工程菌β-胡蘿卜素累積及提取條件優(yōu)化的研究

馮亦平，李 珍，王健梅

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)，山西太谷030801；2.長治職業(yè)技術(shù)學(xué)院園藝系，山西長治046000）

類胡蘿卜素（carotenoids）是一類呈現(xiàn)黃色、橙色或紅色的植物色素，廣泛存在于各種動植物和微生物中。許多類胡蘿卜素是VA的重要來源，同時(shí)又是強(qiáng)抗氧化劑，具有一定的防癌功效[1～3]。其中，β-胡蘿卜素是類胡蘿卜素家族中的典型代表。它的分子式為C40H56，分子質(zhì)量為536.85[4]，易溶于二硫化碳（0.02 g/mL）、沸騰乙醚（0.33 g/L）、正己烷（0.07 g/L），溶于氯仿和苯，微溶于乙醇和甲醇，不溶于水，無毒[5]。β-胡蘿卜素是一種比較昂貴的天然色素[6]，是目前國際市場上頗受歡迎的產(chǎn)品，具有廣闊的市場前景。

傳統(tǒng)提取β-胡蘿卜素的方法是將新鮮胡蘿卜絞汁以后，倒入高壓均質(zhì)機(jī)中均質(zhì)，然后加入沉淀劑CaCl2·2H2O和穩(wěn)定劑氨水/乙醇，離心，棄上清液，得到橙紅色沉淀[7]；然后將沉淀冷凍干燥，得到粉末狀干燥沉淀，并在沉淀中加入有機(jī)溶劑石油醚萃取β-胡蘿卜素[8]，之后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，回收有機(jī)溶劑后得到β-胡蘿卜素油狀物。但是該法產(chǎn)量低，不易操作。噬夏孢歐文氏菌（Erwinia uredovora）是種植物病原菌，可合成番茄紅素、β-胡蘿卜素、玉米黃素、玉米黃素二糖苷等多種類胡蘿卜素，其合成途徑最早被Masaki等闡明[9]，且參與代謝的多個(gè)相關(guān)酶的編碼基因也被克隆。李麗[10]研究了無機(jī)鹽和碳氮源對噬夏孢歐文氏菌中類胡蘿卜素積累的影響，確定了該菌累積類胡蘿卜素的最佳培養(yǎng)條件；劉敏等[11]也將噬夏孢歐文氏菌的crtE，crtB，crtI及crtY基因置于T7啟動子的控制之下，構(gòu)建了2個(gè)重組質(zhì)粒，兩重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化大腸桿菌，獲得了累積β-胡蘿卜素的工程菌。

本試驗(yàn)總結(jié)了國內(nèi)外學(xué)者的試驗(yàn)方法和經(jīng)驗(yàn)，使β-胡蘿卜素于原核生物（E coli DH5α）中進(jìn)行表達(dá)，優(yōu)化β-胡蘿卜素累積及提取方法，使其表達(dá)量和提取量達(dá)到最佳，旨在解決人們對它與日俱增的需求問題。

1 材料和方法

1.1 菌種

菌株（E coli DH5α，含 pACCAR16△crtX），由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

挑取大腸桿菌工程菌單菌落，接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。取2 mL菌液加入100 mL培養(yǎng)基中，擴(kuò)大培養(yǎng)約3～4 h。然后將菌液分成若干份，保存于4℃冰箱中待用。將培養(yǎng)好的菌液分別編號并加入誘導(dǎo)劑IPTG，放入搖床進(jìn)行誘導(dǎo)，取出后3 000 r/min離心收集菌體。稱重加入4 mol/L的HCl水浴破壁，然后直接加入丙酮進(jìn)行抽提，4 000 r/min離心15 min（上清液于4℃暗處保存），沉淀用少量丙酮再抽提2次，合并3次的上清液，加入1 mL氯仿，3 000 r/min離心8 min，棄上清液，最后測定下層液體的OD值。

2 結(jié)果與分析

2.1 誘導(dǎo)時(shí)間對工程菌累積β-胡蘿卜素的影響

取培養(yǎng)好的5份菌液分別編號，并加入等量的誘導(dǎo)劑IPTG使其終濃度為0.5 mmol/L，放入搖床，分別誘導(dǎo) 1.25，2.25，3.25，4.25 h，按 1.2 提取方法進(jìn)行β-胡蘿卜素的提取，再用分光光度計(jì)對以上樣品測定其在446，475，508 nm波長下的吸光度值，同時(shí)以不加IPTG的菌液作為對照。

從表1可以看出，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長，樣品在不同波長時(shí)的吸光度值總體上呈先增加后減少的趨勢，即β-胡蘿卜素的積累量先增加后減少，誘導(dǎo)時(shí)間為1.25 h時(shí)，3種波長下所得到的OD值均為最大，其平均值分別是2.25 h的6倍和3.25 h的2倍，即在IPTG誘導(dǎo)1.25 h時(shí)，工程菌的β-胡蘿卜素積累量達(dá)最大。這是因?yàn)殡S著誘導(dǎo)時(shí)間的增加，細(xì)菌密度增大，生活活力降低，甚至死亡，致使β-胡蘿卜素不能合成進(jìn)而積累；而誘導(dǎo)2.25 h時(shí)，β-胡蘿卜素積累量最少，與對照（不加誘導(dǎo)劑IPTG）相當(dāng)，這可能是由于在試驗(yàn)過程中光照、溫度等因素使其降解所致。綜上所述，IPTG誘導(dǎo)1.25 h時(shí)，最有利于β-胡蘿卜素的積累。

表1 不同誘導(dǎo)時(shí)間下樣品在波長446，475，508 nm時(shí)的吸光度值

2.2 不同濃度誘導(dǎo)劑IPTG在相同誘導(dǎo)時(shí)間下對工程菌積累β-胡蘿卜素的影響

取培養(yǎng)好的5份菌液分別編號，并加入IPTG 使 其 終 濃 度 分 別 為 0.2，0.5，0.8，1.0，2.0 mmol/L，誘導(dǎo)1.25 h后取出，按1.2方法提取β-胡蘿卜素，并用分光光度計(jì)對以上樣品進(jìn)行吸光度值的測定。

從表2可以看出，隨著IPTG終濃度的增加，樣品在不同波長下的吸光度值呈先增加后減少的趨勢，即β-胡蘿卜素的積累量呈現(xiàn)出先增加后減少的趨勢（OD值先增加后減少）；IPTG終濃度為0.8 mmol/L時(shí)，所得氯仿抽提液的OD值達(dá)最大，也就是說，此時(shí)工程菌的β-胡蘿卜素積累量達(dá)最大。這說明低濃度IPTG誘導(dǎo)可促進(jìn)β-胡蘿卜素的大量、高效積累，而高濃度的IPTG可能對細(xì)胞具有一定的毒害作用，致使工程菌死亡，無法大量表達(dá)目的產(chǎn)物β-胡蘿卜素。因此可以得出，工程菌在0.8 mmol/LIPTG誘導(dǎo)下，最有利于β-胡蘿卜素的積累。

表2 不同誘導(dǎo)劑IPTG量的樣品在波長446，475，508 nm下的吸光度值

2.3 菌液不同OD值對工程菌積累β-胡蘿卜素的影響

由于IPTG高效啟動重組菌外源基因的表達(dá)時(shí)需要消耗能量，而菌體本身的生長也需要吸收能源物質(zhì)，二者之間存在一定的競爭作用，這就要求把握好IPTG誘導(dǎo)的時(shí)機(jī)。

表3顯示，隨著菌液OD600值的增加，樣品在不同波長下的吸光度值總體上呈先增加后減少的趨勢，即β-胡蘿卜素的積累量整體上呈現(xiàn)出先增加后減少的趨勢，當(dāng)菌液OD600值為0.6時(shí)，所得到的氯仿抽提液的OD值達(dá)最大，即此時(shí)工程菌的β-胡蘿卜素積累量達(dá)最大。這可能是由于菌液OD600值較低時(shí)，工程菌可能正處于遲緩期，此時(shí)加入IPTG，結(jié)果會導(dǎo)致菌體的生長繁殖大受影響；而菌液OD600值較高時(shí)，工程菌處于穩(wěn)定期或衰亡期，有害代謝產(chǎn)物積聚，細(xì)菌繁殖開始變慢，死亡數(shù)增加，不利于β-胡蘿卜素積累。綜上所述，OD600值為0.6的菌液最適合β-胡蘿卜素的積累。

表3 不同OD值的菌液經(jīng)實(shí)驗(yàn)后樣品在446，475，508 nm的吸光度值

2.4 鹽酸量對β-胡蘿卜素提取量的影響

把收集到的β-胡蘿卜素按1.2試驗(yàn)方法提?。ㄆ渲?，HCl和丙酮分別按 5，10，15，20 mL/g（濕菌體）加入），并用紫外分光光度計(jì)法測定其中的β-胡蘿卜素含量（表4）。

表4 鹽酸量對β-胡蘿卜素提取量的影響

由表4可知，隨著HCl量的增加，最后測得的OD值即β-胡蘿卜素的提取量也逐漸增大。當(dāng)HCl量為2.6 mL時(shí)，β-胡蘿卜素的提取量達(dá)到最大，再增大HCl量會使β-胡蘿卜素的提取量逐漸降低。因此，HCl量為2.6 mL即15 mL/g（濕菌體）時(shí)，最后測得的OD值最大，即β-胡蘿卜素提取效果最好。

2.5 HCl處理時(shí)間對β-胡蘿卜素提取量的影響

把收集的β-胡蘿卜素按1.2試驗(yàn)方法提取 （HCl處理時(shí)間為 10，20，30，40，50，60 min，HCl破壁溫度為35℃，丙酮抽提時(shí)間為1.5 h），用紫外分光光度計(jì)法測其中的β-胡蘿卜素含量。

由表5可知，隨HCl處理時(shí)間的逐漸延長，最后測得的OD值即β-胡蘿卜素提取量也逐漸增大。當(dāng)HCl處理時(shí)間為40min時(shí)，β-胡蘿卜素提取量達(dá)到最大；繼續(xù)延長破壁時(shí)間到60 min，β-胡蘿卜素提取量反而降低。因此，HCl處理時(shí)間為40 min時(shí)，β-胡蘿卜素提取效果最好。

表5 HCl處理時(shí)間對β-胡蘿卜素提取量的影響

2.6 HCl破壁溫度對β-胡蘿卜素提取量的影響

把收集的β-胡蘿卜素按1.2試驗(yàn)方法提?。℉Cl破壁溫度為 30，35，40，45，50，55 ℃，HCl處理時(shí)間為20 min，丙酮抽提時(shí)間為1.5 h），用紫外分光光度計(jì)法測其中的β-胡蘿卜素含量。

由表6可知，隨著HCl破壁溫度的逐漸升高，最后測得的OD值即β-胡蘿卜素的提取量也逐漸增大，當(dāng)HCl破壁溫度為40℃時(shí)，β-胡蘿卜素的提取量達(dá)到最大；再升高溫度可能會使β-胡蘿卜素受熱分解，從而致使提取量逐漸降低。因此，HCl處理溫度為40℃時(shí)，最后測得的OD值最大，即β-胡蘿卜素提取效果最好。

2.7 丙酮量對β-胡蘿卜素提取量的影響

把收集的β-胡蘿卜素按1.2試驗(yàn)方法提取（其中，HCl和丙酮分別按 10，20，30，40 mL/g（濕菌體）加入），用紫外分光光度計(jì)法測其中的β-胡蘿卜素含量。

由表7可知，隨著丙酮量的增加，最后測得的OD值即β-胡蘿卜素的提取量也逐漸增大，當(dāng)丙酮量為2.40 mL時(shí)，β-胡蘿卜素的提取量達(dá)到最大，再增大丙酮量則會使β-胡蘿卜素的提取量逐漸降低。因此，可以得知丙酮量為2.40mL即20 mL/g（濕菌體）時(shí)，最后測得的OD值最大， β-胡蘿卜素提取效果最好。

表6 HCl破壁溫度對β-胡蘿卜素提取量的影響

表7 丙酮量對β-胡蘿卜素提取量的影響

2.8 丙酮抽提時(shí)間對β-胡蘿卜素提取量的影響

把收集的β-胡蘿卜素按1.2試驗(yàn)方法提?。ㄆ渲?，丙酮抽提時(shí)間為 0.5，1.0，1.5，2.0 h 的時(shí)間梯度，HCl處理時(shí)間為20 min，HCl破壁溫度為35℃），并用紫外分光光度計(jì)法測其中的β-胡蘿卜素含量。

由表8可知，隨著丙酮抽提時(shí)間的逐漸延長，最后測得的OD值即β-胡蘿卜素的提取量卻逐漸較少。在丙酮抽提時(shí)間為0.5 h時(shí)，β-胡蘿卜素的提取量達(dá)到最大，而升高溫度會使β-胡蘿卜素遭受高溫破壞，從而致使提取量逐漸降低。因此，可以得知丙酮抽提時(shí)間為0.5 h時(shí)，最后測得的OD值最大，即β-胡蘿卜素的提取效果最好。

表8 丙酮抽提時(shí)間對β-胡蘿卜素提取量的影響

3 結(jié)論與討論

雖然β-胡蘿卜素在很多植物和微生物中均有分布，但由于其所含色素的成分復(fù)雜，且很多β-胡蘿卜素與天然脂肪酸會形成酯，致使提取單一組分的成本較高。隨著β-胡蘿卜素合成途徑的闡明和相關(guān)基因的相繼克隆，通過基因工程的辦法使原本不產(chǎn)生β-胡蘿卜素的生物可大量積累這類色素成為可能。

本試驗(yàn)將在大腸桿菌上表達(dá)的β-胡蘿卜素用丙酮抽提法提取出來，并使用變量法對傳統(tǒng)的提取方法作了改進(jìn)，試圖對提取條件進(jìn)行優(yōu)化。試驗(yàn)得出，用大腸桿菌作工程菌積累β-胡蘿卜素的最佳條件是：誘導(dǎo)時(shí)間1.25 h，IPTG濃度0.8 mmol/L，菌液 OD值 0.6，HCl量 15 mL/g（濕菌體），破壁時(shí)間40 min，破壁溫度40℃，丙酮量20 mL/g（濕菌體），抽提時(shí)間0.5 h。

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