松子殼多糖對(duì)小鼠主要免疫細(xì)胞功能的影響

劉中祿，呂鐵鋼，張永亮

(1.第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，重慶 400042;2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，廣州 510095)

松子殼多糖對(duì)小鼠主要免疫細(xì)胞功能的影響

劉中祿1，呂鐵鋼2，張永亮2

(1.第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，重慶 400042;2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，廣州 510095)

目的 探討松子殼多糖(pine nut shell polysaccharide，PSP)對(duì)小鼠主要免疫細(xì)胞的影響。方法 應(yīng)用MTT法測(cè)定PSP對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞的毒性和對(duì)ConA或LPS誘生小鼠脾T、B淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，用中性紅吞噬試驗(yàn)測(cè)定腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能，應(yīng)用乳酸脫氫酶釋放法測(cè)定NK細(xì)胞的殺傷活性。結(jié)果 PSP對(duì)脾細(xì)胞毒性很低，各種濃度對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖均有較強(qiáng)的促進(jìn)作用(P＜0.01);PSP在濃度50～300 μg/mL時(shí)，明顯促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化(P＜0.01)，但是當(dāng)濃度達(dá)到300 μg/mL時(shí)表現(xiàn)出一定的抑制作用(P＞0.05);PSP在25～200 μg/mL時(shí)顯著促進(jìn)了小鼠脾B淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化(P＜0.05)，但是當(dāng)濃度達(dá)到300 μg/mL時(shí)，抑制作用極顯著(P＜0.01);不同濃度均可以增強(qiáng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬中性紅的能力及其代謝功能，當(dāng)濃度在100 μg/mL時(shí)能顯著的促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬中性紅的能力(P＜0.01);PSP在濃度100～300 μg/mL時(shí)，能極顯著的促進(jìn)NK細(xì)胞對(duì)Yac－1的殺傷作用(P＜0.01)，當(dāng)濃度達(dá)到400 μg/mL，對(duì)NK細(xì)胞殺傷性的促進(jìn)作用開(kāi)始減弱。結(jié)論 PSP對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞的毒性較低，能增強(qiáng)免疫細(xì)胞活性，有望成為新一代免疫調(diào)節(jié)劑。

松子殼多糖;免疫細(xì)胞;免疫活性

多糖是來(lái)自高等植物，動(dòng)物細(xì)胞膜，微生物的細(xì)胞壁中的天然大分子物質(zhì)，已提取300多種，這些從天然產(chǎn)物中分離出來(lái)的多糖對(duì)抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、抗衰老、降血糖、降血脂、愈潰瘍、提高人體免疫力等方面都有非常顯著的效果［1］。

松子殼多糖(pine nut shell polysaccharide，PSP)是從松子殼(松塔)中提取的酸性多糖成分，其在抗腫瘤、抗病毒和免疫促進(jìn)劑作用［2－6］方面研究較多。本試驗(yàn)著重探討松子殼多糖對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖、巨噬細(xì)胞吞噬功能及NK細(xì)胞殺傷活性的影響，考察松子殼多糖對(duì)小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用，旨在為新型免疫調(diào)節(jié)劑的研發(fā)奠定一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)昆明小鼠20只，雌雄各半，體重18～22 g，購(gòu)于第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［SCXK(渝)2007－0002］。

1.2 主要藥品試劑

松子殼多糖(PSP)，由吉林大學(xué)農(nóng)學(xué)部生化教研室提供［7］，以雙蒸水配成10 mg/mL母液，臨用時(shí)以含10%胎牛血清的RPMI－1640培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。

RPMI－1640培養(yǎng)基(美國(guó) GIBCO公司);胰酶(Amersco公司);小牛血清(杭州四季青公司);四甲基偶氮唑鹽(MTT)(Sigma公司)，以含10%小牛血清的RPMI－1640培養(yǎng)基配制，濃度為5 mg/mL;紅細(xì)胞裂解液(Tris－NH4Cl，pH 7.4);吩臻二甲酯硫酸鹽(PMS)(Biochemika公司);刀豆蛋白A(ConA)、脂多糖(LPS)、氧化型輔酶I(NAD)、左旋乳酸和碘硝基氯化四氮哩(INT)(Sigma公司);中性紅生理鹽水溶液，濃度為0.1%;分析純二甲基亞砜(DMSO)(金山化工廠);細(xì)胞培養(yǎng)板(Coster公司)。Yac－1細(xì)胞系(吉林大學(xué)農(nóng)學(xué)部免疫教研室惠贈(zèng))。

1.3 主要儀器

酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(BIO－RAD公司);CO2孵箱(美國(guó)SHELLAB公司);倒置顯微鏡(OLYMPUS公司);低溫高速離心機(jī)(德國(guó)Heracus)。

1.4 方法

1.4.1 PSP對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞體外轉(zhuǎn)化的影響:在無(wú)菌條件下常規(guī)方法制備小鼠脾細(xì)胞，用含10%小牛血清的RPMI－1640(完全培液)調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106/mL制成脾細(xì)胞懸液備用。

PSP對(duì)小鼠脾細(xì)胞的毒性試驗(yàn):取上述脾細(xì)胞懸液，加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，100 μL/孔。24 h后加入不同稀釋濃度的PSP(終濃度分別為1000、500、200、100、50 和 25 μg/mL)，設(shè) 3 個(gè)復(fù)孔;對(duì)照組加入完全培液，置5%CO2孵箱中37℃培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)結(jié)束前4 h，每孔加入MTT 20 μL，棄上清后每孔加DMSO100 μL，振蕩 5 min，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀 570 nm下測(cè)A值，取3復(fù)孔均值。

PSP對(duì)ConA誘導(dǎo)的小鼠T淋巴細(xì)胞體外轉(zhuǎn)化的測(cè)定:如上述脾細(xì)胞懸液，加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，100 μL/孔。實(shí)驗(yàn)組及轉(zhuǎn)化對(duì)照組每孔加入ConA10 μL(終濃度5 μg/mL)，空白對(duì)照孔加入等量完全培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)組加入不同稀釋濃度的PSP(終濃度分別為 400、300、200、100、50 和25 μg/mL)，設(shè) 3 個(gè)復(fù)孔;轉(zhuǎn)化對(duì)照組加入完全培液。置5%CO2孵箱中，37℃培養(yǎng)48 h，按前述MTT法測(cè)定各A值，取3復(fù)孔均值。

PSP對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠B淋巴細(xì)胞體外轉(zhuǎn)化功能測(cè)定:方法同T淋巴細(xì)胞，只是絲裂原以終濃度20 μg/mL的 LPS代替 ConA。

1.4.2 PSP對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞活性的影響:小鼠腹腔巨噬細(xì)胞懸液的制備:斷頸處死小鼠后，75%乙醇消毒。剪開(kāi)小鼠腹部外層皮膚，向其中注人無(wú)菌冷Hanks液5mL，輕揉小鼠腹部后用注射器將腹腔液抽出，置于無(wú)菌離心管中離心(1200 r/min，5 min)，沉淀?xiàng)壣锨?，用完全培液制?×106/mL的細(xì)胞懸液，將此細(xì)胞懸液加96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔100 μL，置5%CO2孵箱中37℃培養(yǎng)2 h。棄掉未貼壁細(xì)胞，再用10%NCS RPMI－1640洗滌細(xì)胞3次，剩下的貼壁細(xì)胞即為制備的巨噬細(xì)胞。

PSP對(duì)巨噬細(xì)胞代謝的影響:將巨噬細(xì)胞與不同濃度的PSP共同培養(yǎng)24 h后，每孔加入MTT20 μL(5 mg/mL)，37℃ 5%CO2培養(yǎng) 4 h后取出，棄上清后每孔加 DMSO100 μL，微量振蕩器振蕩5 min，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀570 nm下測(cè)A值，取3復(fù)孔均值。

PSP對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響:如上制備小鼠巨噬細(xì)胞，加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，每孔100 μL，含2×105個(gè)巨噬細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)孔加入不同稀釋濃度的 PSP，終濃度分別為 400 μg/mL、300 μg/mL、200 μg/mL、100 μg/mL、50 μg/mL、25 μg/mL，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔。對(duì)照組加入完全培液。置5%CO2孵箱中，37℃，飽和濕度連續(xù)培養(yǎng)24 h，然后每孔加入0.1%的中性紅生理鹽水溶液，每孔100 μL，繼續(xù)培養(yǎng) 2 h。棄上清，加入 DMSO，100 μL/孔，震蕩，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀570 nm下測(cè) A值，取三復(fù)孔均值。

1.4.3 PSP對(duì)小鼠NK細(xì)胞活性的影響:將已調(diào)整好濃度的脾細(xì)胞懸液(即效應(yīng)細(xì)胞)及Yac－1細(xì)胞懸液(即靶細(xì)胞)各取100 μL(效∶靶 =50∶1)加人96孔培養(yǎng)板中。實(shí)驗(yàn)孔加入不同稀釋濃度的PSP(終濃度分別為 400、300、200、100、50 和 25 μg/mL)，設(shè) 3 個(gè)復(fù)孔，每孔 100 μL。以 0.5%BSA RPMI－1640為正常對(duì)照，同時(shí)設(shè)靶細(xì)胞自然釋放孔(加100 μL 的0.5%BSA RPMI－1640)及最大釋放孔(加 100 μL 1%NP－40)，混勻，置 5%CO2孵箱中，37℃，培養(yǎng)4 h。孵育結(jié)束后，將其置于4℃5 min終止反應(yīng)，吸出100 μL的上清液于另一96孔板中，加人100 μL新鮮配制的底物L(fēng)DH反應(yīng)液充分混勻，反應(yīng)15 min后，酶標(biāo)儀570 nm處測(cè)各孔A值，按下式計(jì)算NK細(xì)胞活性:NK細(xì)胞活性(%)=(試驗(yàn)組A值－自然釋放對(duì)照組A值)/(最大釋放對(duì)照組A值－自然釋放對(duì)照組A值)×100。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS10.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，采用t檢驗(yàn)，方差分析。

2 結(jié)果

2.1 PSP對(duì)小鼠脾細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

PSP對(duì)脾細(xì)胞毒性很低，對(duì)脾淋巴細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用隨濃度增加變化不大，多糖濃度達(dá)到500 μg/mL，對(duì)脾淋巴細(xì)胞的增殖雖有促進(jìn)作用，但和低劑量比較有所下降(表1)。

2.2 PSP對(duì)ConA誘導(dǎo)的小鼠T淋巴細(xì)胞體外轉(zhuǎn)化的影響

各濃度的PSP能協(xié)同ConA誘導(dǎo)的小鼠T淋巴細(xì)胞體外轉(zhuǎn)化。當(dāng)濃度在50～200 μg/mL時(shí)，能明顯的促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，差異極顯著 (P＜0.01);但是當(dāng)濃度達(dá)到300 μg/mL時(shí)表現(xiàn)出一定的抑制作用(P＞0.05)(表2)。

2.3 PSP對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠B淋巴細(xì)胞體外轉(zhuǎn)化功的影響

與對(duì)照組比較，PSP在25～200 μg/mL時(shí)顯著促進(jìn)了小鼠脾B淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化(P＜0.05)，但是隨著濃度的繼續(xù)升高，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用，當(dāng)濃度達(dá)到300 μg/mL時(shí)，抑制作用極顯著(P＜0.01)(表3)。

表1 不同濃度PSP溶液對(duì)脾淋巴細(xì)胞的影響(A570)Tab.1 The effects of PSP on mouse splenic lymphocytes(A570)

表2 不同濃度PSP溶液對(duì)小鼠T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響(A570)Tab.2 Effect of PSP on proliferation of mouse T lymphocytes(A570)

表3 不同濃度PSP溶液對(duì)小鼠B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響(A570)Tab.3 Effect of PSP on proliferation of mouse B lymphocytes(A570)

2.4 PSP對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響

2.4.1 PSP對(duì)巨噬細(xì)胞代謝的影響:與對(duì)照組比較，PSP濃度在25～200 μg/mL時(shí)極顯著增強(qiáng)了小鼠巨噬細(xì)胞的代謝功能 (P＜0.01)，但是隨著濃度的繼續(xù)升高，對(duì)巨噬細(xì)胞的代謝逐漸表現(xiàn)出抑制作用，當(dāng)濃度達(dá)到400 μg/mL時(shí)抑制作用極顯著(P＜0.01)(表4)。

表4 不同濃度PSP溶液對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞代謝的影響(A570)Tab.4 Effect of PSP on macrophage metabolism in mice(A570)

2.4.2 PSP對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞吞飲功能的影響:與對(duì)照組比較，PSP在25～300 μg/mL范圍內(nèi)，隨濃度升高促進(jìn)了巨噬細(xì)胞吞噬中性紅的作用，濃度在100 μg/mL時(shí)促進(jìn)作用極為顯著(P＜0.01)，但是當(dāng)濃度達(dá)到400 μg/mL時(shí)表現(xiàn)出一定的抑制作用，總體上PSP對(duì)巨噬細(xì)胞的活性影響呈雙向劑量依賴關(guān)系(表5)。

表5 不同濃度PSP對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬中性紅的影響(A570)Tab.5 Effect of PSP on the activity of macrophages englobing neutral red in mice(A570)

2.5 PSP對(duì)小鼠NK細(xì)胞活性的影響

與對(duì)照組(自然釋放組)比較，PSP在濃度100～300 μg/mL時(shí)，能極顯著的促進(jìn)NK細(xì)胞對(duì)Yac－1的殺傷作用(P＜0.01);在25～50 μg/mL時(shí)，能顯著的促進(jìn)NK細(xì)胞對(duì)Yac－1的殺傷作用(P＜0.05)，但濃度達(dá)到400 μg/mL，對(duì)NK細(xì)胞殺傷性的促進(jìn)作用不明顯(表6)。

表6 PSP對(duì)小鼠NK細(xì)胞殺傷活性的影響Tab.6 Effect of PSP on NK cell competence in mice

3 討論

3.1 PSP對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞體外轉(zhuǎn)化的影響

脾臟是機(jī)體內(nèi)最大的外周免疫器官，也是T/B淋巴細(xì)胞定居和接受抗原刺激產(chǎn)生免疫應(yīng)答的重要場(chǎng)所，ConA等有絲分裂原能非特異性地誘導(dǎo)T細(xì)胞活化，LPS等有絲分裂原能非特異性地誘導(dǎo)B細(xì)胞活化，導(dǎo)致細(xì)胞因子合成及細(xì)胞因子受體表達(dá)。脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)是研究免疫調(diào)節(jié)劑對(duì)淋巴細(xì)胞作用的常用方法，也是反映機(jī)體細(xì)胞免疫最基本的指標(biāo)，淋巴細(xì)胞的增殖和分化是機(jī)體免疫應(yīng)答過(guò)程中的一個(gè)重要階段，淋巴細(xì)胞受到抗原或促有絲分裂原刺激時(shí)增殖能力的強(qiáng)弱反應(yīng)了淋巴細(xì)胞功能的高低。

淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)既可通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察計(jì)數(shù)，也可用3H－TdR摻入法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)DNA合成量的增加，據(jù)此判斷出淋巴細(xì)胞對(duì)有關(guān)刺激的反應(yīng)性與功能狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)采用MTT法檢測(cè)PSP體外刺激對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響。MTT法的原理是活細(xì)胞特別是增殖細(xì)胞中存在線粒體水解酶可將MTT分解為蘭紫色的結(jié)晶物質(zhì)而顯色，其光密度值能夠反映細(xì)胞的增殖情況。

結(jié)果顯示，PSP對(duì)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響呈現(xiàn)出低劑量促進(jìn)、高劑量抑制的雙向免疫調(diào)節(jié)作用，具體原因有待于進(jìn)一步研究。PSP對(duì)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的這種強(qiáng)促進(jìn)作用，為松子殼多糖的深入開(kāi)發(fā)利用提供了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，因此繼續(xù)探討其免疫調(diào)節(jié)機(jī)制具有非常重要的意義。

3.2 PSP對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響

巨噬細(xì)胞是機(jī)體天然抵抗力的一種重要效應(yīng)細(xì)胞，而且是一種具有多種功能的免疫細(xì)胞。激活的巨噬細(xì)胞可以參與特異性和非特異性免疫反應(yīng)，有較強(qiáng)的吞噬和胞飲作用，巨噬細(xì)胞吞噬能力是衡量機(jī)體非特異性免疫功能的重要要指標(biāo)之一。巨噬細(xì)胞的代謝狀況和其吞噬能力直接相關(guān)，代謝旺盛，則說(shuō)明巨噬細(xì)胞的吞噬能力增強(qiáng);代謝減弱，則吞噬功能下降。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PSP濃度在25～200 μg/mL時(shí)極顯著增強(qiáng)了小鼠巨噬細(xì)胞的代謝功能(P＜0.01)，但是隨著濃度的繼續(xù)升高，對(duì)巨噬細(xì)胞的代謝逐漸表現(xiàn)出抑制作用，當(dāng)濃度達(dá)到400 μg/mL時(shí)抑制作用極顯著(P＜0.01)。PSP在25～300 μg/mL范圍內(nèi)，隨濃度升高促進(jìn)了巨噬細(xì)胞吞噬中性紅的作用，濃度在100 μg/mL時(shí)促進(jìn)作用顯著(P＜0.05)，但是當(dāng)濃度達(dá)到400 μg/mL時(shí)表現(xiàn)出一定的抑制作用，總體上PSP對(duì)巨噬細(xì)胞的活性影響呈雙向劑量依賴關(guān)系。

3.3 PSP對(duì)小鼠NK細(xì)胞活性的影響

NK細(xì)胞即自然殺傷細(xì)胞，是動(dòng)物機(jī)體中除 T、B淋巴細(xì)胞外的又一類重要免疫細(xì)胞，不需抗原刺激，不需抗體參與，也不需補(bǔ)體協(xié)助，就可以直接殺傷靶細(xì)胞(腫瘤細(xì)胞)，主要在抗腫瘤的非特異性免疫過(guò)程中發(fā)揮作用。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PSP濃度在25～300 μg/mL時(shí)顯著提高了NK細(xì)胞對(duì)Yac－1的殺傷作用，具有一定的濃度依賴性，隨濃度升高，NK細(xì)胞免疫活性增強(qiáng)，但當(dāng) PSP濃度達(dá)到400 μg/mL以上，對(duì)NK細(xì)胞殺傷活性的促進(jìn)作用開(kāi)始減弱。上述結(jié)果的具體原因尚在研究之中。

3.4 其他

試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，PSP對(duì)脾細(xì)胞毒性很低，對(duì)脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的促進(jìn)作用隨濃度增加變化不大。PSP對(duì)促進(jìn)小鼠T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的效果要好于促進(jìn)小鼠B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的效果，其具體原因還有待研究。以上實(shí)驗(yàn)均在體外進(jìn)行，至于在體內(nèi)是否具有相同的免疫調(diào)節(jié)作用，仍需建立相關(guān)體內(nèi)模型進(jìn)行驗(yàn)證。

4 結(jié)論

PSP對(duì)脾細(xì)胞毒性很低，在較低濃度時(shí)提高了ConA或LPS對(duì)小鼠脾T、B淋巴細(xì)胞增殖的促誘生作用，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的代謝功能，促進(jìn)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬中性紅作用和提高小鼠NK細(xì)胞對(duì)Yac－1的殺傷作用，高濃度卻表現(xiàn)出一定的抑制作用。PSP對(duì)免疫細(xì)胞的活性影響呈雙向劑量依賴關(guān)系。

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The Influence of Pine Nut Shell Polysaccharide on Immunological Function of Mouse

LIU Zhong－lu1，LV Tie－Gang2，ZHANG Yong－liang2
(1.Laboratory Animal Center，Institute of Surgery Research;Daping Hospital;Third Military Medical University;Chongqing 400042，China;2.College of Veterinary Medicine;South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China)

Objective To study the influence of pine nut shell polysaccharide(PSP)on mouse splenic lymphocytes.Methods Proliferation of T and B lymphocytes induced by ConA or LPS were determined by using MTT assay.Peritoneal macrophage function was determined by using neutral red approach.NK cell competence was determined by using lactate dehydrogenase approach.Results The results showed that PSP cell toxicity to splenic lymphocytes is very low，it remained higher immunologic competence on splenic lymphocytes even if the polysaccharide density achieves 1000 μg/mL.PSP of different concentrations can promote T and B Lymphocyte proliferation，and PSP significantly enhanced T lymphocyte proliferation induced by ConA ranging from 100 μg/mL to 300 μg/mL(P ＜ 0.01).Different density PSP could enhance the function of peritoneal macrophage englobing neutral red and its metabolism.PSP could improve effect of NK cells against YAC－1.Conclusions PSP has the immunity activeness strongly，the toxic low characteristic.Thus，this polysaccharide seems to be a good candidate for the development of immunity conditioner.

Pine nut shell polysaccharide(PSP);Immune cells;Immunologic competence

R392

A

1671－7856(2010)10－0033－05

10.3969/j.issn.1671.7856.2010.10.009

2010－06－21

國(guó)家自然科學(xué)基金30571355。

劉中祿，男，副教授。E－mail:lzl1432vip.sina.com

張永亮。E－mail:zhangyl@public.cc.jl.cn