5種海洋微藻細胞膜與細胞內(nèi)脂肪酸組成分析

孫書勤,王江濤＊＊,孫寶維,鄭 宇,孫銘一,2

(1.中國海洋大學海洋化學理論與工程技術(shù)教育部重點實驗室,山東青島266100;2.美國佐治亞大學海洋科學學院,佐治亞30602-3636)

5種海洋微藻細胞膜與細胞內(nèi)脂肪酸組成分析

孫書勤1,王江濤1＊＊,孫寶維1,鄭 宇1,孫銘一1,2

(1.中國海洋大學海洋化學理論與工程技術(shù)教育部重點實驗室,山東青島266100;2.美國佐治亞大學海洋科學學院,佐治亞30602-3636)

對5種海洋微藻的脂肪酸組成進行了研究。微藻在確定的條件下生長,分別于指數(shù)生長前期和穩(wěn)定期后期,測定其脂肪酸組成。根據(jù)細胞膜上和細胞內(nèi)脂肪酸極性差別,采用硅膠柱層析法分離脂肪酸,應(yīng)用GC與GC-MS進行定量與定性分析。實驗結(jié)果表明:在微藻生長的不同時期,細胞內(nèi)脂與細胞膜脂含量及各自的脂肪酸組成明顯不同;無論是指數(shù)生長前期還是穩(wěn)定期后期,胞內(nèi)物質(zhì)的脂肪酸含量明顯要低于細胞膜組分,細胞內(nèi)與細胞膜中主要組成是C16系與C18系脂肪酸。

海洋微藻;細胞膜與細胞內(nèi)脂肪酸;脂肪酸組成

海洋浮游植物承擔著目前地球上光合作用的一半任務(wù),對大氣CO2濃度和全球碳循環(huán)有重要的調(diào)控作用[1]。浮游植物是海洋系統(tǒng)有機物的主要生產(chǎn)者,為浮游和底棲群落提供食物和能量;一部分浮游植物產(chǎn)生的有機物(包括脂類化合物)被保存在海洋沉積物中,既是全球碳收支中有機碳的主要組分,又作為生命活動和環(huán)境變遷的記錄,提供地球歷史演變的重要信息。浮游植物通過光合作用合成多種脂類化合物,可以占到生物量總碳的5%～20%[2]。由于脂類化合物結(jié)構(gòu)具有指紋特征,并較之蛋白質(zhì)和糖類化合物結(jié)構(gòu)穩(wěn)定[2],作為一種生物標記物,已經(jīng)被廣泛地用于研究有機物的生物地球化學循環(huán)和沉積物歷史記錄的反演[3-5]。

脂肪酸是浮游藻類活體細胞生物合成的一類重要的脂類化合物,(它在細胞中一般與一些大分子結(jié)合為復(fù)合物,如磷脂與三酰甘油等[6],這些化合物在浮游藻類細胞體內(nèi)具有重要的生物學功能,它們不僅參與細胞膜結(jié)構(gòu),而且是細胞內(nèi)儲存能量的物質(zhì)和一些代謝過程的前體。磷脂是細胞膜的主要成分,盡管它們的脂?；M成可能發(fā)生顯著變化[7],但在不同的生長期其含量相對穩(wěn)定。三酰甘油是浮游藻類細胞內(nèi)的主要能量儲存物質(zhì),用于細胞的新陳代謝[8-9],這些用于能量儲存的物質(zhì)主要在藻類生長的穩(wěn)定期合成[10]。由于細胞膜與細胞內(nèi)脂肪酸的作用不同,導(dǎo)致它們在地球化學沉積保存過程中也存在差別[11]。本文就五種海洋微藻的細胞膜與細胞內(nèi)脂肪酸在不同生長期的組成進行了初步研究比較,以期為脂類化合物作為生物標記物的研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藻種的來源

所有藻種均來自中國海洋大學海洋污染生態(tài)化學實驗室藻種庫,種類如下:

表1 實驗藻種名稱Table 1 List of the species of microalgae

1.2 微藻的培養(yǎng)

5種微藻分別培養(yǎng)于500 mL三角瓶中,平行雙樣。培養(yǎng)液按f/2配方[12]配制,在生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。光照強度為4 000 lx,光暗周期是12/12,溫度為20.5℃。微藻細胞數(shù)用血球計數(shù)板顯微計數(shù),并在指數(shù)生長前期及達到穩(wěn)定期2周后取一定量藻液,過濾留膜,冷凍保存。

1.3 脂肪酸的提取與分析

參照Sun等人[13]的方法提取總脂肪酸,然后根據(jù)極性差別,按照Ding[11]的方法采用硅膠層析分離出細胞內(nèi)脂(主要是三酰甘油,屬于中性脂)與細胞膜脂(主要是磷脂,屬于極性脂)。用Agilent 6890N氣相色譜儀(帶有Agilent-B.01.01C工作站)與Agilent 6890N/ 5973B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀對樣品做定量與定性分析。

GC分析條件:FID檢測器溫度300℃,無分流進樣口溫度300℃,進樣量1μL,高純N2做載氣,載氣流速1 mL/min,HP-5色譜柱。

MS條件:離子化方式EI(70 ev),采集方式掃描(scan),He做載氣,流速1 mL/min,無分流進樣口溫度100℃,離子源溫度200℃,EMV為300 V,進樣口溫度:250℃,接口溫度:250℃。

升溫程序:

2 結(jié)果

每個藻種2個平行組的結(jié)果取平均值后分析,其生長曲線及取樣時間如圖1。從圖中可以看出,5種微藻在培養(yǎng)的最初幾天細胞數(shù)明顯增加,青島大扁藻在培養(yǎng)16 d后進入穩(wěn)定期,鹽藻在培養(yǎng)12 d后進入穩(wěn)定期,塔瑪亞里山大藻在18 d后進入穩(wěn)定期,三角褐指藻和聚球藻則在培養(yǎng)9 d后達到穩(wěn)定期。在培養(yǎng)的第3天取藻液作為指數(shù)生長前期樣品(塔瑪亞里山大藻除外,在第12天取藻液),在進入穩(wěn)定期2周左右取藻液作為穩(wěn)定期樣品。

圖1 生長曲線及取樣時間Fig.1 The growth curve and the harvest days

2.1 不同生長時期脂肪酸分布

如圖2所示,在微藻生長的不同時期,細胞內(nèi)脂、中間產(chǎn)物、細胞膜脂含量(見表2)及各自的脂肪酸組成明顯不同,不同的微藻差別較大。

表2 不同生長時期5種微藻各組分脂肪酸(占總脂肪酸含量的百分比)Table 2 Fatty acids composition of five marine microalgae during different growth phases(%of total FA content)

圖2 5種海洋微藻不同生長時期細胞膜和細胞內(nèi)的脂肪酸組成(占總脂肪酸含量的百分比)Fig.2 Fatty acids composition(percentage of total fatty acids)in membrane and intracellular components of five marine microalgae during different growth phases

2.1.1 指數(shù)生長前期脂肪酸分布 由圖2可知,5種海洋微藻在指數(shù)生長前期脂類組成主要是以細胞膜脂為主,其中尤以16∶0和18∶0 2種飽和脂肪酸為主, 16∶0含量最高。而14∶0在多種微藻中也可檢出,但含量相對較低。細胞內(nèi)脂含量較低,種類較少,主要也是以16∶0和18∶0 2種飽和脂肪酸為主,16∶0含量最高。細胞內(nèi)與細胞膜中不飽和脂肪酸種類較少。

指數(shù)生長前期的青島大扁藻,主要的細胞膜脂肪酸包括16∶0(39.01%),18∶0(25.48%),少量的14∶0與18∶2。細胞內(nèi)組分包含3種飽和脂肪酸14∶0,16∶0,18∶0但含量都不高。在細胞膜與細胞內(nèi)都檢出了多不飽和脂肪酸22∶6。

指數(shù)生長前期的鹽藻,細胞膜中16∶0,18∶1,18∶0在總脂肪酸中的比例接近60%;還檢出2種多不飽和脂肪酸16∶2與18∶2,但含量較低。細胞內(nèi)脂肪酸含量為19.77%,種類較少,僅含有3種飽和脂肪酸14∶0,16∶0,18∶0。

塔瑪亞歷山大藻在指數(shù)生長前期細胞膜與細胞內(nèi)脂肪酸組成相似,都是以短鏈飽和脂肪酸為主,16∶0, 18∶0含量較多,不飽和脂肪酸主要是C18系脂肪酸。在細胞膜中檢出14∶0,但含量極少(0.52%)。

指數(shù)生長前期的三角褐指藻,相對于前3種藻,細胞膜脂含量較低,而細胞內(nèi)脂含量較高(見表1)。細胞膜脂肪酸包括較多的16∶0(25%)與18∶0(10.64%)以及少量的14∶0與20∶5。細胞內(nèi)除3種飽和脂肪酸14∶0,16∶0,18∶0外,還發(fā)現(xiàn)少量多不飽和脂肪酸18∶2。

指數(shù)生長前期的聚球藻,細胞膜與細胞內(nèi)脂肪酸都是以16∶0與18∶0為主,以及少量的14∶0。細胞膜中檢出3種不飽和脂肪酸16∶1,18∶2,20∶5,其中20∶5含量最高(5.94%)。細胞內(nèi)僅包括1種多不飽和脂肪酸18∶2。

2.1.2 穩(wěn)定期后期脂肪酸分布 進入穩(wěn)定期后期,5種微藻體內(nèi)脂肪酸組成較指數(shù)生長前期有一定差異,不飽和脂肪酸種類明顯增多。經(jīng)過硅膠層析后,我們發(fā)現(xiàn),穩(wěn)定期藻體細胞膜脂以16∶0及C18系脂肪酸為主,其中16∶0,18∶1含量較高,18∶0相對較低。微藻細胞內(nèi)脂肪酸的相對含量明顯增高。

青島大扁藻在穩(wěn)定期后期細胞膜脂肪酸的含量略高于指數(shù)生長前期,占總脂肪酸的87.36%(見表1),細胞膜脂肪酸含量從高到低依次為18∶1,16∶0,16∶1,還包括少量18∶0與16∶2,而該藻體在指數(shù)生長前期細胞膜中含量最高組分為16∶0。細胞內(nèi)脂肪酸含量低于指數(shù)生長前期,未檢出16∶2,其余脂肪酸與細胞膜組分相同,但含量都很少。在細胞膜與細胞內(nèi)都檢出長鏈多不飽和脂肪酸20∶5與22∶6。

穩(wěn)定期后期的鹽藻,細胞膜中主要脂肪酸含量從多到少依次為包括18∶1,16∶0,16∶1,18∶0,多不飽和脂肪酸20∶5(4.4%)與18∶2(4.24%)含量相對較高。細胞內(nèi)脂肪酸以16∶0與18∶1為主。

塔瑪亞歷山大藻在穩(wěn)定期后期細胞膜與細胞內(nèi)脂肪酸種類相同,各自含量較指數(shù)生長前期都有所增加。相對于前3種藻,塔瑪亞歷山大藻細胞內(nèi)與細胞膜中14∶0含量較多。細胞膜中16∶0含量最高(25.47%);從圖2可以看出,隨不飽和度降低,細胞膜中C18系列脂肪酸濃度依次降低;長鏈多不飽和脂肪酸20∶5與22∶6含量相對較高,都在9%左右。細胞內(nèi)主要脂肪酸含量從高到低依次為16∶0,18∶1,18∶0,其余組分含量很少。

穩(wěn)定期后期三角褐指藻細胞膜脂主要以16∶0 (43.03%)為主,其含量遠高于其他組分。而細胞內(nèi)含量最高的脂肪酸為16∶1(14.07%),16∶0次之(8.54%)。細胞膜與細胞內(nèi)18∶0含量都較各自在指數(shù)生長前期同種物質(zhì)的含量有所降低。

聚球藻在穩(wěn)定期后期的細胞內(nèi)脂肪酸含量遠高于指數(shù)生長前期,達到總脂肪酸比例的60.07%,其中16∶0比例最高,其它脂肪酸含量均低于5%。主要細胞膜脂肪酸包括16∶0與20∶5,而該藻指數(shù)生長前期細胞膜中除16∶0與20∶5外,還含有一定量的18∶0。

3 討論

本研究通過對5種海洋微藻細胞的脂類化合物進行硅膠層析,分離出細胞膜脂類和胞內(nèi)物質(zhì),分別比較了不同生長階段二者間的脂肪酸組成異同。

比較指數(shù)生長前期的五種微藻可以發(fā)現(xiàn):鹽藻、三角褐指藻與聚球藻不飽和脂肪酸種類以及含量相對其他2種藻較高;5種藻體內(nèi)大部分不飽和脂肪酸都存在于細胞膜上,這說明在指數(shù)生長前期不飽和脂肪酸是細胞膜的重要組成物質(zhì)之一。細胞膜組分的脂肪酸種類要多于胞內(nèi)物質(zhì);2種組分在指數(shù)生長前期均以飽和脂肪酸為主,不飽和脂肪酸種類及含量都相對較少。

進入穩(wěn)定期后期,5種微藻體內(nèi)脂肪酸種類明顯增多,組成較指數(shù)生長前期有一定差異,不飽和脂肪酸種類明顯增多。藻體細胞膜中以16∶0及C18系脂肪酸為主,其中,大多數(shù)微藻以16∶0與18∶1含量較高。細胞內(nèi)脂中不飽和脂肪酸濃度要高于飽和脂肪酸,但胞內(nèi)物質(zhì)的脂肪酸整體濃度分布仍要低于細胞膜脂類。

通過比較不同組分、不同生長時期的脂肪酸組成與含量我們發(fā)現(xiàn):細胞膜脂(極性脂)一般為這5種微藻的主要脂類,是長鏈多元不飽和脂肪酸(如20∶5, 22∶6)的主要提供者,細胞內(nèi)脂(中性脂)含短鏈脂肪酸較多(如C16系與C18系脂肪酸),為主要的儲存脂類,這與俞建江等[14]的研究結(jié)果一致。另外,對于塔瑪亞歷山大藻、三角褐指藻與聚球藻,這3種藻細胞內(nèi)脂(中性脂)的含量在穩(wěn)定期高于指數(shù)生長前期,塔瑪亞歷山大藻、三角褐指藻中細胞膜脂的含量比較穩(wěn)定,但聚球藻中細胞膜脂在穩(wěn)定期略有下降,這與魏東等[15]對后棘藻(Ellipsoidionsp.)與眼點擬微綠球藻(N annochloropsis oculata)的研究結(jié)果有一定的相似性。此外Emdadi等[16]、Dunstan等[10]也報道指出,中性脂(主要是三酰甘油)在穩(wěn)定期積累[17]。因為細胞進入穩(wěn)定期后,培養(yǎng)基中氨基酸合成所必需的氮減少,細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成量降低,光合作用所同化的碳進入到碳水化合物和脂肪(多為三酰甘油)中,出現(xiàn)能量積累的趨勢[7,18]。

此外,由圖2可以看出,對于細胞內(nèi)組分,青島大扁藻與鹽藻中14∶0,16∶0,18∶0,塔瑪亞歷山大藻與三角褐指藻中16∶0,18∶0,18∶2在指數(shù)生長前期的含量要遠遠高于其穩(wěn)定期含量。據(jù)文獻報道,微藻為了生存需要,在新陳代謝過程中會利用部分脂類化合物形成儲能物質(zhì),在環(huán)境中營養(yǎng)元素缺乏或光缺乏的條件下,為了維持自身生長需要,這部分物質(zhì)的含量會隨藻類的生長及環(huán)境變化而變化[19]。本實驗采用一次培養(yǎng)過程,只添加一次營養(yǎng)鹽,藻類會在營養(yǎng)缺乏的后期,消耗體內(nèi)的儲能物質(zhì),造成部分脂肪酸的減少,故說明上述幾種在穩(wěn)定期后期含量減少的脂肪酸是各種藻體內(nèi)儲存能量物質(zhì)的組分。

總的來說,在微藻生長的不同時期,細胞內(nèi)脂、中間產(chǎn)物、細胞膜脂含量及各自的脂肪酸組成明顯不同,不同的微藻差別較大。無論是指數(shù)生長前期還是穩(wěn)定期后期,胞內(nèi)物質(zhì)的脂肪酸含量明顯要低于細胞膜組分,細胞內(nèi)與細胞膜中主要組成是C16系與C18系脂肪酸。

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Abstract: To examine composition of algal fatty acids,five marine microalgae were cultured and harvested at logarithmic and stationary phases.Their membrane and intracellular fatty acids were separated by silica gel column due to the polarity.Quantification and identification of fatty acids were performed on GC and GC-MS.Experimental results showed that the composition and concentration of membrane and intracellular fatty acids were apparently different during the two growth phases.Content of intracellular fatty acids were lower than that of membrane composition at both growth stage,C16and C18fatty acids were dominated composition in membrane and intracellular components.

Key words: marine microalgae;membrane and intracellular fatty acids;fatty acid composition

責任編輯 徐 環(huán)

The Fatty Acid Composition in Membrane and Intracellular Components of Five Species of Marine Microalgae

SUN Shu-Qin1,WAN GJiang-Tao1,SUN Bao-Wei1,ZHENG Yu1,SUN Ming-Yi1,2
(1.Key Laboratory of Marine Chemistry Theory and Technology,Ministry of Education,Ocean University of China,Qingdao 266100,China;2.Department of Marine Sciences,University of Georgia,Athens,GA 30602-3636,USA)

P736.4

A

1672-5174(2010)09Ⅱ-191-06

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃項目(2001CB409703);國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃項目(2006AA09Z176);中國海洋大學綠卡教授項目資助

2009-03-06;

2009-11-04

孫書勤(1983-),女,碩士生。E-mail:sqsun1983@hotmail.com

E-mail:jtwang@ouc.edu.cn