土壤中淀粉酶產(chǎn)生菌的篩選及產(chǎn)酶條件優(yōu)化

雷曉燕

(沈陽化工大學(xué)環(huán)境與生物工程學(xué)院,遼寧沈陽 110142)

土壤中淀粉酶產(chǎn)生菌的篩選及產(chǎn)酶條件優(yōu)化

雷曉燕

(沈陽化工大學(xué)環(huán)境與生物工程學(xué)院,遼寧沈陽 110142)

為篩選淀粉酶的高產(chǎn)菌株,利用淀粉水解圈作為篩選模型,從淀粉廠附近土壤中篩選得到產(chǎn)淀粉酶能力較強(qiáng)的細(xì)菌B5.對(duì)其產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化,最終得到最佳碳源為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 2.0%的淀粉,最佳氮源為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.5%的酵母膏加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.5%的蛋白胨,最適初始pH值為6.0,最適培養(yǎng)溫度為 37℃,最適溶氧量為 50 mL搖瓶裝 15 mL培養(yǎng)基,最佳產(chǎn)酶時(shí)間為 48 h,培養(yǎng)基中同時(shí)補(bǔ)充質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.05%的MgSO4、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.05%的 CaCl2和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.005%的 FeSO4時(shí)可大幅提高酶活力.菌株B5液體發(fā)酵產(chǎn)酶活力最高可達(dá) 158.89 U/g,該淀粉酶最適反應(yīng)溫度為 42℃,最適反應(yīng) pH值為 5.0.

淀粉酶; 水解圈; 酶活力

淀粉酶(Amylase)是水解淀粉和糖原的酶類的總稱,廣泛存在于動(dòng)植物和微生物中,是最早實(shí)現(xiàn)工業(yè)生產(chǎn)并且迄今為止用途最廣、產(chǎn)量最大的酶制劑品種[1].特別是 20世紀(jì) 60年代以來,由于酶法生產(chǎn)葡萄糖,以及用葡萄糖生產(chǎn)異構(gòu)糖漿的大規(guī)模工業(yè)化,淀粉酶的需要量越來越大,幾乎占整個(gè)酶制劑總產(chǎn)量的 50%以上[2].淀粉酶根據(jù)其作用方式可分為 α-淀粉酶(EC3.2.1.1)與β-淀粉酶 (EC3.2.1.2).α-淀粉酶廣泛分布于動(dòng)物(唾液、胰臟等)、植物 (麥芽、山萮菜)及微生物中[3].微生物的許多種類都能產(chǎn)生淀粉酶,Buchanan和 Tamuri等人描述了數(shù)百種嗜熱真菌和上千種細(xì)菌可產(chǎn)生淀粉酶,僅Bacillus屬 48個(gè)種中就有 32個(gè)種能產(chǎn)生α-淀粉酶[4].淀粉酶種類繁多,特點(diǎn)各異,可應(yīng)用于造紙、印染、釀造、果汁和食品加工、醫(yī)藥、洗滌劑、工業(yè)副產(chǎn)品及廢料的處理、青貯飼料及微生態(tài)制劑等多種領(lǐng)域[5].因?yàn)榈矸勖傅挠猛緩V泛,各國在對(duì)淀粉酶產(chǎn)生菌的篩選方面都做了大量的研究工作[6-8],目前所得淀粉酶活力最高可達(dá)到260 U/mL左右.雖然不少微生物能產(chǎn)生淀粉酶,但適合商業(yè)生產(chǎn)需要的菌株仍然很少,在淀粉酶生產(chǎn)過程中選擇適合的菌株是最重要的前提條件.本文以土壤作為原料,從中篩選出具有產(chǎn)淀粉酶能力的出發(fā)菌株,并對(duì)所得的出發(fā)菌株進(jìn)行產(chǎn)酶條件的考察和優(yōu)化,進(jìn)一步提高其產(chǎn)酶能力,為使其最終能應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)、帶來經(jīng)濟(jì)效益做大量的準(zhǔn)備工作.

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌種

細(xì)菌B5,由沈陽某淀粉廠附近土壤中篩選得到.

1.1.2 培養(yǎng)基

(1)斜面培養(yǎng)基:可溶性淀粉,質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.0%;蛋白胨,質(zhì)量分?jǐn)?shù) 0.5%;NaCl,質(zhì)量分?jǐn)?shù) 0.5%;KH2PO4,質(zhì)量分?jǐn)?shù) 0.1%;KNO3,質(zhì)量分?jǐn)?shù) 0.1%;瓊脂,質(zhì)量分?jǐn)?shù) 2.0%;水 100 mL;pH值 6.0.

(2)分離平板培養(yǎng)基:可溶性淀粉,質(zhì)量分?jǐn)?shù) 2.0%;酵母膏,質(zhì)量分?jǐn)?shù) 0.5%;蛋白胨,質(zhì)量分?jǐn)?shù) 0.5%;NaCl,質(zhì)量分?jǐn)?shù) 0.5%;KH2PO4,質(zhì)量分?jǐn)?shù) 0.1%;瓊脂,質(zhì)量分?jǐn)?shù) 2.0%;水 100 mL;pH值 6.0.

(3)種子培養(yǎng)基:可溶性淀粉,質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.0%;酵母膏,質(zhì)量分?jǐn)?shù) 0.5%;蛋白胨,質(zhì)量分?jǐn)?shù) 0.5%;NaCl,質(zhì)量分?jǐn)?shù) 0.5%;KH2PO4,質(zhì)量分?jǐn)?shù) 0.1%;水 100 mL;pH值 6.0.

(4)產(chǎn)酶液體培養(yǎng)基:可溶性淀粉,質(zhì)量分?jǐn)?shù) 2.0%;酵母膏,質(zhì)量分?jǐn)?shù) 0.5%;蛋白胨,質(zhì)量分?jǐn)?shù) 0.5%;NaCl,質(zhì)量分?jǐn)?shù) 0.5%;KH2PO4,質(zhì)量分?jǐn)?shù) 0.1%;CaCl2·2H2O,質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05%;MgSO4·7H2O,質(zhì)量分?jǐn)?shù) 0.05%; FeSO4·7H2O,質(zhì)量分?jǐn)?shù) 0.005%;水 100 mL;pH值 6.0.

1.1.3 主要試劑

培養(yǎng)基成分為市售分析純和生化試劑.

1.1.4 主要儀器

DHP-420電熱恒溫培養(yǎng)箱 (光明醫(yī)療儀器廠),LDZX-40BⅠ型立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠),ZD-85氣浴恒溫振蕩器(常州國華電器有限公司),WD900微波爐(順德市格藍(lán)仕電器實(shí)業(yè)有限公司),HNP-1水平流形超凈工作臺(tái) (南通滬南科學(xué)儀器有限公司),101-2A型數(shù)顯式電熱恒溫干燥箱 (上海陽光實(shí)驗(yàn)儀器有限公司),FA1104分析天平 (上海精科天平有限公司),BC/BD-428A臥式冷藏冷凍轉(zhuǎn)換柜 (青島海爾特種電冰柜有限公司),SP-2000 722型可見分光光度計(jì) (上海萊奧光學(xué)儀器有限公司).

1.2 方法

1.2.1 菌種篩選

初篩:從沈陽某淀粉廠附近采集土樣,稱取5 g土樣,放入裝有45 mL無菌水的三角瓶中,震蕩 20 min后靜置 5 min,然后進(jìn)行濃度梯度稀釋到 10-6,分別在 10-4、10-5、10-6濃度下各取1 mL土壤稀釋液制成混菌平板,將培養(yǎng)皿放入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h.取出培養(yǎng)好的平皿,在長出的菌落上滴加碘液,菌落周圍如有無色透明圈出現(xiàn),說明淀粉被水解,即該菌株能產(chǎn)生淀粉酶.挑選有明顯透明圈的單菌落,轉(zhuǎn)接到斜面上,編號(hào)保存.

復(fù)篩:從冰箱中取出所有初篩得到的菌株,轉(zhuǎn)接試管斜面活化,37℃下恒溫培養(yǎng) 24 h.將所有菌種分別點(diǎn)種到分離培養(yǎng)基平板上進(jìn)行培養(yǎng),待菌落長成后向菌落上滴加碘液,比較淀粉水解圈大小,挑取d0/d1(d0為水解圈直徑,d1為菌落直徑)較大的菌株連續(xù)進(jìn)行 3次平板點(diǎn)種培養(yǎng),選取d0/d1值最大的菌株作為本實(shí)驗(yàn)出發(fā)菌株.

1.2.2 淀粉酶活力的測定[9]

發(fā)酵液 4 000 r/min離心 20 min,取上清液,即為粗酶液.

取5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.5%的可溶性淀粉溶液,在37℃水浴中預(yù)熱10 min,加入適當(dāng)稀釋的酶液0.5 mL,準(zhǔn)確反應(yīng) 5 min后,用 5 mL濃度為 0.1 mol/L的HCl終止反應(yīng).取 0.5 mL反應(yīng)液與 5 mL稀碘液顯色,在 620 nm處測吸光度.以 0.5 mL蒸餾水代替0.5 mL反應(yīng)液為空白,以不加酶液(加同體積的緩沖液)的管為對(duì)照.酶活定義:在37℃、pH =6.0條件下,5 min內(nèi)水解1 mg淀粉的酶量為一個(gè)活力單位.酶活力根據(jù)以下公式計(jì)算:

式中,R0、R分別表示對(duì)照和反應(yīng)液的光密度,D為粗酶液的稀釋倍數(shù).調(diào)整D使(R0-R)/R在0.2～0.7之間,4為轉(zhuǎn)換系數(shù),無單位.

1.2.3 最佳碳源的確定

取出發(fā)菌株活化,然后取一環(huán)接入種子培養(yǎng)基中培養(yǎng),于 24 h后分別取 1 mL培養(yǎng)液,加入到 2.0%淀粉,2.0%麥芽糖,2.0%乳糖, 2.0%蔗糖,2.0%葡萄糖 5種不同碳源的產(chǎn)酶培養(yǎng)基中,于 37℃搖床培養(yǎng) 48 h.分別離心收集粗酶液,測定其淀粉酶活力,根據(jù)所測定的結(jié)果確定最佳碳源.

1.2.4 最佳氮源的確定

取出發(fā)菌株活化,然后取一環(huán)接入種子培養(yǎng)基中培養(yǎng),于 24 h后分別取 1 mL培養(yǎng)液,加入到氮源分別為 0.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù),下同)牛肉膏, 0.5%酵母膏,0.5%蛋白胨,0.5%牛肉膏 + 0.5%蛋白胨,0.5%酵母膏 +0.5%蛋白胨 5種不同氮源的產(chǎn)酶培養(yǎng)基中.于 37℃搖床培養(yǎng)48 h.分別離心收集粗酶液,測定其淀粉酶活力,根據(jù)所測定的結(jié)果確定最佳氮源.

1.2.5 最佳培養(yǎng)基初始 pH值的確定

取出發(fā)菌株活化,然后取一環(huán)接入種子培養(yǎng)基中培養(yǎng),24 h后分別取 1 mL培養(yǎng)液,加入到pH值分別為 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0,碳源和氮源已優(yōu)化的產(chǎn)酶培養(yǎng)基中,37℃下培養(yǎng) 48 h.分別離心收集粗酶液,測定其淀粉酶活力,根據(jù)所測定的結(jié)果確定最佳培養(yǎng)基的初始 pH值.

1.2.6 最佳培養(yǎng)溫度的確定

取出發(fā)菌株活化,然后取一環(huán)接入種子培養(yǎng)基中培養(yǎng),24 h后分別取 1 mL培養(yǎng)液,加入碳源、氮源和 pH值已優(yōu)化的產(chǎn)酶培養(yǎng)基中,分別于 33℃、35℃、37℃、39℃、41℃下培養(yǎng) 48 h.分別離心收集粗酶液,測定其淀粉酶活力,根據(jù)所測定的結(jié)果確定最佳培養(yǎng)溫度.

1.2.7 最佳溶氧量的確定

取出發(fā)菌株活化,然后取一環(huán)接入種子培養(yǎng)基中培養(yǎng),24 h后分別取 1 mL培養(yǎng)液,接入已優(yōu)化碳源、氮源和 pH值的產(chǎn)酶培養(yǎng)基中培養(yǎng),產(chǎn)酶培養(yǎng)基的裝液量分別為 10 mL、15 mL、20 mL、25 mL、30 mL,37℃下培養(yǎng) 48 h,分別離心收集粗酶液,測定其淀粉酶活力,根據(jù)所測定的結(jié)果確定最佳溶氧量.

1.2.8 最佳產(chǎn)酶時(shí)間的確定

取出發(fā)菌株活化,然后取一環(huán)接入種子培養(yǎng)基中培養(yǎng),24 h后分別取 1 mL培養(yǎng)液,接入已優(yōu)化碳源、氮源和 pH值的產(chǎn)酶培養(yǎng)基中培養(yǎng),分別于 0 h,12 h,24 h,36 h,48 h,60 h取樣,測定發(fā)酵液的酶活力,根據(jù)所測定的結(jié)果確定最佳產(chǎn)酶時(shí)間.

1.2.9 離子對(duì)產(chǎn)酶的影響

通過向培養(yǎng)基中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.05%的MgSO4、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%的CaCl2和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.005%的 FeSO4等不同離子進(jìn)行產(chǎn)酶實(shí)驗(yàn),培養(yǎng) 48 h,測定酶活力,根據(jù)測定結(jié)果確定最適添加的離子.

1.2.10 酶反應(yīng)最適 pH值的確定

分別用 pH值為 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的緩沖溶液配制可溶性淀粉液,將在最適條件下培養(yǎng)獲得的粗酶液分別在以上各種 pH值條件下測定其淀粉酶活力,根據(jù)所測得的結(jié)果確定淀粉酶反應(yīng)的最適 pH值.

1.2.11 酶反應(yīng)最適溫度的確定

將在最適條件下培養(yǎng)獲得的粗酶液分別在27℃、32℃、37℃、42℃、47℃、52℃等各種不同溫度下測定淀粉酶活力,根據(jù)所測得的結(jié)果確定淀粉酶反應(yīng)的最適溫度.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 初篩結(jié)果

土樣經(jīng)稀釋并在淀粉培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)后,共挑選出 24株能水解淀粉的細(xì)菌,分別將 24株細(xì)菌接種到斜面培養(yǎng)基上,編號(hào)為 B1～B24,菌株產(chǎn)生水解圈的情況如圖 1所示.

圖 1 淀粉酶產(chǎn)生菌產(chǎn)生的淀粉水解圈Fig.1 Hydrolysis circle of starch produced by a strain which can produce amylase

2.2 復(fù)篩結(jié)果

將所有初篩得到的菌種分別點(diǎn)種到淀粉培養(yǎng)基平板上進(jìn)行培養(yǎng),待菌落長成后向菌落上滴加碘液,比較淀粉水解圈大小,挑取d0/d1(d0為水解圈直徑,d1為菌落直徑)較大的 5株菌株連續(xù)進(jìn)行 3次平板點(diǎn)種培養(yǎng),最終選取d0/d1值最大的菌株B5作為本實(shí)驗(yàn)出發(fā)菌株.將 B5菌株接多支斜面,經(jīng)培養(yǎng)后于低溫保存.復(fù)篩結(jié)果見表1.

表1 復(fù)篩結(jié)果Table 1 Results of re-screening

2.3菌株產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

發(fā)酵過程中影響菌株生長、產(chǎn)酶的主要因素為:碳源、氮源、發(fā)酵培養(yǎng)基的初始 pH值、發(fā)酵溫度、溶氧量、金屬離子及產(chǎn)酶時(shí)間.對(duì)上述因素進(jìn)行全面考察,以確定菌株的最佳產(chǎn)酶條件.

2.3.1 碳源對(duì)細(xì)菌B5產(chǎn)酶能力的影響

分別在 5種含不同碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)菌B5,37℃搖床培養(yǎng) 48 h.經(jīng)過對(duì)發(fā)酵液中淀粉酶活力的測定,可知碳源為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0%的淀粉時(shí)細(xì)菌 B5產(chǎn)酶活力最高,測定結(jié)果見圖 2.

圖 2 碳源對(duì)細(xì)菌B5產(chǎn)酶的影響Fig.2 The impact of carbon source on Bacterium B5 in producing amylase

2.3.2 氮源對(duì)細(xì)菌B5產(chǎn)酶能力的影響

分別在含 5種不同氮源的發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)菌B5,37℃搖床培養(yǎng) 48 h.經(jīng)過對(duì)發(fā)酵液中淀粉酶活力的測定,可知氮源為質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%酵母膏 +質(zhì)量分?jǐn)?shù) 0.5%蛋白胨時(shí)細(xì)菌B5產(chǎn)酶活力最高,測定結(jié)果見圖 3.

圖 3 氮源對(duì)菌株B5產(chǎn)酶能力的影響Fig.3 The impact of nitrogen source on Bacterium B5 in producing amylase

2.3.3 培養(yǎng)基初始 pH值對(duì)菌株 B5產(chǎn)酶能力的影響

將碳源和氮源已優(yōu)化的產(chǎn)酶培養(yǎng)基 pH值分別調(diào)為 5.0,6.0,7.0,8.0,9.0,接種 B5后 37℃下培養(yǎng) 48 h,測定不同 pH值下淀粉酶活力,結(jié)果見圖 4,根據(jù)所測定的結(jié)果確定最佳培養(yǎng)基的初始 pH值為 6.0.

圖 4 培養(yǎng)基初始 pH值對(duì)菌株B5產(chǎn)酶能力的影響Fig.4 The impact of initial pH on Bacterium B5 in producing amylase

2.3.4 培養(yǎng)溫度對(duì)菌株B5產(chǎn)酶能力的影響

將出發(fā)菌株 B5分別在 5種不同溫度下進(jìn)行培養(yǎng),48 h后離心收集粗酶液,測定淀粉酶活力,結(jié)果見圖 5.由圖 5結(jié)果可以看出,37℃培養(yǎng)時(shí)菌株B5產(chǎn)酶能力最強(qiáng).

圖 5 培養(yǎng)溫度對(duì)菌株B5產(chǎn)酶能力的影響Fig.5 The impact of culture temperature on Bacterium B5 in producing amylase

2.3.5 溶氧量對(duì)菌株B5產(chǎn)酶能力的影響

將菌株B5在不同溶氧情況下進(jìn)行培養(yǎng),48 h后離心收集粗酶液,測定淀粉酶活力,結(jié)果見圖 6.由圖 6可以看出,50 mL搖瓶中裝液量為15 mL時(shí)為最佳溶氧量.

圖 6 溶氧對(duì)菌株B5產(chǎn)酶能力的影響Fig.6 The impact of dissolved oxygen on Bacterium B5 in producing amylase

2.3.6 最佳產(chǎn)酶時(shí)間的確定

菌株B5在發(fā)酵培養(yǎng)基中開始培養(yǎng)后,在不同時(shí)間點(diǎn)取樣測定酶活力,結(jié)果如圖 7所示.由圖 7可見以看出,菌株B5的最佳產(chǎn)酶時(shí)間是 48 h.

圖 7 菌株B5淀粉酶最佳產(chǎn)生時(shí)間的確定結(jié)果Fig.7 The determination of optimal time in producing amylase byBacterium B5

2.3.7 離子對(duì)產(chǎn)酶的影響

Mg2+、Ca2+、Fe2+是很多種酶的激活劑并且可以提高酶活力,為測定這幾種離子對(duì)菌株 B5所產(chǎn)淀粉酶是否有提高酶活力的作用,向培養(yǎng)基中單一或混合添加幾種離子進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶實(shí)驗(yàn),酶活測定結(jié)果見圖 8.由圖 8可以看出,同時(shí)添加 3種離子對(duì)菌株B5產(chǎn)酶能力有較大的影響.

圖 8 離子對(duì)菌株B5產(chǎn)酶的影響Fig.8 The impact of ion on Bacterium B5 in producing amylase

2.4 菌株B5所產(chǎn)淀粉酶酶學(xué)性質(zhì)的研究

2.4.1 酶反應(yīng)最適 pH值的確定

分別用不同 pH值的緩沖溶液配制可溶性淀粉液,測定淀粉酶活力,結(jié)果見圖 9.

圖 9 酶反應(yīng)最適pH值的確定結(jié)果Fig.9 The deter mination of opt imal reaction pH of amylase

由圖 9可以看出,pH值為 5.0時(shí)淀粉酶活力最強(qiáng).

2.4.2 酶反應(yīng)最適溫度的確定

分別在各種不同溫度下測定菌株 B5所產(chǎn)淀粉酶的酶活力,結(jié)果見圖 10.由圖 10可以看出,在 42℃時(shí)酶活力最強(qiáng),此時(shí)酶活力可達(dá)158.9 U/mL.

圖 10 酶反應(yīng)最適溫度的測定結(jié)果Fig.10 The determination of optimal reaction temperature of amylase

在最適條件下菌株 B5所產(chǎn)淀粉酶活力從最初的 92.6 U/mL提高到 158.9 U/mL,酶活力提高效果明顯.

3 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)中篩選出的細(xì)菌 B5具有產(chǎn)淀粉酶的能力,菌株產(chǎn)酶能力通常會(huì)受到菌株培養(yǎng)時(shí)碳源、氮源、培養(yǎng)基初始 pH值、培養(yǎng)溫度、溶氧、離子等許多因素的影響,另外菌株所產(chǎn)酶的活力也會(huì)受到酶發(fā)揮作用時(shí)最適溫度和最適 pH值的影響.綜合考察以上各種影響因素對(duì)酶活力的影響后,確定菌株B5產(chǎn)淀粉酶的最適培養(yǎng)條件以及淀粉酶發(fā)揮作用時(shí)的最適條件.以淀粉廠附近土樣為原料,通過淀粉水解圈篩選模型篩選得到一株產(chǎn)淀粉酶活力較強(qiáng)的細(xì)菌B5.通過對(duì)B5產(chǎn)酶條件的考察得出:培養(yǎng)基中最佳碳源為質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的淀粉,最佳氮源為質(zhì)量分?jǐn)?shù) 0.5%的酵母膏加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%的蛋白胨,最適初始pH值為 6.0,最適培養(yǎng)溫度為 37℃,最適溶氧量為 50 mL搖瓶裝 15 mL培養(yǎng)基,最佳產(chǎn)酶時(shí)間是 48 h,培養(yǎng)基中同時(shí)補(bǔ)充質(zhì)量分?jǐn)?shù) 0.05%的MgSO4、質(zhì)量分?jǐn)?shù) 0.05%的 CaCl2和質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.005%的FeSO4時(shí)可大幅提高酶活力.該淀粉酶最適反應(yīng)溫度為 42℃,最適反應(yīng) pH值為 5.0.菌株B5液體發(fā)酵產(chǎn)酶活力最高可達(dá) 158.9 U/mL,該菌株如果再進(jìn)一步進(jìn)行誘變處理酶活力還有提升空間.本實(shí)驗(yàn)方法簡便、直觀,可快速、高效地篩選出淀粉酶產(chǎn)生菌.

[1] 谷軍.α-淀粉酶的生產(chǎn)與應(yīng)用 [J].生物技術(shù), 1994,4(3):1-5.

[2] 白坤,于德貴,周冬穎.α-淀粉酶的性質(zhì)及其液化作用[J].中國釀造,1995(5):1-5.

[3] 張強(qiáng),劉成君,蔣芳,等.耐高溫α-淀粉酶產(chǎn)生菌的分離鑒定及發(fā)酵條件與酶性質(zhì)研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2005,31(2):34-37.

[4] 羅志剛,楊景峰,羅發(fā)興.α-淀粉酶的性質(zhì)及應(yīng)用[J].食品研究與研發(fā),2007,28(8):1-18.

[5] 張麗蘋,徐巖,金建中.酸性α-淀粉酶的研究與應(yīng)用[J].釀酒,2002,29(3):4-15.

[6] Shoji H,Sug im oto T,Hosoi K,et al. S im ultaneous Production of G lucoam ylase and A cid Stableα-amylase U sing Novel Subm erged Culture of Aspergillus Kawachii NBRC4308[J].Journal of B ioscience and B ioengineering,2007,103(2):203-205.

[7] N agam ine K,M urashim a K,Kato T,et al.M ode of α-am ylase Production by the Shochu KojiM old Aspergillus Kawachii[J].B ioscience,B iotechnology and B iochem istry,2003,67(10):2194-2202.

[8] Sivaram akrishnan S,Gangadharan D,Nampoothiri K M,et al.α-Am ylase from M icrobial Sources——A n O verview on Recent Developm ents[J].Food Technol B iotechnol,2006,44(2):173-184.

[9] 沈萍.微生物學(xué) [M].2版.北京:高等教育出版社,2002:63-65.

Screening ofBacterium Producing Amylase from the Soil and Opt im ization of the Condition for Enzyme Production

LEI Xiao-yan
(Shenyang U niversity of Chem ical Technology,Shenyang110142,China)

In order to screen a bacterium w hich can produce am ylase,starch hydrolysis circle is used in this experim ent as a screening m odel.The Strain B5is achieved by screening from the soil near the starch factory.A fter the optim ization of the condition,the capability of B5is improved.The optim al condition is: carbon source is starch2.0%;nitrogen source is yeast extract0.5%and peptone0.5%;the initial pH is 6.0;and the optim um incubation temperature is37℃;the appropriate load is15mL culture m edium in 50mL flask;the opt im al tim e for producing am ylase is48h;w hen0.05%M gSO4,0.05%CaC l2,and 0.005%FeSO4is added to the m edium,the am ylase activity can be improved greatly.The am ylase activity of Strain B5in liquid ferm entation can reach as high as158.89U/mL.The optim al reaction temperature of am ylase is42℃,and the optim um reaction pH of am ylase is5.0.The exper im entalm ethod is simple and intuitive,and can be used to screen am ylase-producing strain quickly and efficiently.

am ylase; hydrolysis circle; enzym e activity

Q939.9

A

1004-4639(2010)03-0203-06

2009-02-09

雷曉燕(1972-),女,陜西綏德人,講師,碩士,主要從事生物技術(shù)教學(xué)和科研工作.