兔不完全性截癱損傷脊髓血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）免疫組化陽(yáng)性表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化※

劉 潔 劉 盟 王 群湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一中醫(yī)臨床學(xué)院（4008） 中南大學(xué)00屆外語(yǔ)畢業(yè)生（400）

兔不完全性截癱損傷脊髓血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）免疫組化陽(yáng)性表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化※

劉 潔1劉 盟2王 群1
1湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一中醫(yī)臨床學(xué)院（410208） 2中南大學(xué)2010屆外語(yǔ)畢業(yè)生（410012）

目的 探討兔不完全性截癱后損傷脊髓血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor ,VEGF）免疫組化陽(yáng)性表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化，探討其在脊髓損傷過(guò)程中的作用。方法 采用壓迫法造成不完全截癱模型，傷后6h、7d、15d、取損傷脊髓組織3mm，用免疫組織化學(xué)S-P法染色，并用彩色圖象分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析。結(jié)果 脊髓損傷VEGF表達(dá)變化分為兩個(gè)階段：第一階段表達(dá)為最高峰值傷后6小時(shí)。第二階段表達(dá)峰值為傷后15d。結(jié)論 VEGF可為脊髓損傷的時(shí)間提供診斷依據(jù): 傷后6h為脊髓損傷的最高峰期主要是脊髓出血，炎細(xì)胞浸潤(rùn)，脊髓水腫時(shí)期，VEGF可為脊髓損傷提供治療依據(jù)：15d時(shí)，VEGF增加血管通透性，改善血液循環(huán)，增加生殖與遷移，主要是保護(hù)作用，促進(jìn)脊髓損傷的愈合，加快修復(fù)部位主要是灰質(zhì)部位. 治療上可大量使用活血化淤藥。

兔不完全截癱；VEGF陽(yáng)性表達(dá)動(dòng)態(tài)變化；脊髓神經(jīng)損傷時(shí)間的診斷治療依據(jù)

截癱，尤其是不完全性截癱，已成為臨床的常見(jiàn)病和疑難病。血管生長(zhǎng)因子與神經(jīng)生長(zhǎng)因子一樣，為神經(jīng)血管再生的重要物質(zhì)。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的促血管新生、促神經(jīng)再生的作用，已開(kāi)始運(yùn)用于創(chuàng)傷愈合的領(lǐng)域中，在大腦彌漫性損傷中的表達(dá)已有資料報(bào)道①，在脊髓損傷中尚未見(jiàn)資料報(bào)道。我們對(duì)不完全性截癱兔的損傷脊髓部位的VEGF陽(yáng)性表達(dá)作了動(dòng)態(tài)觀察，現(xiàn)報(bào)道如下：

1 材料與方法：

1.1 材料 ①實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組：由湖南中醫(yī)學(xué)院日本大耳白兔飼養(yǎng)中心提供健康雄性日本大耳白兔40只，體重2.0～2.5kg。隨機(jī)分為非脊髓損傷組。造模損傷6h組、7天組、15天組，每組10只。②兔不完全性截癱模型的制備采用壓迫法③造成不完全性脊髓損傷。對(duì)照組與模型組常規(guī)麻醉，顯露第七腰椎間孔切斷黃韌帶，插入麻醉導(dǎo)管膠囊，并用皮膚尾線固定，但不注入典必樂(lè)，不予壓迫。24h后拔掉導(dǎo)管。

在模型組形成6h、7d、15d時(shí)，空氣栓塞分批處死大耳白兔。電鏡液固定損傷脊髓部位，取3mm長(zhǎng)，損傷脊髓用10%的中性福爾馬林固定液再固定，常規(guī)石蠟包埋切片。

1.2 主要試劑 兔抗兔VEGF單克隆抗體、SP免疫組織化學(xué)試劑盒，DAB顯色劑，由武漢博士德生物工程有限公司提供。

1.3 方法

1.3.1 VEGF免疫組化染色 ①石蠟切片常規(guī)脫蠟至水；②10%過(guò)氧化氫37℃孵育10min，微波抗原修復(fù)；③羊血清孵育10min，滴加一抗4℃過(guò)夜；④滴加二抗37℃孵育30min；⑤滴加三抗37℃孵育30min；⑥D(zhuǎn)AB顯色蘇木素復(fù)染；⑦脫水透明封片。

1.3.2 圖象分析和統(tǒng)計(jì)處理 應(yīng)用美國(guó)產(chǎn)Optimas 6.51彩色圖象分析系統(tǒng)（湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)診斷研究所提供），40×10倍視野顯微鏡下對(duì)VEGF免疫組織化學(xué)染色陽(yáng)性反應(yīng)物進(jìn)行定量檢測(cè)，分別測(cè)定損傷脊髓灰質(zhì)（前、后角，灰質(zhì)聯(lián)共5個(gè)視野）和白質(zhì)（前后索側(cè)索共6個(gè)視野），灰、白質(zhì)共11個(gè)視野陽(yáng)性信號(hào)數(shù)（Var?of Cray）和灰度（Mean Gray）。

用SPSS.11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析和q檢驗(yàn)，P＜0.05視為兩組有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 免疫組織化學(xué)染色顯微鏡下結(jié)果 如圖片

2.2 免疫組化圖像分析陽(yáng)性反應(yīng)灰度與信號(hào)數(shù)變化 如表1。

表1 脊髓灰、白質(zhì)不同階段的動(dòng)態(tài)變化 n=照相張數(shù)

如表1所示，正常組VEGF陽(yáng)性信號(hào)的灰度主要表達(dá)在脊髓白質(zhì)（前后側(cè)索），陽(yáng)性表達(dá)灰度明顯比灰質(zhì)高，但顆粒含量差異不顯著。

模型組灰質(zhì)部位（前角、后角）VEGF陽(yáng)性信號(hào)灰度6h與（非脊髓損傷組）無(wú)顯著差異，但陽(yáng)性信號(hào)數(shù)開(kāi)始顯著升高，呈4個(gè)時(shí)相的最高峰。6h損傷脊髓灰質(zhì)、白質(zhì)的灰度與信號(hào)數(shù)比較顯著差異。白質(zhì)部位灰度明顯呈下降趨勢(shì)，但與正常組無(wú)差異，信號(hào)數(shù)明顯升高呈4h相的最高值。

7d時(shí)灰質(zhì)部位（前角、后角）陽(yáng)性信號(hào)灰度較正常組，顯著升高，表現(xiàn)為四個(gè)時(shí)相的最高峰，但陽(yáng)性信號(hào)數(shù)已開(kāi)始下降，較6h出現(xiàn)顯著差異。仍明顯高于正常組。白質(zhì)灰度亦明顯高于6h時(shí)，陽(yáng)性信號(hào)數(shù)開(kāi)始顯著下降，明顯低于6h時(shí)高于正常組。7d時(shí)灰白質(zhì)、灰度與信號(hào)數(shù)比較均無(wú)顯著差異。

15d時(shí)灰質(zhì)部位（前角、后角）陽(yáng)性信號(hào)灰度，顯著低于7d時(shí)灰度，但仍明顯高于6h組和非脊髓損傷組，但信號(hào)數(shù)又呈升高相，出現(xiàn)四個(gè)時(shí)相的次高峰。白質(zhì)部位陽(yáng)性信號(hào)灰度呈下降趨勢(shì)明顯低于7d時(shí)，信號(hào)數(shù)又開(kāi)始升高，出現(xiàn)四個(gè)時(shí)相的次高峰?；屹|(zhì)與白質(zhì)灰度比較呈現(xiàn)顯著差異。

3 討論

VEGF在脊髓損傷中的作用：目前，有關(guān)VEGF在脊髓損傷中的表達(dá)未見(jiàn)詳細(xì)資料報(bào)道，但在腦損傷修復(fù)和腦缺血中有大量資料報(bào)道。大鼠彌漫性腦損傷中，在傷后6h陽(yáng)性信號(hào)數(shù)達(dá)峰值，主要部位在神經(jīng)元內(nèi)[1]。與我們所測(cè)的資料相一致。本項(xiàng)觀察的第一個(gè)峰值也在6h，在灰質(zhì)白質(zhì)均有表達(dá)，均與非脊髓損傷組出現(xiàn)顯著差異。脊髓損傷7d時(shí)灰、白質(zhì)灰度出現(xiàn)最高值，而顆粒數(shù)相對(duì)減少這與損傷組織的自然凋亡有關(guān)。至15d時(shí)顆粒含量出現(xiàn)次高峰，灰質(zhì)灰度較7d時(shí)又開(kāi)始下降，白質(zhì)的灰度變化不明顯，從損傷以前15d來(lái)看，VEGF表達(dá)活躍主要反應(yīng)在灰質(zhì)部位。

關(guān)于VEGF的神經(jīng)保護(hù)方面的研究近幾年來(lái)發(fā)展迅速，VEGF是通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞上的特異性受體發(fā)揮作用，Kilic等[2](2006)發(fā)現(xiàn)缺氧時(shí)VEGF主要通過(guò)其受體(特別是VEGF-2受體)激活P13K/Akt pathway起到保護(hù)神經(jīng)及增加血管通透性的作用。目前發(fā)現(xiàn)至少有3種受體與VEGF有關(guān)，包括KDR/FLK、FLT1、FLT4。VEGF通過(guò)受體結(jié)合，增加血管通透性和促進(jìn)新生血管形成，傷后6h為脊髓損傷的最高峰期主要是脊髓出血，炎細(xì)胞浸潤(rùn)，脊髓水腫時(shí)期。這個(gè)表現(xiàn)與損傷脊髓血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子陽(yáng)性信號(hào)數(shù)呈高峰狀態(tài)相一致，亦和光電鏡的表現(xiàn)相一致。一方面VEGF主要是增加血管通透性破壞血腦脊屏障，促進(jìn)脊髓水腫加重脊髓損傷，另一方面增加脊髓血管通透性，是為促進(jìn)新生血管形成，改善脊髓血液循環(huán)，促進(jìn)脊髓再生做準(zhǔn)備。VEGF第二個(gè)高峰是在損傷的15d，增加血管通透性，改善血液循環(huán)，增加生殖與遷移，主要是保護(hù)作用，促進(jìn)脊髓損傷的愈合，加快修復(fù)部位主要是灰質(zhì)部位。因?yàn)?5d灰質(zhì)部位的灰度又開(kāi)始出現(xiàn)差異與非脊髓損傷組表現(xiàn)一致。VEGF促進(jìn)血管生長(zhǎng)，增加血氧供應(yīng)，從而促進(jìn)細(xì)胞存活；VEGF也可直接作用于神經(jīng)元，抗細(xì)胞凋亡、降低氧化應(yīng)激、調(diào)節(jié)離子通道、抑制突觸傳遞和細(xì)胞興奮性，以及促進(jìn)神經(jīng)元再生等。Krum和Khaibullina(2003)[4]發(fā)現(xiàn)VEGF是大腦修復(fù)中的中心環(huán)節(jié)，它是血管內(nèi)皮存活和增生的關(guān)鍵。梅欣明等使用當(dāng)歸注射液治療宮內(nèi)缺氧大鼠,可上調(diào)大鼠大腦皮質(zhì)VEGFmRNA的表達(dá). 脊髓損傷15d時(shí),治療上可大量使用活血化淤藥。

綜上所述，VEGF四個(gè)時(shí)相的表現(xiàn)是診斷脊髓損傷分析的高精確靈敏指標(biāo)，可望為脊髓損傷形成不同階段動(dòng)態(tài)變化時(shí)間和修復(fù)時(shí)間提供參考，并為臨床治療提供指導(dǎo)意義。

[1] 李梅,廖志鋼,王欣,等.大鼠彌漫性腦損傷中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)變化的實(shí)驗(yàn)研究[J].法律與醫(yī)學(xué)雜志.2002,9(2):96.

[2] 劉潔,胡湘明,劉光國(guó),等,建立兔急性壓迫型不完全性截癱模型的實(shí)驗(yàn)研究[J].湖南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)2003,23(5):1.

[3] kilic E,KiLic U,Wang Y,et al. the phosphatidylinositiol-3 kinase/akt pathway mediates VEGF’s neuroprotective activity and induces blood brarrier permeability after focal cerebral ischemia[J],FASEBJ, 2006,20(8)1185-1187

[4] Krum JM,Khaibullina A. Inhibition of endogenbous VEGF impedes revasc ularization and astroglial prolifenration:roles for vegf in brain repair[J].Exp Neurol, 2003,181(2):241-257.

[5] 梅欣明,劉敦玉,趙峰等.當(dāng)歸對(duì)宮內(nèi)缺氧新生大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元與VEGFmRNA表達(dá)的影響[J].四川動(dòng)物,2010.vol29(1),2010.

10.3969/j.issn.1672-2779.2010.18.177

1672-2779（2010）-18-242-03

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目[No：399709260]

2010-05-28）