn)出來的改善模型小鼠學習記憶障礙的作用則減弱甚至沒有作用，進一步證實茯苓在開心散改善擬AD動物學習記憶障礙作用中是不可缺少的重要組成部分，其作用機制可能與減低大腦皮層 AchE活力，升高SOD活力，降低MDA含量有關。

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Comparision of Nootropic Effects of Kaixinsan Prescription and Kaixinsan without Poria cocos(Schw.)Wolf to Alzheimer's Mice Model

GAO Bing－bing，XU Shu－ping，LIU Xin－min，WANG Li－wei
(Chinese Academy of Medical Sciences，Peking Union Medical College Institute of Medicinal Plant Development，Beijing 100193，China)

Objective To compare the improving effect of Kanxinsan(KXS)and KXS without Poria(QFLKXS)on learning and memory of amnesia mice，and to learn the role of Poria in KXS.Methods The animals were

subcutaneous injection of D－gal for 12 weeks，and were given medicine at the same time in the 9th week.The behavioral test was started in the 12th week.The effect of KXS and KXS without Poria on improving learning and memory of amnesia mice was compared and Acetylcholinesterase(AchE)，superoxide dismutase(SOD)activity，oxidation products malondialdehyde(MDA)content of brain were detected.Results KXS improved learning and memory capacity of AD mice significantly.Furthermore，we found that KXS reduced acetylcholinesterase activity and decreased malondialdehyde content in cortex，while increased superoxide dismutase activity significantly.In comparison，KXS without Poria had no effect or diminished effect.Conclusion KXS prescription can improve the learning and memory of animal models of Alzheimer＇s disease，and the Poria is essential for the necessary ingredients in KXS prescription.

Animal model of dementia;Model of D－galactose+Scopolamine;KM mouse;Kaixinsan;Poria cocos(Schw.)Wolf

R473.74

A

1671－7856(2010)07－0057－06

2010－04－09

科技部對歐盟科技合作專項(0815)和國家科技重大新藥創(chuàng)制項目(2009ZX09502－017)。

高冰冰(1984－)，女，碩士生，研究方向:中藥神經藥理。E－mail:ice_happy5889@yahoo.cn

王立為(1951－)，男，研究員，碩士生導師。E－mail:wlw988@126.com