麥芪益肺合劑對(duì)哮喘小鼠Th1/Th2平衡的影響及安全性研究

陳培麗，王申?yáng)|，畢銘陽(yáng)，胡斯，劉家應(yīng)（1.上海市兒童醫(yī)院呼吸內(nèi)科，上海市 00040；.上海市兒童醫(yī)院藥劑科，上海市 00040；.上海市兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海市 00040）

麥芪益肺合劑對(duì)哮喘小鼠Th1/Th2平衡的影響及安全性研究

陳培麗1＊，王申?yáng)|2，畢銘陽(yáng)2，胡斯2，劉家應(yīng)3（1.上海市兒童醫(yī)院呼吸內(nèi)科，上海市 200040；2.上海市兒童醫(yī)院藥劑科，上海市 200040；3.上海市兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海市 200040）

目的：通過(guò)觀察麥芪益肺合劑對(duì)系統(tǒng)性呼吸道變態(tài)反應(yīng)性模型小鼠外周血T淋巴細(xì)胞的變化，探討其對(duì)輔助性T淋巴細(xì)胞1/輔助性T淋巴細(xì)胞2（Th1/Th2）平衡的影響及安全性。方法：1%卵蛋白（OVA）刺激復(fù)制哮喘模型小鼠，隨機(jī)分為正常、哮喘模型和麥芪益肺合劑組，采用流式細(xì)胞儀測(cè)定小鼠外周血（摘除眼球取血）細(xì)胞內(nèi)白細(xì)胞介素4（IL-4）及干擾素（IFN-γ）的表達(dá)。按最大給藥量對(duì)小鼠灌胃，對(duì)照組給予等量生理鹽水，觀察小鼠癥狀及體質(zhì)量改變。結(jié)果：模型小鼠表現(xiàn)出明顯非特異性炎癥反應(yīng)征象，而麥芪益肺合劑組小鼠無(wú)明顯炎癥反應(yīng)征象。與正常組比較，哮喘模型組小鼠IL-4明顯升高（P＜0.01）；與哮喘模型組比較，麥芪益肺合劑組小鼠Th1細(xì)胞表達(dá)明顯增強(qiáng)（P＜0.01）。以最大給藥劑量灌胃，麥芪益肺合劑組與正常組小鼠癥狀及體質(zhì)量無(wú)明顯改變（P＞0.05）。結(jié)果：麥芪益肺合劑對(duì)小鼠系統(tǒng)性呼吸道變態(tài)反應(yīng)性模型在激發(fā)期有干預(yù)作用，調(diào)節(jié)Th1/Th2平恒是其藥效作用機(jī)制之一。

麥芪益肺合劑；輔助性T淋巴細(xì)胞1/輔助性T淋巴細(xì)胞2；小鼠；哮喘；安全性

支氣管哮喘是兒童呼吸道疾病中的常見(jiàn)病、多發(fā)病，已成為全球性的社會(huì)衛(wèi)生問(wèn)題，對(duì)兒童的健康構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，用于哮喘病的費(fèi)用也逐步增加，誤工、誤學(xué)、心理障礙及生活質(zhì)量降低所造成的無(wú)形損失更是無(wú)法計(jì)算。在西醫(yī)對(duì)哮喘病的治療尚無(wú)“治本”措施的今天，中醫(yī)中藥“扶正固本”的治療方法無(wú)疑是調(diào)節(jié)患兒機(jī)體免疫能力的重要手段。本研究通過(guò)觀察系統(tǒng)性呼吸道變態(tài)反應(yīng)性模型小鼠白細(xì)胞介素4（IL-4）及干擾素（IFN-γ）細(xì)胞因子的表達(dá)狀況，研究上海市兒童醫(yī)院自制“麥芪益肺合劑”對(duì)哮喘Th1/Th2細(xì)胞失衡的調(diào)節(jié)作用。

1 儀器與材料

1.1 儀器

單激光四色流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）；Turbo BOY N型霧化器（德國(guó)Pari公司）。

1.2 試藥

麥芪益肺合劑（主要成分：黃芪、麥冬、黨參、防風(fēng)、五味子、烏梅、陳皮、甘草、白術(shù)、茯苓等）由上海市兒童醫(yī)院自制（批號(hào)：05090403，含量：8.32 g（生藥）·mL-1）；1%卵蛋白（OVA，上海伯澳生物科技公司，批號(hào)：070301）；細(xì)胞因子（抗IFN-γFITC、IL-4假單孢外毒素（PE））、細(xì)胞表面標(biāo)記抗體（CD3PC5、CD8ECD）均購(gòu)自美國(guó)Beckman Coulter公司；離子霉素、莫能霉素、佛波酯（PMA）等均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.3 動(dòng)物

健康8周齡Balb/c小鼠18只，♀♂兼半，體質(zhì)量（21.02±1.46）g，由復(fù)旦大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供（動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（蘇）2002-0031）。

2 方法

2.1 系統(tǒng)性呼吸道變態(tài)反應(yīng)性哮喘鼠模型的復(fù)制

小鼠致敏方法參照Mccusker C等[1]文獻(xiàn)報(bào)道，即實(shí)驗(yàn)第0、7、14天分別ip 1%OVA抗原混懸液0.2 mL，第28天起用1%OVA超聲霧化吸入，每天20 min，連續(xù)7 d。。

2.2 分組及給藥

實(shí)驗(yàn)分為3組，即正常（等容生理鹽水）、哮喘模型（等容生理鹽水）、麥芪益肺合劑（0.8 mL）組。ig給藥，每天1次，致敏前給藥。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)方法

用流式細(xì)胞儀檢測(cè)小鼠外周血（摘除眼球取血）IL-4及IFN-γ，應(yīng)用雙管標(biāo)記檢測(cè)法，即采用CD4、CD8和IFN-γ FITC三色標(biāo)記一管，用于檢測(cè)TH1細(xì)胞，CD4、CD8和IL-4 PE三色標(biāo)記一管，用于檢測(cè)TH2細(xì)胞。具體方法：采血1 mL，肝素鋰抗凝，分A試管（標(biāo)記測(cè)定）加入5 μL PMA、10 μL離子霉素和2 μL莫能霉素，B試管（陰性對(duì)照）加2 μL莫能霉素。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育4 h。分別加入10 μL CD3PC5、CD8ECD，室溫避光孵育15 min，固定，破膜。細(xì)胞內(nèi)抗IL-4及IFN-γ單抗標(biāo)記，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，以IFN-γ FITC和IL-4 PE建立雙參數(shù)直方圖，對(duì)所確定的CD3+淋巴細(xì)胞進(jìn)行分析，得出Th1（CD3+/IFN-γ（+）和Th2（CD3+/IL-4+）的百分率。

2.4 肺組織標(biāo)本的采集

小鼠處死后，剝離肺臟，浸泡在10%甲醛溶液中固定24 h，HE染色，置光鏡下檢查。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 病理學(xué)觀察

正常組小鼠氣管、肺泡及間隔形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，未見(jiàn)充血，未見(jiàn)細(xì)胞增生；哮喘模型組小鼠小血管和細(xì)支氣管管壁增厚，細(xì)胞浸潤(rùn)，組織水腫；麥芪益肺合劑組小鼠小血管和細(xì)支氣管管壁輕度增厚，少量細(xì)胞浸潤(rùn)。病理學(xué)切片見(jiàn)圖1。

圖1 病理學(xué)切片A.哮喘模型組；B.麥芪益肺合劑組；C.正常組Fig 1 Pathological sectionA.asthma model group；B.Maiqi yifei mixture group；C.normal group

3.2 各組IFN-γ及IL-4細(xì)胞因子的變化

與正常組比較，哮喘模型組CD4 IL-4顯著增高（P＜0.01）；與哮喘模型組比較，麥芪益肺合劑組CD4 IL-4顯著降低（P＜0.01）。與正常組比較，哮喘模型組CD4 IFN-γ無(wú)顯著變化（P＞0.05）；與哮喘模型組比較，麥芪益肺合劑組CD4 IFN-γ顯著升高（P＜0.01）。各組IFN-γ及IL-4細(xì)胞因子的變化見(jiàn)表1。

表1 各組IFN-γ及IL-4細(xì)胞因子的變化Tab 1 Change of IFN-γ and IL-4 in each group

4 討論

近年的流行病學(xué)調(diào)查研究顯示，兒童哮喘的發(fā)病率呈逐年升高的趨勢(shì)，1990年全國(guó)0～14歲兒童哮喘發(fā)病率為0.19%，2000年上升至1.50%，10年前后患病率上升了64.84%[2]。2006年的資料顯示，上海6～14歲學(xué)齡期兒童哮喘的患病率已經(jīng)達(dá)到5.92%，比6年前又增加了1.77倍?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究已證實(shí)，氣道變應(yīng)性炎癥是引起哮喘病的基本病理改變和主要發(fā)病機(jī)制，涉及機(jī)體免疫功能和神經(jīng)調(diào)節(jié)功能，消除氣道的慢性炎癥及降低機(jī)體的致敏狀態(tài)應(yīng)貫穿整個(gè)治療過(guò)程中。近年來(lái)制定的全球哮喘防治創(chuàng)議（GINA）中和各國(guó)制定的哮喘病防治方案中，均規(guī)定了抗氣道炎癥是哮喘病的主要治療原則。但目前以吸入糖皮質(zhì)激素為主的局部抗炎治療并不能改善哮喘患兒的特應(yīng)性素質(zhì)，因此我國(guó)中醫(yī)中藥針對(duì)哮喘緩解期的“扶正固本”治療理念備受關(guān)注，可用中西醫(yī)的優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)提高哮喘病療效和改善哮喘病患兒的預(yù)后。

本院自制麥芪益肺合劑是在傳統(tǒng)“玉屏風(fēng)散”、“生脈飲”“四君子湯”方基礎(chǔ)上綜合而成，由黃芪、麥冬、黨參、防風(fēng)、五味子、烏梅、陳皮、甘草等10味藥組成。黃芪、黨參大補(bǔ)肺脾元?dú)?，固表?shí)衛(wèi)；麥冬養(yǎng)陰生津，氣陰二補(bǔ)；肺雖主氣，其氣卻來(lái)源于后天水谷之氣，欲補(bǔ)肺氣，當(dāng)先補(bǔ)脾，故配白術(shù)、甘草、五味子以抗組胺、抗白三烯D4、抑制肥大細(xì)胞脫顆粒；黃芪可促進(jìn)IL-2的產(chǎn)生，上調(diào)Th1細(xì)胞因子；烏梅有抗蛋白過(guò)敏作用；防風(fēng)多糖Xc-2有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能；麥冬皂苷及麥冬多糖可增加小鼠胸腺、脾臟質(zhì)量，激活小鼠網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬功能；黃芪、茯苓、甘草可誘生IFN-γ[1]。

多項(xiàng)研究顯示，哮喘患者Th1/Th2比值較正常人低，而Th2類細(xì)胞因子的表達(dá)優(yōu)勢(shì)是導(dǎo)致慢性氣道炎癥和氣道高反應(yīng)的根本原因，因此糾正Th1/Th2比值失衡有利于哮喘的治療。Mossman TR[2]根據(jù)Th細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的不同將其分為2個(gè)功能亞群，即Th1、Th2。Th1細(xì)胞有合成分泌IFN-γ及IL-2的功能，它可作用于遲發(fā)型超敏反應(yīng)和抑制過(guò)度的Th2反應(yīng)，從而降低E型免疫球蛋白應(yīng)答。Th2細(xì)胞有合成分泌IL-4的功能，而IL-4在促進(jìn)B淋巴細(xì)胞合成IgE、促發(fā)過(guò)敏反應(yīng)中起了很大作用。IL-4測(cè)定結(jié)果表明，哮喘模型組高于治療組及正常組，表明其對(duì)Th1/Th2細(xì)胞的平衡具有積極的調(diào)節(jié)作用，可對(duì)細(xì)胞內(nèi)IFN-γ表達(dá)有促進(jìn)作用，有利于哮喘癥狀的改善和長(zhǎng)期穩(wěn)定。從小鼠肺部病理改變觀察，麥芪益肺合劑對(duì)呼吸道非特異性炎癥是有療效的，通過(guò)干預(yù)，可減輕氣道高反應(yīng)。

目前中藥制劑的應(yīng)用困境之一為有效成分的定量定性。本院已成功測(cè)定該合劑主要成分之一黃芪甲苷的含量，也完成了防風(fēng)、甘草、陳皮的定性反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)不同批號(hào)麥芪益肺合劑的黃芪甲苷含量存在一定差異，提示原材料的采購(gòu)選擇應(yīng)固定產(chǎn)地。

[1]Mccusker C，Chicoine M，Hamind Q，et al.Site-specific sensitization in a murine model of allergic rhinitis：role of the upper airway in lower airways disease[J].J Allergy Clin Immunol，2002，110：891.

[2]Mossman TR，Coffman RL.Heterogeneity of cytokine secretion patterns and fuctions of helper T cells[J].Adv Immunol，1989，46：111.

Effect of Maiqi Yifei Mixture on the Balance of Th1/Th2 in Mice withAsthma and Its Safety Study

CHEN Pei-li（Dept.of Respiratory Medicine，Shanghai Children’s Hospital，Shanghai 200040，China）

WANG Shen-dong，BI Ming-yang，HU Si（Dept.of Pharmacy，Shanghai Children’s Hospital，Shanghai 200040，China）

LIU Jia-ying（Dept.of Clinical Laboratory，Shanghai Children’s Hospital，Shanghai 200040，China）

OBJECTIVE：To investigate the influence of Maiqi yifei mixture on the balance of Th1/Th2 and its safety by observing the changes of T lymphocytes in peripheral blood of mice with respiratory allergy.METHODS：The asthma mice model was induced by 1%OVA，and model mice were randomized into normal groups，asthma model group and Maiqi yifei mixture group.The expressions of IL-4 and IFN-γ in peripheral blood cells were determined by flow cytometer.Mice were given maximal dose of drugs via i.g.gtt.Control group

same quantity of normal saline.The change of symptoms and body weight of mice were observed.RESULTS：Model group showed significant non-specific inflammation reaction symptoms，while Maiqi yifei mixture group hadn’t significant inflammation reaction symptoms.The expression of Th1 in mice of Maiqi yifei mixture group was higher than in asthma model group（P＜0.01）.The IL-4 level in mice of model group was higher than in normal group（P＜0.01）.After giving maximal dosage，the symptom and body weight of mice had no significant difference（P＞0.05）.CONCLUSION：Maiqi yifei mixture can prevent respiratory allergy of mice in the stimulated period.One of its mechanisms is regulating the balance of Th1/Th2.

Maiqi yifei mixture；Th1/Th2；Mice；Asthma；Safety

R285；R97

A

1001-0408（2010）39-3669-03

2010-07-17

2010-07-26）