負(fù)載喜樹(shù)堿兩親性接枝聚天冬氨酸膠束研究

郭艷玲，孫娜娜，趙香玉，張晨曦

(1. 天津科技大學(xué)理學(xué)院，天津 300457；2. 天津科技大學(xué)材料科學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，天津 300457)

負(fù)載喜樹(shù)堿兩親性接枝聚天冬氨酸膠束研究

郭艷玲1，孫娜娜2，趙香玉2，張晨曦1

(1. 天津科技大學(xué)理學(xué)院，天津 300457；2. 天津科技大學(xué)材料科學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，天津 300457)

喜樹(shù)堿(CPT)是一種具有良好抗癌性能的植物性抗癌藥. 由于其水溶性較差，在臨床上的應(yīng)用受到一定的限制，因此以自制的芐基–聚乙二醇–g–聚天冬氨酸為載體，采用溶劑揮發(fā)法制備喜樹(shù)堿載藥膠束．結(jié)果表明，兩親性接枝聚天冬氨酸膠束對(duì)抗癌藥物喜樹(shù)堿具有一定的載藥能力，并具有良好的水溶性，其體外釋藥曲線符合FickⅡ擴(kuò)散動(dòng)力學(xué)模型．

接枝聚天冬氨酸；膠束；喜樹(shù)堿；控制釋放

兩親性聚合物由于其在選擇性溶劑中各個(gè)鏈段溶解性的不同，能夠發(fā)生締合形成聚合物膠束．聚合物膠束具有較低的臨界膠束濃度、較大的增溶空間，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定并且依據(jù)聚合物疏水鏈段的不同性質(zhì)可以通過(guò)化學(xué)、物理以及靜電作用等方法包裹藥物[1–2]．聚合物膠束作為抗癌藥物載體，可使難溶于水的藥物有效增溶，同時(shí)降低毒副作用．因此，聚合物膠束在抗癌藥物載體領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景[3]．

聚氨基酸是一類具有類似蛋白質(zhì)的酰胺結(jié)構(gòu)的生物可降解材料，將親水基團(tuán)與疏水基團(tuán)引入聚天冬氨酸側(cè)鏈，可得到兩親性接枝聚天冬氨酸．兩親性聚合物在水中可自組裝形成納米級(jí)核–殼結(jié)構(gòu)的膠束，其中疏水片段聚集成核，親水片段構(gòu)成膠束的外殼，難溶性藥物可通過(guò)物理包埋的方式進(jìn)入兩親性聚合物膠束內(nèi)核[4–5]．

喜樹(shù)堿是從我國(guó)南方特有的樹(shù)種喜樹(shù)中提取分離得到的純天然抗腫瘤藥物．目前，喜樹(shù)堿作為臨床治療中廣泛使用的植物性抗癌藥，是繼紫杉醇后又一具有發(fā)展前途的植物性抗癌藥物[6]．研究發(fā)現(xiàn)，喜樹(shù)堿在治療肝癌、胃癌、結(jié)腸癌、膀胱癌等均有療效．雖然喜樹(shù)堿具有良好的抗癌性能，但喜樹(shù)堿在臨床上的應(yīng)用受到了一定的限制，其原因主要是喜樹(shù)堿為水不溶、脂難溶的藥物，俗稱“磚頭末”，難以制備藥物制劑[7]．因此，如何提高喜樹(shù)堿的水溶性及穩(wěn)定性是臨床上所面臨的首要問(wèn)題．本文以自制的兩親性聚天冬氨酸為載體，制備了載有喜樹(shù)堿的水溶性膠束，并對(duì)載藥膠束的體外釋藥性能進(jìn)行研究．

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

兩親性接枝聚天冬氨酸：芐基–聚乙二醇–g–聚天冬氨酸，實(shí)驗(yàn)室自行合成[8]；喜樹(shù)堿(Camptothecin，CPT)，F(xiàn)luka Aldrich Germany；N，N–二甲基甲酰胺(DMF)，分析純，天津市永大化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心；二氯甲烷(CH2Cl2)、甲醇(CH3OH)，分析純，天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠．

透析袋(MWCO＝1,000)，美國(guó)Sepectral/Por；二次蒸餾水由SZ–93型自動(dòng)雙重純水蒸餾器(上海亞榮生化儀器廠)蒸餾；TU–1901型紫外–可見(jiàn)光分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；90Plus激光粒度儀，美國(guó)Brookhaven公司．

1.2 兩親性接枝聚天冬氨酸膠束的制備及表征

稱取接枝聚天冬氨酸25.3,mg，溶于5,mL CH3OH和5,mL,CH2Cl2的混合溶劑中，攪拌至全溶，將得到的溶液逐滴滴入10 mL不斷攪拌的二次蒸餾水中．將制得的上述溶液在25,℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)2,h，將有機(jī)溶劑從上述溶液中除去，得透明溶液．

采用90Plus激光粒度儀，在25,℃下取適量的膠束溶液過(guò)膜除塵，放入樣品池進(jìn)行膠束粒徑大小及分布的掃描測(cè)試．

1.3 喜樹(shù)堿(CPT)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

配制一系列濃度的CPT的DMF溶液，以DMF作參比液，在波長(zhǎng)366,nm下測(cè)定CPT標(biāo)準(zhǔn)溶液系列的吸光度，得到CPT的DMF溶液質(zhì)量濃度與吸光度的關(guān)系圖．

配制一系列濃度的CPT的DMF和水的混合溶液，以VDMF﹕V水＝1﹕9的混合溶劑作參比液，在波長(zhǎng)366 nm下測(cè)定CPT標(biāo)準(zhǔn)溶液系列的吸光度，得到CPT的DMF和水的混合溶液質(zhì)量濃度與吸光度關(guān)系圖．

1.4 兩親性接枝聚天冬氨酸載藥膠束的制備

分別稱取一定量接枝聚天冬氨酸和CPT放于樣品瓶中，溶于8,mL,CH3OH和5,mL CH2Cl2的混合溶劑中，攪拌至全溶．將得到的溶液逐滴滴入10,mL不斷攪拌的二次蒸餾水中．旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，將有機(jī)溶劑徹底揮發(fā)，4,000,r/min離心8,min，取上清液冷凍干燥．稱取一定量上述冷凍干燥得到的納米載藥微粒溶于

5,mL DMF中，在波長(zhǎng)366,nm下測(cè)定其紫外吸光度，根據(jù)1.3的方法得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，按公式(1)和(2)分別計(jì)算載藥量和載藥率[9]．

1.5 載藥膠束體外釋藥動(dòng)力學(xué)[2,9]

將用溶劑揮發(fā)法得到的聚合物納米載藥膠束溶液置于透析袋(MWCO＝1,000)中，將其放入100,mL磷酸鹽緩沖溶液(PBS，pH,7.4)的燒杯里，37,℃恒溫?cái)嚢柘逻M(jìn)行體外釋放實(shí)驗(yàn)．在預(yù)先設(shè)定的時(shí)間間隔內(nèi)，每次從燒杯中取出10,mL釋放液，并置換10,mL新鮮的PBS溶液．將取出的釋放液經(jīng)DMF稀釋(VDMF﹕V釋放液＝1﹕9)，在波長(zhǎng)366,nm下，測(cè)定其紫外吸光度，根據(jù)1.3的方法得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，近似計(jì)算累積釋藥率．

2 結(jié)果與討論

2.1 兩親性接枝聚天冬氨酸膠束的制備及表征

兩親性聚合物由于親水片段和疏水片段溶解性的差異，在水中自組裝形成膠束．選用CH3OH和CH2Cl2混合溶劑作為兩親性接枝聚天冬氨酸親水片段和疏水片段的共溶劑，將兩親性接枝聚天冬氨酸溶液滴入攪拌的二次蒸餾水中，發(fā)生分子自組裝，疏水作用力使疏水片段成核，親水片段成殼，形成核–殼結(jié)構(gòu)的膠束．

圖1為兩親性接枝聚天冬氨酸膠束的粒徑分布圖，膠束平均粒徑大小為89.0,nm，多分散性0.193，符合納米藥物載體要求．

圖1 接枝聚天冬氨酸膠束粒徑分布Fig.1 Size distribution of grafted polyaspartic acid micelles

2.2 喜樹(shù)堿(CPT)標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2為CPT的DMF溶液質(zhì)量濃度與吸光度關(guān)系(標(biāo)準(zhǔn)曲線Ⅰ)，圖3為CPT(VDMF﹕V水＝1﹕9)溶液質(zhì)量濃度與吸光度關(guān)系(標(biāo)準(zhǔn)曲線Ⅱ)．

圖2 CPT的DMF溶液質(zhì)量濃度與吸光度的關(guān)系Fig.2 Relationship between concentration and absorbance of CPT in DMF solution

圖3 CPT的DMF和水(VDMF﹕V水＝1﹕9)的混合溶液質(zhì)量濃圖3 度與吸光度關(guān)系Fig.3 Relationship between concentration and absorbance of CPT in DMF and water(VDMF﹕V水＝1﹕9)solution

2.3 接枝聚天冬氨酸包載喜樹(shù)堿膠束的載藥量與載藥率

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線Ⅰ，計(jì)算得到載藥膠束的載藥量和載藥率見(jiàn)表1．

表1 載藥膠束對(duì)不同投藥量的載藥量和載藥率Tab.1 Drug loading contents and efficiency of micelles at different feed ratios

由表1可以看出，適當(dāng)增加投藥量可以提高載藥膠束的載藥量和載藥率，但超過(guò)一定量影響明顯降低．芐基–聚乙二醇–g–聚天冬氨酸對(duì)水溶性和脂溶性較差喜樹(shù)堿有一定的載藥能力，其原因應(yīng)是兩親性聚合物鏈上所支載的芳環(huán)與喜樹(shù)堿有一定的結(jié)構(gòu)相似性，從而提高了藥物與聚合物疏水鏈段的相容性[10]．

2.4 接枝聚天冬氨酸包載喜樹(shù)堿膠束的體外釋放動(dòng)力學(xué)

由標(biāo)準(zhǔn)曲線Ⅱ可以計(jì)算出釋放液中CPT的含量，進(jìn)而得出累積釋放率．CPT累積釋放率對(duì)時(shí)間作圖，得到載藥膠束的體外釋藥曲線，如圖4所示．

圖4 接枝聚天冬氨酸包載CPT膠束體外釋藥曲線Fig.4 In vitro accumulated release amount of CPT from Fig.4 drug-loading micelles

聚合物載藥膠束呈球形結(jié)構(gòu)，藥物的釋放過(guò)程以徑向擴(kuò)散為主，可由Fick第二擴(kuò)散定律推導(dǎo)出藥物釋放動(dòng)力學(xué)方程[9]：

假定擴(kuò)散系數(shù)D為常數(shù)，可由Fick第二擴(kuò)散定律得到

式中：Mt為t時(shí)刻的累積釋放率；a為膠束半徑；k為速率常數(shù)．利用該動(dòng)力學(xué)方程對(duì)芐基–聚乙二醇–g–接枝聚天冬氨酸載藥膠束的體外釋藥曲線進(jìn)行擬合，結(jié)果表明擬合所得理論值與實(shí)驗(yàn)值基本相符，說(shuō)明喜樹(shù)堿從載藥膠束中的釋放過(guò)程受藥物擴(kuò)散控制，其釋放曲線符合Fick第二擴(kuò)散定律．

3 結(jié) 論

以自制的兩親性接枝聚天冬氨酸為藥物載體，采用溶劑揮發(fā)法制備了聚合物膠束，結(jié)果顯示芐基–聚乙二醇–g–聚天冬氨酸能夠形成平均粒徑在89.0 nm的膠束溶液，符合載藥膠束的要求．

芐基–聚乙二醇–g–聚天冬氨酸聚合物膠束對(duì)抗癌藥物喜樹(shù)堿具有一定的載藥能力，載藥膠束具有良好的水溶性，其體外釋藥曲線符合Fick Ⅱ擴(kuò)散動(dòng)力學(xué)模型．

［1］Kwon G S，F(xiàn)orrest M L. Amphiphilic block copolymer micelles for Nanoscale drug delivery[J]. Drug Development Research，2006，67(1)：15-22.

［2］郭艷玲，馮玉梅. 作為抗癌藥物載體的高分子研究進(jìn)展[J]. 天津科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，19(3)：11-15.

［3］Adams M L，Lavasanifar A，Kwon G S. Amphiphilic block copolymers for drug delivery[J]. Journal of Pharmaceutical Sciences，2003，92(7)：1343-1355.

［4］湯谷平，陳啟琪. 聚氨基酸材料在藥物控釋系統(tǒng)中的應(yīng)用[J]. 生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志，2001，18(2)：280-284.

［5］Xiong M P，F(xiàn)orrest M L，Ton G，et al. Poly(aspartate-g-PEI800)，a polyethylenimine analogue of low toxicity and high transfection efficiency for gene delivery[J]. Biomaterials，2007，28(32)：4889-4900.

［6］Zunino F，Pratesi G. Camptothecins in clinical development[J]. Expert Opinion on Investigational Drugs，2004，13(3)：269-284.

［7］Bhatt R，de Vries P，Tulinsky J，et al. Synthesis and in vivo antitumor activity of poly(L-glutamic acid) conjugates of 20S-camptothecin[J]. Journal of Medicinal Chemistry，2003，46(1)：190-193.

［8］郭艷玲，趙軍，任翔宇，等. 兩親性接枝聚天冬氨酸的合成與降解性能研究[J]. 天津科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，23(3)：49-51.

［9］王彩霞. 紫杉醇聚合物膠束給藥系統(tǒng)的研究[D]. 天津：天津大學(xué)，2006.

［10］施斌，方超，裴元英. 兩親性嵌段共聚物膠束的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志，2005，36(4)：239-243.

Study on Amphiphilic Grafted Polyaspartic Acid Micelles Loaded with Camptothecin

GUO Yan-ling1，SUN Na-na2，ZHAO Xiang-yu2，ZHANG Chen-xi1
(1. College of Science，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China；2. College of Material Science and Chemical Engineering，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China)

Camptothecin(CPT)，a plant alkaloid，was found as a new type of antitumor agent with pharmacologically effection. However，CPT’s extremely insolubility severely restrick its clinical applications. So new type of amphiphilic grafted polyaspartic acid was applied as carrier to encapsulate CPT by solvent evaporation method. It shows that the prepared micelles can be used as carriers of CPT and has good water solubility，the drug-loading micelles released drug in PBS under the rule of FickⅡdiffusion model.

grafted polyaspartic acid；micelles；camptothecin(CPT)；controlled release

O631.3

：A

：1672-6510(2010)05-0006-04

2010-03-30；

2010-07-06

天津科技大學(xué)引進(jìn)人才科研啟動(dòng)基金資助項(xiàng)目（20090404）

郭艷玲（1966—），女，河南內(nèi)黃人，副教授，博士，guoyl@tust.edu.cn.