超早期高壓氧對脊髓完全橫斷損傷大鼠血液生化及后肢運(yùn)動功能的影響

童敏，伍賢平，陳軍，劉敏

(1.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院動物實驗室，長沙 410011;2.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院代謝內(nèi)分泌所，長沙 410011; 3.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院康復(fù)科，長沙 410011)

研究報告

超早期高壓氧對脊髓完全橫斷損傷大鼠血液生化及后肢運(yùn)動功能的影響

童敏1，伍賢平2，陳軍1，劉敏3

(1.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院動物實驗室，長沙 410011;2.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院代謝內(nèi)分泌所，長沙 410011; 3.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院康復(fù)科，長沙 410011)

目的探討超早期高壓氧(HBO)治療對脊髓完全橫斷損傷模型血液生化及后肢運(yùn)動功能的影響。方法55只SD大鼠隨機(jī)分為A組(假手術(shù)組，15只)、B組(模型組，20只)及C組(高壓氧組，20只)，A組僅行椎板切除術(shù)，其余2組均行T10椎板水平脊髓完全橫向切斷術(shù)。B、C組均予常規(guī)護(hù)理，C組于術(shù)后3 h置于動物艙內(nèi)開始高壓氧治療，10 d一療程，共3療程。分別于建立模型后第1～6周末，用BBB運(yùn)動功能評分法評價并比較兩組大鼠后肢運(yùn)動功能恢復(fù)程度，術(shù)后第6周過量麻醉處死大鼠，以40 g/L多聚甲醛行心室－主動脈灌注，取脊髓損傷區(qū)標(biāo)本，光鏡觀察損傷脊髓的組織病理學(xué)改變。檢測血鈣(Ca)、血磷(P)、血清堿性磷酸酶(ALP)改變情況。結(jié)果B、C兩組大鼠術(shù)后第1～6周BBB運(yùn)動功能評分逐漸增高，C組在3～6周末的BBB運(yùn)動功能評分均明顯高于B組。B組、C組血鈣、血磷在術(shù)后1、3周高于A組，血清堿性磷酸酶(ALP)術(shù)后1、3周低于A組;C組血鈣、血磷在術(shù)后5、6周低于B組。病理組織切片觀察C組較B組組織水腫減輕，炎性細(xì)胞浸潤減輕。結(jié)論超早期高壓氧治療能促進(jìn)脊髓完全橫斷損傷大鼠后肢運(yùn)動功能的部分恢復(fù)，降低血鈣、血磷含量，對脊髓完全橫斷損傷大鼠具有保護(hù)和治療作用。

高壓氧;脊髓損傷;運(yùn)動功能;BBB評分;血液生化

圖1 假手術(shù)組Fig.1The histological aPPearance of the sPinal cord of a rat from the sham grouP.

圖2 模型組Fig.2The histological aPPearance of the sPinal cord of a rat from the model grouP.

圖3 高壓氧組Fig.3The histological aPPearance of the sPinal cord of a rat from the the hyPerbaric oXygen grouP.

脊髓完全橫斷損傷(complete spinal cord transection injury，CSCT)是一種嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷。常常帶來難以恢復(fù)的感覺運(yùn)動功能障礙，是臨床上至今尚未解決的問題，雖有文獻(xiàn)表明高壓氧治療對不完全脊髓損傷功能恢復(fù)有促進(jìn)作用，且越早效果越好［1－2］，但臨床觀察發(fā)現(xiàn)對CSCT患者術(shù)后早期采用高壓氧綜合治療療效并不理想，脊髓損傷后搶救的黃金時期是0～6 h［3］，故本研究對CSCT大鼠采用超早期高壓氧治療，通過觀察大鼠后肢運(yùn)動功能的恢復(fù)水平及血清中血鈣(Ca)、血磷(P)、血清堿性磷酸酶(ALP)含量變化以探討超早期高壓氧治療對CSCT大鼠脊髓的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 模型建立

1.1.1 動物來源:SD雌性大鼠55只，體質(zhì)量250～300 g，來源于中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院實驗動物室［SCXK(湘)2003－0003］，并按實驗動物使用3R原則給予人道的關(guān)懷。

1.1.2 動物分組:將大鼠隨機(jī)分成3組，即A組(假手術(shù)組，15只)，B組(模型組，20只)及C組(高壓氧組，20只)。A組僅行T10椎板切除，不損傷脊髓，B組與C組均行T10椎板切除并在該水平橫斷脊髓。(因?qū)嶒炋幚磉^程中有大鼠因故死亡，故每組最終大鼠數(shù)量不一，具體只數(shù)見結(jié)果)。

1.1.3 手術(shù)方法:SD大鼠術(shù)前禁食12 h，稱重，采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉(0.3 m L/100g體重，水合氯醛購自中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院制劑室)，俯臥位固定于手術(shù)臺上，胸背部剃毛備皮，75%酒精消毒，鋪消毒巾。按肋骨確定椎體序列，自背部正中切開T8－12椎體水平的皮膚、皮下及筋膜，剝離豎脊肌，暴露T9－11椎體棘突及雙側(cè)椎板。模型組與高壓氧組均切除T10椎板，充分暴露T10椎體水平的脊髓，以彎頭眼科鑷輕輕挑起脊髓并用尖銳刀片橫切脊髓，大鼠即刻出現(xiàn)擺尾，雙下肢抽搐或尿失禁，以無菌紗布按壓止血后逐層縫合。假手術(shù)組僅行T10椎板切除，不損傷脊髓，之后逐層縫合。制成脊髓損傷模型。

1.1.4 護(hù)理:術(shù)后每只大鼠肌內(nèi)注射青霉素16萬U/d，連續(xù)1周。每日定量供應(yīng)充足飼料和水，在安靜、通風(fēng)、清潔環(huán)境下分籠飼養(yǎng)。B、C組兩組均采用相同的護(hù)理，人工排尿:術(shù)后每日早晚2次，排尿時，左手撐起大鼠腹部，右手觸摸找到充盈的膀胱，然后按住膀胱底，自上而下輕柔擠壓，逼尿排出。

1.2 高壓氧治療

C組在脊髓損傷后3h即開始高壓氧治療。將武漢七零一研究所提供的嬰兒純氧艙(YLC0.5/1A型)改作動物艙使用，門縫洗艙法［4］洗艙10 m in至艙內(nèi)氧濃度達(dá)93%～95%，將艙門關(guān)緊，20 m in內(nèi)加壓到2.2個絕對大氣壓(ATA)，穩(wěn)壓40 m in(吸氧濃度97%～99%)，后用15～20 m in勻速減至環(huán)境壓出艙。為保持艙內(nèi)氧濃度穩(wěn)壓全過程持續(xù)低流量等量換氣。10 d一療程，共三個療程，其中第一療程每日2次，第二、三療程每日1次，每療程休息6 d。

1.3 運(yùn)動功能評分

參照Basso等［5］提出的大鼠CSCT后功能評判標(biāo)準(zhǔn)(簡稱BBB評分法)對各實驗動物后肢進(jìn)行評分。BBB評分為總分21分的運(yùn)動功能評分，考察大鼠后肢的運(yùn)動、軀干的位置和穩(wěn)定性、步態(tài)、協(xié)調(diào)性、爪的置放、足趾間隙及尾的位置，表示SCI后大鼠后肢運(yùn)動功能恢復(fù)的過程。BBB評分簡單直觀，易于掌握，與脊髓功能恢復(fù)有極好的一致性，將大鼠置于直徑1 m的平面光滑場地自由活動5 m in，記錄大鼠后肢運(yùn)動情況。自術(shù)后第1～6周末由掌握評分標(biāo)準(zhǔn)的固定3人進(jìn)行盲評。

1.4 標(biāo)本采集

分別于術(shù)后1、3及5、6周評分后采大鼠眶動靜脈血1 m L，血液離心取血清，放于－20℃的冰箱冷凍保存?zhèn)溆?。取材固定和切?以水合氯醛腹腔過量(600 mg/kg)麻醉后，開胸，剪開右心耳，另外經(jīng)心尖插管至升主動脈，在室溫條件下，先以150 m L生理鹽水快速滴注，至流出液清亮為止。繼以250 m L含0.1 moL/L PBS(pH 7.2～7.4)的4%多聚甲醛灌注固定，固定液先快速滴注15 min，然后維持滴注4～5 h，以橫斷處脊髓為中心，取出長約1.5 cm的脊髓組織，并以4%多聚甲醛繼續(xù)固定3 h。保留橫斷處頭、尾兩側(cè)各約0.5 cm脊髓，常規(guī)行冠狀面連續(xù)切片，片厚5 μm。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

用SPSS11.5統(tǒng)計軟件分析，采用單變量方差分析(ANOVA)，組間比較采用LSD檢驗。P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 一般情況觀察

A組大鼠術(shù)后第1天功能恢復(fù)正常。B組、C組大鼠均出現(xiàn)了極為典型的截癱綜合征，雙后肢及尾無活動。術(shù)后1周活動較少，飲食少。B組大便困難伴硬結(jié)，尿潴留、肌張力低、下肢腫脹，部分鼠足部發(fā)生潰瘍，足趾甚至脫落，無明顯對熱、觸、痛刺激的反射; C組2周后部分鼠有明顯的后肢運(yùn)動，平地拖動，有明顯的熱、觸、痛刺激的反射，下肢腫脹恢復(fù)明顯，尿潴留、尿路感染和褥瘡等并發(fā)癥的發(fā)生也明顯降低。實驗期間中B組、C組分別有8只、5只死亡。

2.2 BBB運(yùn)動功能評分

本實驗采用BBB評分方法對大鼠CSCT后6周的后肢運(yùn)動功能進(jìn)行評分。BBB評估系統(tǒng)認(rèn)為正常狀態(tài)為21分，后肢全癱為0分。結(jié)果發(fā)現(xiàn)CSCT后24 h A組評分為21分，功能恢復(fù)正常。B組、C組均出現(xiàn)了極為典型的截癱綜合征，雙后肢及尾無活動，BBB評分為0分。術(shù)后第2周，B組、C組后肢運(yùn)動功能均有所改善，但兩組差異并不明顯。C組術(shù)后第3周部分鼠開始恢復(fù)后肢關(guān)節(jié)運(yùn)動功能，后肢肌肉萎縮程度較B組輕，與B組相比差異有顯著性(P＜0.05)。詳見表1。

表1 三組大鼠不同時間點(diǎn)后肢運(yùn)動功能BBB評分比較(±s)Tab.1 BBB scoring of the rats in the three groups at different times after CSCT(±s)

表1 三組大鼠不同時間點(diǎn)后肢運(yùn)動功能BBB評分比較(±s)Tab.1 BBB scoring of the rats in the three groups at different times after CSCT(±s)

注:與同組上一個時間點(diǎn)比較:﹟P＜0.05;△P＜0.05;與A組同一時間點(diǎn)比較:﹟P＜0.01;△P＜0.01;與B組同一時間點(diǎn)比較:△P＜0.05Note:﹟P＜0.05，△P＜0.05:compared with the last week's scoring:﹟P＜0.01，△P＜0.01:compared with the group A at the same time:△P＜0.05:compared with the group B at the same time.

組Group數(shù)n第1周First week第2周Second week第3周Third week第4周Fourth week第5周Fifth week第6周Seventh week A組15 21.00±0.01 21.00±0.01 21.00±0.01 21.00±0.01 21.00±0.01 21.00±0.01 B組12 0.17±0.34 1.08±0.22﹟2.52±0.65﹟2.74±0.43﹟3.55±0.32﹟4.58±0.39﹟C組15 0.35±0.31 1.98±0.12 5.22±0.15△6.35±0.23△7.15±0.42△8.38±0.39△

2.3 組織病理學(xué)觀測

假手術(shù)組(圖1)大鼠脊髓灰、白質(zhì)組織結(jié)構(gòu)完整，神經(jīng)細(xì)胞在灰質(zhì)中分布均勻，形態(tài)正常，白質(zhì)內(nèi)神經(jīng)纖維排列整齊，細(xì)胞間質(zhì)均勻。模型組(圖2)損傷區(qū)灰質(zhì)出現(xiàn)大片出血，細(xì)胞腫脹，細(xì)胞空泡變性。高壓氧組(圖3)與模型組(圖2)相比，白質(zhì)水腫減輕，炎性細(xì)胞浸潤減輕，空泡變性減輕。詳見圖1～3。

2.4 血液生化結(jié)果

血清樣品經(jīng)Hitachi7170A自動生化分析儀自動采樣化驗。B組、C組血鈣、血磷在術(shù)后1、3周高于A組(P＜0.05)，血清堿性磷酸酶(ALP)術(shù)后1、3周低于A組(P＜0.05);C組血鈣、血磷在術(shù)后5、6周低于B組(P＜0.05)。結(jié)果見表2。

3 討論

3.1 超早期高壓氧對脊髓完全損傷大鼠后肢運(yùn)動功能的影響

脊髓損傷動物模型的研究中，后肢運(yùn)動功能觀察可客觀評價干預(yù)措施對脊髓損傷修復(fù)的效果，本實驗中結(jié)果顯示假手術(shù)組與其他兩組比較，雙后肢BBB評分均明顯高于其他兩組，差異有顯著性(P＜0.01)，說明造模成功。模型組在沒有接受任何治療的情況下、雙后肢運(yùn)動功能在1～6周末有一定程度恢復(fù)，這種自發(fā)的后肢運(yùn)動功能恢復(fù)是低等動物具有的一種脊髓功能代償形式而并非由脊髓組織修復(fù)引起［6］。超早期高壓氧組術(shù)后3～6周末BBB評分與模型組比較，均明顯高于模型組，差異有顯著性(P＜0.05)，說明超早期高壓氧治療對CSCT后肢運(yùn)動功能有一定改善。分析其可能的機(jī)理:脊髓損傷后神經(jīng)細(xì)胞水腫以及氧自由基引發(fā)的脂質(zhì)過氧化，造成脊髓微循環(huán)障礙。脊髓神經(jīng)組織因缺血缺氧出現(xiàn)繼發(fā)性變性是脊髓功能難以恢復(fù)的主要原因［7］。超早期高壓氧是在脊髓損傷后3h即開始治療，處在搶救損傷脊髓的黃金時期［8］，此期脊髓白質(zhì)尚無水腫［9］，可通過提高血氧分壓，增加血氧含量及氧彌散，迅速改善組織的缺氧狀態(tài)。光鏡下組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn):與B組相比，C組經(jīng)超早期高壓氧治療后，脊髓組織的出血、水腫明顯減輕，壞死區(qū)范圍減小，神經(jīng)功能評分改善。提示超早期高壓氧可能抑制和減輕脊髓水腫發(fā)生，從而可有效阻止脊髓的繼發(fā)性損傷，促進(jìn)原發(fā)性損傷細(xì)胞功能恢復(fù)和細(xì)胞正常代謝，促進(jìn)脊髓功能恢復(fù)。

表2 大鼠生化指標(biāo)測量結(jié)果(±s)Tab.2 The results of biochemical parameters of the rats

表2 大鼠生化指標(biāo)測量結(jié)果(±s)Tab.2 The results of biochemical parameters of the rats

注:與A組比較:﹟P＜0.05;與B組比較:△P＜0.05Note:﹟P＜0.05:compared with the group A;△P＜0.05:compared with the group B.

組別Group周Time (week) n血堿性磷酸酶(U/L)血磷P (mmol/L)血鈣Ca (mmol/L) A組1 15 123.17±12.34 1.17±0.34 2.35±0.08 3 15 124.21±12.34 1.57±0.17 2.22±0.07 5 15 126.32±12.34 1.47±0.08 2.23±0.11 6 15 127.13±7.23 1.49±0.11 2.38±0.05 B組1 20 65.11±10.23#2.51±0.23#2.81±0.13#3 17 94.02±8.34#2.81±0.13#2.86±0.03#5 16 127.32±3.12 2.41±0.12 2.36±0.03 6 12 128.24±2.24 2.55±0.17 2.26±0.16 C組1 20 68.01±8.24#2.41±0.14#2.76±0.35#3 16 78.02±7.25#2.76±0.15#2.83±0.22#5 15 124.12±2.18 1.61±0.02△1.91±0.04△6 15 118.24±7.34 1.55±0.13△1.85±0.12△

3.2 超早期高壓氧對脊髓完全損傷大鼠血液生化的影響

脊髓損傷后肢體廢用，骨質(zhì)缺乏正常的力學(xué)刺激，導(dǎo)致骨形成減弱，骨流失增強(qiáng)，表現(xiàn)為骨組織中鈣大量釋放入血中而致血鈣濃度顯著上升。本實驗中，模型組、高壓氧組大鼠血鈣、血磷于脊髓損傷后第1周、第3周均明顯高于假手術(shù)組，ALP均低于假手術(shù)組，差異有顯著性(P＜0.05)，提示在脊髓損傷早期破骨活性增強(qiáng)，骨吸收增強(qiáng)，成骨代謝受到嚴(yán)重抑制，骨形成減弱［9］。兩組在第5、6周血鈣、血磷均逐漸下降。提示可能隨脊髓損傷時間延長，局部神經(jīng)體液因子、內(nèi)分泌逐漸穩(wěn)定，同時前肢繼續(xù)負(fù)重，存在利于骨形成因素［10］。以上生化結(jié)果表明脊髓損傷后成骨代謝早期有一個顯著抑制期，而破骨活性則逐漸增強(qiáng)，隨著破骨代謝的加強(qiáng)，成骨代謝則由抑制狀態(tài)恢復(fù)到正常水平。高壓氧組第5、6周血鈣、血磷明顯低于模型組(P＜0.05)，相對而言，ALP值有輕度升高趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)意義。說明超早期高壓氧治療對脊髓完全損傷大鼠骨鈣流失有保護(hù)作用。其機(jī)制可能:鈣是一種重要的二價陽離子，參與機(jī)體細(xì)胞的各種代謝過程。脊髓損傷引起細(xì)胞膜對Ca2+通透性增加，Ca2+泵失活及突觸末梢釋放興奮性氨基酸而導(dǎo)致Ca2+大量內(nèi)流，血鈣反映骨吸收，當(dāng)骨吸收增強(qiáng)，較多礦物質(zhì)吸收入血，血鈣上升［11］，鈣超載所引發(fā)的一系列病理生理損害，加重CSCT。超早期高壓氧可能通過提高細(xì)胞膜的抗氧化能力，減少細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流，保護(hù)脊髓細(xì)胞和組織結(jié)構(gòu)，促進(jìn)神經(jīng)纖維再生和傳導(dǎo)功能恢復(fù)，對促進(jìn)骨細(xì)胞活性恢復(fù)有利。

總之。本研究表明超早期高壓氧治療能促進(jìn)CSCT大鼠后肢運(yùn)動功能的部分恢復(fù)，降低血鈣、血磷含量，對CSCT具有保護(hù)和治療作用，為其臨床應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。

(本文圖1～3見彩插6。)

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Effects of Ultra-Early Hyperbaric Oxygen Treatm ent on Blood Biochem ical Param eters and H ind lim b M ovem ent Function in Rats w ith Com p lete Spinal Cord Transection In jury

TONG Min1，WU Xian－Ping2，CHEN Jun1，LIU M in3
(1.Animal Laboatory，2.Institute of Metabolism and Endocrinology，Department of Rheumatism，the Second Xiangya Hospital of the Central South University，Changsha 410000，China)

ObjectiveTo study the effect of ultra－early hyperbaric oxygen(HBO)treatment on hindlimb motor function and the changes of biochemical indexes in complete spinal cord transection rats.M ethods 55 healthy 3－month－old female SD rats were random ly divided into three groups:group A(sham operation group，15 rats)，group B(complete spinal cord transection(CSCT)group，20 rats)and group C(hyperbaric oxygen treatment group，HBO group，20 rats). Rats in the sham operation group underwent laminectomy，while rats in the other 2 groups underwent laminectomy and complete spinal cord transection at the level of the tenth thoracic vertebra.The rats in the HBO group were put in an animal oxygen chamber at the 3rd hour after operation，10 days as 1 course of treatment，for 3 courses，2/d in the first course，1/ d in the second and third courses，respectively，with a 6 days interval between courses.After the model was established，the motor function recovery of hind limb was evaluated by open－field Basso－Beattle－Bresnahan(BBB)scoring，once a weeklasting for 6 weeks.Six weeks after injury，the rats were sacrificed under anesthesia and perfused with 40 g/L citromint through the ascending aorta，samples were taken from the CSCT area and prepared for histopathological examination.The changes of serum biochemical parameters were observed.Results The BBB scores of groups B and C were gradually increased from week 1 to 6，and the BBB scores of group C was significantly higher than that of group B from week 3 to 6(P＜0.05).Compared with the group A，the concentrations of calcium and phosphorus were increased significantly at the 1st and 3rd weeks(P＜0.05)，the concentrations of alkaline phophatase(ALP)were decreased at the 1 st and 3 rd weeks(P＜0.05)in the groups B and C.In the group C the concentrations of calcium and phosphorus were significantly lower than that in the group B at the 5 th and 6 th weeks(P＜0.05).The pathological exam ination of the spinal cord revealed an obvious rerduction of tissue edema and inflammatory infiltration in the rats of group C.ConlusionUltra－early HBO treatment contributes to the motor function recovery of hidnlimb in rats with complete spinal cord trisection injury.Ultraearly HBO treatment can lower the concentration of serum calcium and phosphorus and exert protective effect on the spinal cord in rats.

Hyperbaric oxygen;Complete spinal cord injury;Hindlimb，motor function;BBB scoring;Blood biochemical;Rats

R651.2

A

1005－4847(2010)03－0212－04

2009－09－29

湖南省科技廳資助項目(編號:2008SK3108)。

童敏(1971－)，女，研究方向:實驗動物藥理學(xué)。E－mail:tongmin22626@163.com

劉敏，博士，副教授，E－mail:liumin22626@126.com