灰樹(shù)花多糖脂質(zhì)體的制備方法研究

耿傳信，楊海，劉雪麗（1.山東青島市腫瘤醫(yī)院藥劑科，青島市 6604；.山東青島市中心醫(yī)院藥劑科，青島市 6604）

灰樹(shù)花多糖脂質(zhì)體的制備方法研究

耿傳信1＊，楊海2，劉雪麗2（1.山東青島市腫瘤醫(yī)院藥劑科，青島市 266042；2.山東青島市中心醫(yī)院藥劑科，青島市 266042）

目的：制備灰樹(shù)花多糖脂質(zhì)體。方法：用反向蒸發(fā)法、乙醚注入法、乙醇注入法、薄膜分散法制備灰樹(shù)花多糖脂質(zhì)體，根據(jù)包封率的高低確定制備方法；用葡聚糖凝膠層析法對(duì)灰樹(shù)花多糖脂質(zhì)體進(jìn)行分離，硫酸-苯酚比色法測(cè)定游離灰樹(shù)花多糖含量，負(fù)染色法觀察其形態(tài)。結(jié)果：反向蒸發(fā)法、乙醚注入法、乙醇注入法、薄膜分散法制備灰樹(shù)花多糖脂質(zhì)體的包封率分別為20.15%、16.32%、10.26%、7.99%，形態(tài)為圓形或橢圓形，平均粒徑為200 nm。結(jié)論：采用反向蒸發(fā)法制備的灰樹(shù)花多糖脂質(zhì)體包封率較高，是多糖類(lèi)藥物制備脂質(zhì)體較好的方法；葡聚糖凝膠層析法對(duì)灰樹(shù)花多糖脂質(zhì)體的分離效果較好。

灰樹(shù)花多糖；脂質(zhì)體；制備；反向蒸發(fā)法；葡聚糖凝膠層析法

脂質(zhì)體是近年來(lái)研究較多的一種被動(dòng)靶向制劑，由于具有靶向性、緩釋性、細(xì)胞組織相容性及延長(zhǎng)藥物作用時(shí)間等特點(diǎn)，其應(yīng)用受到重視[1，2]?；覙?shù)花多糖是灰樹(shù)花發(fā)酵菌絲體中經(jīng)熱堿提取的灰樹(shù)花倍他葡聚糖（Polysaccharides ofGrifola frondosa）[3]，臨床上擬用于惡性腫瘤和免疫缺陷癥的輔助治療。由于灰樹(shù)花多糖屬多糖類(lèi)藥物，口服吸收較差，做成脂質(zhì)體后有望提高其口服生物利用度。筆者應(yīng)用了反向蒸發(fā)法、乙醇注入法、乙醚注入法、薄膜分散法[4]等幾種方法制備灰樹(shù)花多糖脂質(zhì)體，并就灰樹(shù)花多糖脂質(zhì)體的分離進(jìn)行了研究。在含量測(cè)定時(shí)，筆者以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)，采取硫酸-苯酚法間接測(cè)定灰樹(shù)花多糖的含量。

1 儀器與材料

UV-2102 PCS型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本尤尼柯（上海）儀器有限公司）；層析柱（上海滬西分析儀器廠，1.6 cm×50 cm）；BS2000S型電子分析天平（北京賽多利斯天平有限公司）；DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市英峪予華儀器廠）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞典Buchi公司）；超細(xì)勻漿器（上海弗魯克液體制造有限公司）。

灰樹(shù)花多糖（中國(guó)海洋大學(xué)海洋藥物與食品研究所，批號(hào)：20090401）；膽固醇（天津市博迪化工有限公司：批號(hào)：20080415）；大豆卵磷脂（北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司，批號(hào)：20090220）；Sephadex G-200型葡聚糖凝膠（美國(guó)安瑪西亞公司，批號(hào)：LHS0127）；葡萄糖等試劑均為分析純。

2 方法

2.1 脂質(zhì)體的制備

2.1.1 反向蒸發(fā)法 將膽固醇與大豆卵磷脂以一定的摩爾比溶于一定量氯仿中，置于250 mL圓底燒瓶中，30℃減壓蒸發(fā)除去氯仿，使燒瓶壁上形成一層均勻的薄膜后加入乙醚溶解，加入一定量含灰樹(shù)花多糖的磷酸鹽緩沖液（PBS）（pH 7.0）形成兩相體系，水浴超聲，至形成穩(wěn)定的W/O型乳劑，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，形成膠態(tài)后加入一定量PBS，繼續(xù)旋蒸15 min，除去有機(jī)溶劑，用超細(xì)勻漿器以30 000 r·min-1處理3 min，在氮?dú)猸h(huán)境下定速磁力攪拌2 h，使脂質(zhì)體充分吸脹，得灰樹(shù)花多糖脂質(zhì)體。

2.1.2 乙醚注入法 在氮?dú)饬飨聦⑷苡心げ模懝檀?、大豆卵磷脂）的乙醚，定速磁力攪拌下用注射器緩慢注?5℃的含灰樹(shù)花多糖的PBS（pH 7.0）中，不斷攪拌至乙醚除盡，超聲30 s，即得灰樹(shù)花多糖脂質(zhì)體。

2.1.3 乙醇注入法 在55℃磁力攪拌下，用注射器緩慢將溶有膽固醇、大豆卵磷脂的乙醇注入至含灰樹(shù)花多糖的PBS（pH 7.0）中，減壓蒸發(fā)除去乙醇，超聲30 s，即得灰樹(shù)花多糖脂質(zhì)體。

2.1.4 薄膜分散法 將膽固醇與大豆卵磷脂的混合物溶于一定量乙醚中，置于250 mL圓底燒瓶中，30℃減壓蒸去乙醚，當(dāng)燒瓶壁上形成一層均勻的薄膜后，加入含有灰樹(shù)花多糖的PBS，使瓶壁薄膜洗脫，在氮?dú)猸h(huán)境下水化2 h，超聲30 s，即得灰樹(shù)花多糖脂質(zhì)體。

2.2 脂質(zhì)體的分離及包封率的測(cè)定

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 精密稱(chēng)取干燥至恒重的葡萄糖適量，用純水配制成每1 mL中含葡萄糖0.1 mg的溶液，即得標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取灰樹(shù)花多糖8 mg，用適量純水溶解，合并轉(zhuǎn)移至100 mL量瓶中，加純水定容，搖勻，即得80 mg·L-1的供試品溶液。

2.2.3 分離條件的選擇 經(jīng)多次預(yù)試驗(yàn)，筆者最終采用葡聚糖凝膠（SephadexG-200）層析法作為灰樹(shù)花多糖脂質(zhì)體的分離方法。層析條件為層析柱徑高比為1∶15，上樣量為0.2 mL，洗脫液為脫氣PBS（pH 7.0），流速為1/3 mL·min-1。分別上樣灰樹(shù)花多糖、空脂質(zhì)體及灰樹(shù)花多糖脂質(zhì)體，每3 min收集1管，共收集75 min，每隔一管用硫酸-苯酚比色法在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

2.2.4 游離灰樹(shù)花多糖的線性關(guān)系統(tǒng)考察[5]精密吸取0.1 g·L-1的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液100、150、200、250、300、350、400 μL，各以純水補(bǔ)至500 μL。以500 μL純水為空白，各加入6%苯酚溶液300 μL和濃硫酸1.5 mL，搖勻，室溫放置10 min后于沸水浴加熱20 min，冰水浴中冷卻至室溫后于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以葡萄糖的濃度（C，μg·mL-1）對(duì)吸光度（A）進(jìn)行線性回歸，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2.5 游離灰樹(shù)花多糖加樣回收率試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液250 μL，共15份，在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，并計(jì)算灰樹(shù)花多糖含量。精密吸取0.05、0.15、0.35 mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液各5份，分別加入到上述溶液中，同上法測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。

2.2.6 層析柱回收率試驗(yàn) 分別以濃度為0.8、0.6、0.4 mg·L-1的供試品溶液0.2 mL上樣至Sephadex G-200型凝膠柱，收集含灰樹(shù)花多糖的洗脫液，定容至一定體積，在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算層析柱回收率。

2.2.7 包封率的測(cè)定 將“2.1”項(xiàng)下制備的4種灰樹(shù)花多糖脂質(zhì)體，按“2.2.3”項(xiàng)下條件分離，用硫酸-苯酚法測(cè)定分離后游離灰樹(shù)花多糖的含量。根據(jù)下式計(jì)算包封率：包封率＝（W0－W1）/W0×100%。其中，W0為制劑中加入的灰樹(shù)花多糖總量；W1為游離灰樹(shù)花多糖含量。

2.3 形態(tài)學(xué)觀察

取灰樹(shù)花多糖脂質(zhì)體，PBS稀釋?zhuān)渭?%的磷鎢酸染色，銅網(wǎng)蘸取少許混合液，干燥，在透射電鏡下觀察脂質(zhì)體顆粒的形態(tài)及粒徑大小。

3 結(jié)果

3.1 脂質(zhì)體分離結(jié)果

以收集管數(shù)對(duì)其吸光度作SephadexG-200型凝膠柱流出曲線圖。結(jié)果，灰樹(shù)花多糖脂質(zhì)體和游離灰樹(shù)花多糖能夠很好的分離，其中管數(shù)為6～10之間為灰樹(shù)花多糖脂質(zhì)體吸收峰，14～19之間為游離灰樹(shù)花多糖的吸收峰。SephadexG-200凝膠柱流出曲線見(jiàn)圖1。

圖1 SephadexG-200凝膠柱流出曲線Fig 1 Elution curve of liposome on the SephadexG-200 gel column

3.2 游離灰樹(shù)花多糖的線性關(guān)系考察結(jié)果

按“2.2.4”項(xiàng)下方法，得回歸方程為A＝0.015 9C－0.002 9（r＝0.999 8）。結(jié)果表明，灰樹(shù)花多糖濃度（以葡萄糖計(jì)）在0.05～0.35 mg·mL-1之間與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

3.3 游離灰樹(shù)花多糖加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

按“2.2.5”項(xiàng)下方法測(cè)定。結(jié)果，平均回收率為101.32%，RSD＝1.25%（n＝15）。

3.4 層析柱回收率測(cè)定結(jié)果

按“2.2.6”項(xiàng)下方法測(cè)定。結(jié)果，平均回收率為92.97%，RSD＝1.08%（n＝5），表明Sephadex G-200凝膠柱對(duì)灰樹(shù)花多糖吸附性較弱，且灰樹(shù)花多糖濃度在0.50%～1.0%之間其吸附率較恒定。

3.5 包封率測(cè)定結(jié)果

按“2.2.7”項(xiàng)下方法測(cè)定包封率。結(jié)果，薄膜分散法、反向蒸發(fā)法、乙醚注入法、乙醇注入法制得的灰樹(shù)花多糖脂質(zhì)體包封率分別為7.99%、20.15%、16.32%、10.26%，表明反向蒸發(fā)法制備的灰樹(shù)花多糖脂質(zhì)體的包封率最高，薄膜分散法所得制劑的包封率最低。

3.6 形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

利用透射電鏡觀察反向蒸發(fā)法制得的灰樹(shù)花多糖脂質(zhì)體，其形態(tài)為圓形或橢圓形，粒徑400～50 nm范圍內(nèi)，平均粒徑200 nm左右?；覙?shù)花多糖脂質(zhì)體透射電鏡照片見(jiàn)圖2。

4 討論

因灰樹(shù)花多糖的分子量（Mw為180 kD，以0.02%NaN3為流動(dòng)相測(cè)定）[6]較大，且為帶有分支的葡聚糖，筆者嘗試透析法和壓濾法對(duì)灰樹(shù)花多糖脂質(zhì)體進(jìn)行分離，效果均不理想。參照文獻(xiàn)[7]選擇不同規(guī)格的層析柱及不同型號(hào)的葡聚糖凝膠對(duì)灰樹(shù)花多糖脂質(zhì)體進(jìn)行分離，最終選用Sephadex G-200凝膠柱為灰樹(shù)花多糖脂質(zhì)體的分離柱。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，上樣量與流速對(duì)灰樹(shù)花多糖脂質(zhì)體的分離影響也較大。

由于灰樹(shù)花多糖化學(xué)結(jié)構(gòu)中單糖組分僅為葡萄糖，故采用葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)溶液、硫酸-苯酚比色法對(duì)未包封的灰樹(shù)花多糖含量進(jìn)行測(cè)定。該法是將多糖在酸性條件下水解為單糖后再進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，具有較好的重現(xiàn)性。

圖2 灰樹(shù)花多糖脂質(zhì)體透射電鏡照片（反向蒸發(fā)法）Fig 2 Transmission electronicphotomicrograms of polysacchearides liposome P.frondosus（reverse-phase evaporation method）

本文采用了4種不同的脂質(zhì)體制備方法，以反向蒸發(fā)法所得的包封率較高。從試驗(yàn)結(jié)果看，反向蒸發(fā)法對(duì)水溶性多糖的包封率比其他幾種方法高，這為下一步灰樹(shù)花多糖脂質(zhì)體制備工藝優(yōu)化及該制劑生物體內(nèi)的藥理學(xué)研究提供了試驗(yàn)基礎(chǔ)和前提。

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Study on the Preparation of Polysaccharides Liposome ofGrifola frondosa

GENG Chuan-xin（Dept.of Pharmacy，Qingdao Tumor Hospital of Shandong Province，Qingdao 266024，China）
YANG Hai，LIU Xue-li（Dept.of Pharmacy，Qingdao Municipal Central Hospital，Qingdao 266042，China）

OBJECTIVE：To prepare the polysaccharides liposome ofGrifola frondosa.METHODS：The polysaccharides liposome ofG.frondosawas prepared by reverse-phase evaporation method，thin-film dispersion，ether injection and ethanol injection.Encapsulation efficiency was adopted for the confirmation of preparation method.The polysaccharides liposome ofG.frondosawas separated and purified by sephadex gel chromatography.Phenol hydrate-sulfuric acid method was used to determine the content of free polysaccharides.The morphology of the liposome was detected by negative staining.RESULTS：The encapsulation efficiencies of reverse-phase evaporation method，thin-film dispersion，ether injection and ethanol injection were 20.15%，7.99%，16.32%，10.26%，respectively.The liposome was round and oval in shape with mean particle size of 200 nm.CONCLUSION：Reverse-phase evaporation method is sound method for the preparation of polysaccharides liposome，which the polysaccharides liposome ofG.frondosaprepared by have high encapsulation efficiency.The polysaccharides liposome ofG.frondosais well separated on sephadex gel chromatography.

Polysaccharides ofGrifola frondosa；Liposome；Preparation；Reverse-phase evaporation method；Sephadex gel chromatography

R283.69；R943

A

1001-0408（2010）39-3687-03

＊副主任藥師。研究方向：臨床藥學(xué)、制劑開(kāi)發(fā)。電話：0532-84961431。E-mail：qdzx08@163.com

2010-03-12

2010-08-31）