Smad3基因剔除的骨髓細胞移植對小鼠的影響

陳靜,沈紅,趙勇

(1.北京農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)技術(shù)系,北京 102206;2.中國科學(xué)院動物研究所生物膜與膜生物工程國家重點實驗室,北京 100101)

研究報告

Smad3基因剔除的骨髓細胞移植對小鼠的影響

陳靜1,2,沈紅1,2,趙勇2

(1.北京農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)技術(shù)系,北京 102206;2.中國科學(xué)院動物研究所生物膜與膜生物工程國家重點實驗室,北京 100101)

目的 通過小鼠骨髓細胞剔除Sm ad3基因,觀察小鼠病理變化以及免疫T細胞狀態(tài)。方法將Sm ad3基因剔除Sm ad3-/-)的小鼠骨髓細胞和野生型(Sm ad3+/+)小鼠骨髓細胞分別移植給60Co射線照射GFP小鼠。觀察骨髓移植后GFP小鼠體征變化,第6周處死小鼠,取腸道固定,HE染色觀察其病理變化,流式細胞技術(shù)檢測淋巴結(jié)中T細胞變化。結(jié)果移植Sm ad3-/-骨髓細胞的GFP小鼠逐漸消瘦,大腸出現(xiàn)炎癥;淋巴結(jié)中活化型的CD 4+CD 62LloT細胞增多。結(jié)論骨髓細胞TGF-β信號受阻,可導(dǎo)致小鼠患炎癥疾病,引起免疫T細胞活化。

Sm ad3基因剔除-;骨髓細胞;T細胞活化;移植

Sm ad3基因調(diào)控S MAD 3表達,S MAD 3是轉(zhuǎn)化生長因子-β(transfor m ing grow th factor-β,TGF-β)受體的底物之一,將TGF-β與其受體結(jié)合后產(chǎn)生的信號從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)到細胞核內(nèi)[1]。哺乳動物體內(nèi), TGF-β有3種亞型:TFG-β1、TFG-β2和TFG-β3[2]。TFG-β1主要在免疫系統(tǒng)表達,調(diào)節(jié)T細胞的發(fā)育、穩(wěn)定、活化以及耐受等[3,4],TGF-β2與TGF-β3在免疫系統(tǒng)表達不穩(wěn)定[5]。細胞表面TGF-β受體有三種亞型,即TGF-βI型受體、TGF-βII型受體和TGF-βIII型受體,TGF-βI型和II型受體是TGF-β信號通路必須的[6]。TGF-β首先與II型受體結(jié)合形成復(fù)合物,這種復(fù)合物使I型受體聚集并磷酸化,然后TGF-βI型受體胞內(nèi)區(qū)使S MAD2或S MAD 3磷酸化并形成復(fù)合物,然后這種復(fù)合物與Sm ad4蛋白結(jié)合,進入細胞核,調(diào)節(jié)特定靶基因的轉(zhuǎn)錄[7]。研究發(fā)現(xiàn)Sm ad3基因剔除(Sm ad3-/-)小鼠由于免疫缺陷在1～8個月內(nèi)死亡,通過表型分析發(fā)現(xiàn)Sm ad3-/-小鼠發(fā)生漸進性的白細胞增多癥、牙周炎、胃炎、腸炎以及黏膜表面形成膿腫,通過分析淋巴結(jié)T細胞免疫表型發(fā)現(xiàn)T細胞活化[8]。本實驗試圖通過在小鼠骨髓細胞剔除Sm ad3基因,觀察小鼠是否也會出現(xiàn)疾病癥狀,T細胞是否也被活化,以便探討Sm ad3基因剔除(Sm ad3-/-)與發(fā)病的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 動物

6～8周Sm ad3-/-小鼠和Sm ad3+/+小鼠(H-2d,♀),體質(zhì)量18～20g,購于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心(STXK(京)2008-0012);8～10周GFP小鼠(H-2d,♀),體質(zhì)量20～24g,購于上海實驗動物中心(SYXK(滬)2007-0005);小鼠全為SPF級,飼料和墊料均經(jīng)60Co輻照處理,飲用水經(jīng)高壓滅菌處理,所有小鼠飼養(yǎng)于中國科學(xué)院動物研究所SPF級動物房。

1.2 主要試劑與儀器

PE-Cy5-CD 4 mAb,PE-CD 8 mAb,PE-CD 62L mAb均購自BD B iosciences Phar m ingen公司。FASCalibu r流式細胞儀(Becton D ickinson),臺式冷凍離心機(德國Heraeus),光學(xué)顯微鏡(日本O lympus)XG-1型照相機(M inolta日本)。

1.3 嵌合體小鼠模型的建立

1.3.1 GFP小鼠預(yù)處理:移植前4～5 h,正常GFP小鼠接受60Co全身照射7.5 Gy,劑量率為1 Gy/m in。

1.3.2 骨髓細胞制備:分別取Sm ad3-/-小鼠及Sm ad3+/+小鼠,頸椎脫臼致死,無菌剝?nèi)∶劰?、股骨和髂?收集骨髓細胞,1600 r/m in,離心6 m in,棄上清,加紅細胞裂解液消化,1640培養(yǎng)液洗3次,計數(shù),將骨髓細胞調(diào)為7.2×106個/m L。

1.3.3 骨髓移植:取經(jīng)照射處理的GFP小鼠,靜脈注射骨髓細胞7.2×106個/只。

1.3.4 實驗分組:分為2組,每組4只。對照組為Sm ad3+/+骨髓細胞移植給照射后GFP小鼠,實驗組為Sm ad3-/-骨髓細胞移植給照射后GFP小鼠。

1.4 觀察小鼠臨床表現(xiàn)

觀察GFP鼠移植骨髓細胞后精神狀態(tài)、毛發(fā)、體重、活動等。

1.5 病理學(xué)檢查

第6周小鼠頸椎脫臼致死,剖開腹腔取小鼠的盲腸、橫結(jié)腸、直腸,用10%中性福爾馬林固定,制成石蠟切片(厚5μm),HE染色,光鏡下觀察小鼠盲腸、結(jié)腸、直腸的組織學(xué)變化。

1.6 T細胞檢測

骨髓移植后第6周小鼠頸椎脫臼致死,取小鼠淋巴結(jié)制備單細胞懸液,加入FACS緩沖液(PBS+ 0.1%BSA+0.2%Na3N),將細胞稀釋成4×106個/mL;取100μL懸浮的細胞,加入不同熒光標記的抗體各10μL,混勻,4°C孵育30 m in;加FACS緩沖液,1700 r/m in,離心5 m in,洗去游離抗體;重懸細胞,上流式細胞儀檢測,CellQuest softw are進行結(jié)果分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 骨髓移植后小鼠臨床表現(xiàn)

骨髓移植后對照組小鼠開始出現(xiàn)精神萎靡、嗜睡、活動及進食減少癥狀,7d左右精神與活動逐漸恢復(fù),所有小鼠6周內(nèi)生存狀況良好。實驗組小鼠骨髓移植第1周表現(xiàn)與對照組相似。第2周以后小鼠逐漸出現(xiàn)毛發(fā)雜亂,失去光澤,背部脫毛;弓背;耳朵潰爛;部分小鼠有軟便甚至腹瀉,糞便顏色發(fā)黑。

2.2 骨髓移植后小鼠體重變化

移植骨髓細胞后小鼠每周稱重,結(jié)果用移植后小鼠體重占最初體重的百分比表示,結(jié)果見圖1。由圖1知,對照組小鼠體重百分比變化不大,體重基本穩(wěn)定。實驗組小鼠從第1周開始體重逐漸減輕,至第6周時體重百分比從100%下降至77.5%,平均減輕22.5%。

圖1 骨髓移植后小鼠體質(zhì)量變化F ig.1 The changes of bodyweight in the m ice after transfusion of bone m arrow cells.

2.3 骨髓移植后小鼠腸道剖檢變化

骨髓移植后第6周處死所有小鼠,剖開小鼠腹腔,取出腸道,肉眼觀察腸道變化,發(fā)現(xiàn)對照組小鼠小腸未見異常,盲腸到直腸也為出現(xiàn)明顯病變(圖2上);實驗組小鼠小腸無明顯病變,盲腸到直腸水腫,充血,腸壁增厚,結(jié)腸腸管變形縮短(圖2下)。圖2見彩插3。

2.4 骨髓移植后小鼠腸道組織病理變化

HE染色小鼠腸道,組織病變結(jié)果見圖3。由圖3知,對照組小鼠盲腸、結(jié)腸、直腸都未發(fā)生明顯病變(A、C、E)。實驗組小鼠結(jié)腸、直腸、盲腸都發(fā)生明顯病變,腸道病變主要集中在上皮,表現(xiàn)為上皮腺體層增厚,黏膜層有大量的炎性細胞浸潤(B、D、F);結(jié)腸黏膜形成息肉狀突起(B箭頭所示),直腸黏膜有潰瘍(D箭頭所示);盲腸腸道肌層增厚(F箭頭所示)。圖3見彩插3。

2.5 骨髓移植后小鼠淋巴結(jié)中T細胞變化

GFP小鼠細胞均表達綠色熒光蛋白,Sm ad3小鼠來源的細胞不表達綠色熒光蛋白,所以試驗分析GFP小鼠淋巴結(jié)中GFP陰性T細胞,即供者骨髓細胞發(fā)育成熟的T細胞,流式細胞儀分析結(jié)果顯示GFP小鼠淋巴結(jié)細胞中GFP陰性細胞的比例是98%±1%(數(shù)據(jù)沒有顯示)。用抗小鼠PE-CY5-CD4抗體和PE-CD62L抗體對淋巴結(jié)細胞染色的結(jié)果見圖4A,左上象限的一群細胞是CD 4+CD 62LloT細胞,從圖中可以看出實驗組小鼠淋巴結(jié)細胞中CD4+CD62LloT細胞的比例明顯增大(圖4B)。圖4見彩插3。

3 討論

Sm ad3蛋白是TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞內(nèi)信號分子,Sm ad3蛋白缺失,TGF-β/Sm ad3信號通路就被阻斷了[8]。Sm ad3-/-小鼠體內(nèi)所有類型的細胞內(nèi)均不表達Sm ad3蛋白,即所有細胞TGF-β/Sm ad3信號通路都被阻斷。GFP小鼠經(jīng)60Co射線全身照射7.5 Gy以后,損傷骨髓、脾和淋巴結(jié)等生成血細胞的造血器官,骨髓細胞基本被清除,血液中的白細胞液急劇減少。本實驗把Sm ad3-/-小鼠的骨髓細胞移植給經(jīng)60Co射線清髓處理的GFP小鼠,來源于Sm ad3-/-小鼠的骨髓細胞在GFP小鼠體內(nèi)生長、發(fā)育、分化,重建GFP小鼠的造血系統(tǒng)。實驗觀察到移植了Sm ad3-/-骨髓細胞的GFP小鼠1周以后漸漸出現(xiàn)弓背、脫毛、腹瀉、體重下降等癥狀;組織病理檢查發(fā)現(xiàn)大腸出現(xiàn)炎癥,說明GFP小鼠重建的TGF-β/Sm ad3信號缺失的造血系統(tǒng)導(dǎo)致小鼠患病。

研究TGF-β1信號分子在造血和免疫系統(tǒng)中的作用,主要針對3類靶分子進行基因干預(yù):TGF-β (使內(nèi)源性分泌缺失)、TGF-β受體(使細胞對TGF-β的反應(yīng)性消失)和胞內(nèi)信號分子Sm ads(使信號傳遞受阻)。在胚胎干細胞敲除Tgfb1(TGF-β1 gene),出生的小鼠體內(nèi)沒有內(nèi)源性TGF-β1,2～3周內(nèi)正常發(fā)育,但隨后很快出現(xiàn)消耗、衰竭癥狀,3～4周內(nèi)死亡,組織學(xué)分析發(fā)現(xiàn)小鼠心臟、胃、肝、肺、胰腺、唾液腺等多系統(tǒng)有不同程度的混合炎性細胞浸潤和組織壞死,而皮膚、胸腺、骨髓沒有明顯的炎癥累及,同時檢測到大量的T細胞活化擴增[9,10]。由于TGF-β1可調(diào)節(jié)多種類型的細胞,不能確定小鼠疾病是免疫功能紊亂引起的。后來的研究利用顯性負效轉(zhuǎn)基因技術(shù),使發(fā)育正常的小鼠在成體水平特異性在T細胞上缺失TGF-βII型受體(T細胞上仍然表達TGF-βII型受體,只是受體胞內(nèi)區(qū)不起作用),小鼠發(fā)生淋巴細胞增殖綜合征和免疫病理變化,病變主要發(fā)生在黏膜器官,例如肺和結(jié)腸,與Tgfb1-/-小鼠相比,這些小鼠的疾病癥狀時間上明顯延遲出現(xiàn),并且這些病癥沒有特征,例如心肌炎、血管炎和肝炎[11]。又有研究在T細胞上條件性敲除Tgfbr2(TGF-βrecep ter II gene),小鼠患有與Tgfb1-/-小鼠組織受損程度相似的同樣嚴重的自身免疫疾病,肺臟、胃、肝臟、胰臟、心臟和血管是受影響較大的組織,在肉眼可見和組織學(xué)水平,受損都相當嚴重[3,12]?；蚋深A(yù)TGF-β細胞內(nèi)信號分子Sm ads蛋白,已有的研究主要是在胚胎干細胞敲除Sm ad2、Sm ad4和Sm ad3基因。Sm ad2或Sm ad4基因敲除,導(dǎo)致小鼠在胚胎期死亡[13,14]。Sm ad3基因剔除小鼠可以活到成年,但是也發(fā)生多器官炎癥,在1～8月內(nèi)死亡[8]。本研究觀察到移植了Sm ad3-/-骨髓細胞的GFP小鼠1周以后漸漸出現(xiàn)弓背、脫毛、腹瀉、體重下降等癥狀,并且伴有腸炎,這些癥狀與Sm ad3基因剔除小鼠的癥狀相似,并且再一次證明Sm ad3基因剔除,容易導(dǎo)致結(jié)腸炎[15];與Tgfb1-/-小鼠癥狀相似都出現(xiàn)消耗衰竭癥狀,與TGF-β受體缺失小鼠的癥狀也相似,都出現(xiàn)結(jié)腸發(fā)生炎癥。

CD 62L是一種粘附分子,靜息的淋巴結(jié)T細胞上高表達CD 62L(CD 62Lhigh,CD 62Lhi),T細胞活化以后CD62L的表達降低(CD 62Llow,CD 62Llo),淋巴結(jié)中具有CD 4+CD 62Llo表型的T細胞增多,提示了淋巴結(jié)CD 4+T細胞活化,這種T細胞表型與Sm ad3-/-小鼠淋巴結(jié)T細胞的表型變化一致?；罨腡細胞浸潤腸道黏膜,很可能是造成結(jié)腸炎的原因[16]。

(本文圖2～4見彩插3。)

[1] Shi Y,M assague J.M echanism s of TGF-beta signaling from cell membrane to the nucleus[J].Cell,2003.113(6):685-700.

[2] Derynck R,Zhang YE.Smad-dependent and Smad-independent pathways in TGF-beta fam ily signalling[J].Nature,2003.425 (6958):577-584.

[3] L iMO,Sanjabi S,Flavell RA.Transform ing grow th factor-beta contro ls developm ent,hom eostasis,and to lerance of T cells by regu lato ry T cell dependent and independent m echanism s[J]. Imm unity,2006.25(3):455-571.

[4] L iMO,FlavellRA.TGF-beta:a m aster of all T cell trades[J]. Cell,2008.134(3):392-404.

[5] Gorelik L,Flavell RA.Transform ing grow th factor-beta in T-cell bio logy[J].Nat Rev I mm uno l,2002.2(1):46-53.

[6] ten D ijke P,H ill CS.New insigh ts into TGF-beta-Sm ad signalling[J].TrendsB iochem Sci,2004.29(5):265-273.

[7] Held in CH,M iyazono K,ten D ijke P.TGF-beta signalling from cell m em b rane to nucleus through S MAD p roteins[J].Nature, 1997.390(6659):465-471.

[8] Yang X,Letterio JJ,Lech leider RJ,et al.,Targeted disrup tion of S MAD 3 resu lts in impaired m ucosal imm unity and d im inished T cell responsiveness to TGF-beta[J].Em bo J,1999.18(5): 1280-1291.

[9] Shu llMM,O r m sby I,Kier A,et al.Targeted disrup tion of the mouse transform ing grow th fac tor-β1 gene resu lts in m u ltifocal inflamm atory disease[J].Nature 1992,359:693-699.

[10] Kulkarni AB,Huh CG,Becker D,et al.Transfor m ing grow th factor beta 1 nu llm utation in m ice causes excessive inflamm atory response and early death[J].Proc NatlA cad SciU SA,1993. 90(2):770-774.

[11] Gorelik L,Flavell RA.Abrogation of TGFbeta signaling in T cells leads to spontaneous T cell differentiation and autoimm une disease[J]. Immunity,2000,12(2):171-181.

[12] M arie JC,L iggittD,Rudensky AY.Cellu larm echanis m sof fatal early-onset au toimm unity inm icew ith the T cell-specific targeting of transfo rm ing grow th factor-βrecep tor[J]. Imm unity,2006, 25:441-454.

[13] Sirard C,de la Pompa JL,Elia A,et al.The tumor supp resso r gene Sm ad4/Dpc4 is required for gastru lation and later fo r anterior developm ent of the mouse em bryo[J].Genes Dev, 1998.12(1):107-119.

[14] W ald rip WR,B ikoff EK,Hood less PA,et al.Sm ad2 signaling in extraem bryonic tissues determ ines an terior posterior po larity of the earlymouse em bryo[J].Cell,1998,92(6):797-808.

[15] Zanninelli G,Vetuschi A,Sferra R,et al.Sm ad3 knock-out m ice as a usefu lmodel to study intestinal fibrogenesis[J].W o rld J Gastroen tero l,2006.12(8):1211-1218.

[16] Becker C,Fantini MC,Neurath M F.TGF-beta as a T cell regu lator in co litis and co lon cancer[J].Cytokine Grow th Fac to r Rev,2006,17(1-2):97-106.

I m pact of Sm ad3 Gene Knockou t BoneM arrow Tran sp lan ta tion on M ice

CHEN Jing1,2,SHEN Hong1,2,ZHAO Yong2
(1.Departm ent ofAnim al Science and Techno logy;BeijingUniversity of Agricu lture,Beijing 102206,China; 2.State key Laboratory ofB iom em brane andM em brane B iotechno logy,Institute of Zoo logy, Chinese A cadem y of Sciences,Beijing 100101)

O b jective To investigate the changes of T cells and disease developm ent in the m ice w ith Sm ad3 deficiency in the bone m arrow cells.M ethods Bone m arrow cells obtained from Sm ad3 nu ll(Sm ad3-/-)m ice and w ild type(Sm ad3+/+)m ice were in jected to Co60-irradiated GFP m ice,respectively.The general states of the bone m arrow recip ientswere observed.Them icewere sacrificed at the sixthweek and the histopatho logical changes in the intestineswere exam ined.The changes of T cells from lymph nodes were detected by flow cytom etry.ResultsSm ad3-/-bone m arrow recip ientm ice appeared a wasting synd rom e and intestinal inflamm ation.The amount of CD4+CD 62LloT cells in lymph nodeswas significantly increased.ConlusionThese resu lts indicate that the m ice w ith Sm ad3 deficiency in the bone m arrow cells p resen t an inflamm ato ry d iso rder and their T cells are activated.

Sm ad3-/-;bone m arrow;A ctivated T cells;Transp lantation,bone m arrow;Mouse

R457.7

A

1005-4847(2010)01-0009-04

2009-03-20

國家自然科學(xué)基金重點項目(No.30630060);北京市教委資助項目(K M 200910020006)。

陳靜(1982-),女,河南省鞏義市人,碩士研究生。

沈紅,E-m ail:shenhong912@sina.com;趙勇,E-m ail:zhaoy@ioz.ac.cn