菟絲子提取物對自然衰老小鼠的抗衰老作用研究

蘭 鴻，杜士明（鄖陽醫(yī)學(xué)院附屬太和醫(yī)院，十堰市 442000）

菟絲子提取物對自然衰老小鼠的抗衰老作用研究

蘭 鴻＊，杜士明（鄖陽醫(yī)學(xué)院附屬太和醫(yī)院，十堰市 442000）

目的：研究菟絲子提取物對自然衰老小鼠的抗衰老作用。方法：給自然衰老小鼠灌胃菟絲子提取物，先用Y-型電迷宮檢測小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，后應(yīng)用生化方法檢測老年小鼠腦組織內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）的活力和丙二醛（MDA）含量。結(jié)果：小鼠行為實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，菟絲子提取物能使小鼠Y-型電迷宮測試正確次數(shù)顯著降低，但對記憶的保持力影響不大。小鼠腦組織抗氧化酶的活力實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，菟絲子提取物能提高小鼠腦組織SOD、GSH-PX活力，降低MDA的含量。結(jié)論：菟絲子提取物抗衰老作用可能通過提高腦組織抗氧化酶SOD、GSH-PX活力，降低脂質(zhì)過氧化物MDA含量而實(shí)現(xiàn)。

菟絲子提取物；抗衰老作用；機(jī)制

菟絲子為旋花科植物菟絲子Cuscuta chinensisLam.的干燥成熟種子，具有滋補(bǔ)肝腎、固精縮尿、安胎、明目、止瀉的功效。王昭等[1]發(fā)現(xiàn)菟絲子能明顯增強(qiáng)衰老模型小鼠的紅細(xì)胞免疫功能，具有延緩衰老作用。筆者給自然衰老小鼠灌胃菟絲子提取物，先用Y-型電迷宮檢測小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，后應(yīng)用生化方法檢測老年小鼠腦組織內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）的活力和丙二醛（MDA）含量，以進(jìn)一步探討菟絲子抗衰老的機(jī)制。

1 儀器與材料

1.1 儀器

手術(shù)器械（大連醫(yī)療器械有限公司）；UP200H型超聲破碎儀、V-560型紫外分光光度儀（日本Jasco公司）；Y-型電迷宮（中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院植物生理生態(tài)研究所）；TGL16G型臺式高速離心機(jī)（上海醫(yī)用分析儀器廠）；組織研磨器（北京惠澤奧科貿(mào)有限公司）。

1.2 試藥

組織蛋白、SOD、GSH-PX、MDA檢測試劑盒（南京建成生物工程公司）；菟絲子、人參購自十堰市醫(yī)藥公司，均由鄖陽醫(yī)學(xué)院陳吉炎教授鑒定為真品；維生素E（海南養(yǎng)生堂保健品有限公司，批號：2009012311）。

1.3 動物

昆明種SPF級老年小鼠，♀♂兼半，體質(zhì)量（40.5±3）g，由鄖陽醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供（動物生產(chǎn)合格證號：2008A005）。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)用藥的制備

2.1.1 菟絲子提取物的制備：菟絲子藥材500 g，加4 000 mL水浸泡2 h，至微脹，文火煎2次，每次煎煮0.5 h，過濾。合并2次提取液，濃縮至生藥濃度為0.4 g·mL-1，置4℃冰箱貯藏，備用。

2.1.2 人參提取物的制備：取藥材500 g，加4 000 mL水浸泡2 h，至微脹，文火煎2次，每次煎煮1 h，過濾。合并2次提取液，濃縮至生藥濃度為0.4 g·mL-1，置4℃冰箱貯藏，備用。

2.1.3 維生素E混懸液的制備：取維生素E膠囊400 mg，以吐溫-80乳化配制成濃度為1.25 mg·mL-1的混懸液，備用。

2.2 分組及給藥

實(shí)驗(yàn)分為6組，即模型（等容生理鹽水）、人參提取物（4 000 mg·kg-1）、維生素 E（12.5 mg·kg-1）和菟絲子高、中、低劑量（300、200、100 mg·kg-1）組。ig給藥，每天1次，連續(xù)30 d。

2.3 Y-型電迷宮行為實(shí)驗(yàn)

2.3.1 動物篩選：將小白鼠放入Y-型電迷宮箱中適應(yīng)3～5 min后，給予適當(dāng)電擊，至小白鼠有3足均探索進(jìn)入電迷宮箱為止，選擇活躍、對電擊反應(yīng)較敏感、逃避反應(yīng)迅速者供測試用。淘汰反應(yīng)過于遲鈍或特別敏感的小鼠。預(yù)選出達(dá)到連續(xù)2次且≤3次對電擊正確反應(yīng)，對電擊反應(yīng)較敏感的小白鼠供實(shí)驗(yàn)用[2，3]。在上述初步篩選的基礎(chǔ)上，通過正式迷宮訓(xùn)練，淘汰達(dá)不到學(xué)會標(biāo)準(zhǔn)（學(xué)不會）的小鼠[4]。

2.3.2 學(xué)習(xí)測試（隨機(jī)休息法[5]）：安全區(qū)以無規(guī)則次序變換，以訓(xùn)練小鼠辨別燈光刺激及安全方位的能力。小鼠受電擊后逃到安全區(qū)后，燈光繼續(xù)作用10～15 s，熄燈后結(jié)束1次測試，小鼠所在肢臂就作為下一次測試的起點(diǎn)，2次測試時間間隔為30 s或休息1 min后再予以第2次測試，依次重復(fù)，測試至達(dá)連續(xù)9/10標(biāo)準(zhǔn)。

2.3.3 記憶保持（再現(xiàn)）測試：學(xué)習(xí)測試1周后，再以同樣方法測試，正確反應(yīng)次數(shù)定為A，以A/10表示記憶保持的能力，此值越高說明記憶力越好[3]。

2.3.4 測試指標(biāo)和相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)：（1）達(dá)標(biāo)所需的訓(xùn)練次數(shù)（電擊次數(shù)、反應(yīng)次數(shù)、測試次數(shù)）：用動物學(xué)習(xí)達(dá)到學(xué)會標(biāo)準(zhǔn)前所需的測試數(shù)，表示其空間分辯反應(yīng)的學(xué)習(xí)記憶成績。所需次數(shù)越少，說明學(xué)習(xí)速度越快或?qū)W習(xí)能力越強(qiáng)；所需次數(shù)增多，提示學(xué)習(xí)記憶能力下降。（2）正誤判定的標(biāo)準(zhǔn)：以小鼠在足底通電后10 s內(nèi)一次性跑向安全區(qū)為正確反應(yīng)，否則為錯誤反應(yīng)[5]。（3）達(dá)標(biāo)（學(xué)會）標(biāo)準(zhǔn)：以連續(xù)10次中有9次或以上正確反應(yīng)（正確反應(yīng)率90%）定為學(xué)會標(biāo)準(zhǔn)。

2.4 腦組織處理及指標(biāo)測定

行為實(shí)驗(yàn)結(jié)束24 h后，應(yīng)用乙醚將動物深度麻醉，用100 mL冰冷的生理鹽水經(jīng)心臟做顱內(nèi)灌注，在冰袋上小心快速剝離腦組織，并放入0.9%冰冷生理鹽水中洗凈表面血液。稱重后，應(yīng)用冰冷的生理鹽水制備成10%組織勻漿，貯藏于－70℃冰箱內(nèi)以備生化分析。檢測當(dāng)日，組織勻漿低速、低溫離心（4 000 r·min-1，4℃）10 min，取上清測定組織蛋白、SOD、GSH-PX活力及MDA含量。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 菟絲子對模型小鼠行為學(xué)的影響

菟絲子中劑量組小鼠Y-型電迷宮測試學(xué)會次數(shù)顯著低于模型組（P＜0.05），但對記憶的保持力影響不大。菟絲子提取物對小鼠被動躲避學(xué)習(xí)記憶的影響見表1。

表1 菟絲子提取物對小鼠被動躲避學(xué)習(xí)記憶的影響Tab 1 Effect of the extracts of C.chinensis on the memory retention

3.2 菟絲子對模型小鼠腦組織SOD、GSH-PX活力及MDA含量的影響

模型組小鼠腦組織SOD、GSH-PX活力及MDA含量分別為（127.82±24.83）、（104.87±20.58）IU·mg-1，（19.02±0.62）nmol·mg-1；菟絲子中劑量組小鼠GSH-PX活力提高至（209.12±24.17）IU·mg-1，SOD活力提高至（199.25±23.73）IU·mg-1，同時MDA含量降低至（10.15±1.73）IU·mg-1。菟絲子提取物對模型小鼠腦組織SOD、GSH-PX活力及MDA含量的影響見圖1。

圖1 菟絲子提取物對模型小鼠腦組織SOD、GSH-PX活力及MDA含量的影響A.SOD；B.GSH-PX；C.MDA；1.模型組；2.菟絲子低劑量組；3.菟絲子中劑量組；4.菟絲子高劑量組；5.人參提取物組；6.維生素E組Fig 1 Effects of the extracts of C.chinensis on the activity of SOD and GSH-PX and the content of MDAA.SOD；B.GSH-PX；C.MDA；1.model group；2.C.chinesis low dose group；3.C.chinesis media dose group；4.C.chinesis high dose group；5.extracs of Panax ginseng group；6.VE group

4 討論

衰老是由許多因素綜合作用引起的復(fù)雜的過程，老年動物學(xué)習(xí)記憶能力明顯不如青年動物[6]。在眾多有關(guān)衰老發(fā)生發(fā)展的學(xué)說中，“自由基學(xué)說”是目前贊同者較多的一種理論，氧化應(yīng)激和活性氧自由基被認(rèn)為是引起衰老和導(dǎo)致一些神經(jīng)退行性疾病如阿爾茨海默?。ˋD）、帕金森疾?。≒D）的主要原因[7]?；钚匝踝杂苫求w內(nèi)代謝的產(chǎn)物，機(jī)體可通過自身的酶系統(tǒng)或非酶系統(tǒng)，將體內(nèi)不斷生成的自由基清除，以維持一種動態(tài)平衡。過多自由基的生成可直接破壞生物大分子如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸等，導(dǎo)致細(xì)胞壞死；也可間接影響細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因調(diào)控，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。由于腦組織富含大量不飽和脂肪酸及自身抗氧化能力較低，使其更易受到自由基的攻擊，產(chǎn)生損傷，因此清除過多的自由基對于腦組織的保護(hù)意義尤為重大。

本研究選用自然衰老的小鼠作為衰老動物模型，神經(jīng)系統(tǒng)損害屬自然發(fā)生。目前普遍認(rèn)為該衰老模型在神經(jīng)生理、結(jié)構(gòu)、行為上更接近人，是適于研究的對象。此模型多用于中藥治療AD的篩選和療效評價以及研究AD的病理生理學(xué)特征等方面。

氧化應(yīng)激是許多神經(jīng)退行性疾?。ㄈ鏏D、PD等）的致病因素之一。當(dāng)氧化產(chǎn)物超過內(nèi)源性抗氧化物時，就會導(dǎo)致細(xì)胞組織發(fā)生氧化損傷。SOD、GSH-PX是體內(nèi)清除自由基最為重要的酶系，MDA含量的高低能間接反映機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度，近年來被廣泛用作氧化應(yīng)激程度的標(biāo)示物。老年小鼠的學(xué)習(xí)、記憶功能明顯下降，其腦組織中內(nèi)源性抗氧化酶SOD和GSH-PX活性顯著下降，體內(nèi)自由基清除減少，產(chǎn)生增多，造成自由基聚集，進(jìn)而導(dǎo)致腦損傷，使MDA含量增高。筆者對小鼠腦組織內(nèi)抗氧化物的研究結(jié)果表明，菟絲子可以顯著提高腦組織內(nèi)SOD、GSH-PX活力，同時降低脂質(zhì)過氧化水平，說明其對小鼠學(xué)習(xí)能力的提高是通過改善腦組織中內(nèi)源性抗氧化體系活力、提高自身的抗氧化能力而實(shí)現(xiàn)的。

筆者在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步在老年小鼠體內(nèi)，通過動物行為變化指標(biāo)、腦組織內(nèi)氧化酶活性及脂質(zhì)過氧化程度的觀測，確定菟絲子在生物體內(nèi)的作用，可為菟絲子基礎(chǔ)研究和藥物開發(fā)提供依據(jù)。

[1]王 昭，樸金花，張鳳梅，等.菟絲子對D2半乳糖所致衰老模型小鼠紅細(xì)胞免疫功能的影響[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2003，26（6）：16.

[2]周佳麗，徐曉玉.中藥防治腦缺血再灌注損傷的研究進(jìn)展[J].中國藥房，2007，18（18）：1 419.

[3]李勝休，舒斯云，包新民，等.海仁藻酸損傷邊緣區(qū)后對大鼠學(xué)習(xí)和記憶功能影響的研究[J].神經(jīng)解剖學(xué)雜志，1996，12（3）：37.

[4]裴 媛，林庶茹，李德新.腦老化的中醫(yī)藥實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展[J].中國老年學(xué)雜志，2005，6：740.

[5]Andersen MB，Sams DF.Transient cerebral ischemia inhibits juvenile recognition in the mongolian gerbil[J].Pharmacol Biochem Behav，1997，56：19.

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[7]Sugawara T，Chan PH.Reactive oxygen radicals and pathogenesis of neuronal death after cerebral ischemia[J].Antioxid Redox Signal，2003，5：597.

Study on theAnti-agingAction of the Extracts ofCuscuta chinensisin NaturalAging Mice

LAN Hong，DU Shi-ming（Taihe Hospital of Yunyang Medical College，Shiyan 442000，China）

OBJECTIVE：To observe the Anti-aging activity of the extracts ofCuscuta chinensisin natural aging mice.METHODS：Natural aging mice were given the extracts ofC.chinensisvia i.g.gtt.Y-type electric maze was used to determine their abilities of learning and memory，then biochemical method was adopted to detect the activity of superoxide dismutase（SOD）and glutathione peroxidase（GSH-PX），and the content of malondialdehyde（MDA）in cerebral tissues of aging mice.RESULTS：The test behavior of mice expressed thatC.chinensiscould significantly lower the correct percentage in Y-type electric maze test，but had little effect on the memory retention.The antioxidase activity experiment of cerebral tissues of mice expressed thatC.chinensiscould improve the activity of SOD and GSH-PX in mice cerebral tissue，and lower the contents of MDA.CONCLUSION：The anti-aging activity of the extracts ofC.chinensisis achieved by improving the activity of SOD and GSH-PX，and lowering the contents of MDA.

Extracts ofCuscuta chinensis；Anti-aging activity；Mechanism

R285；R976

A

1001-0408（2010）39-3667-03

＊主管藥師。研究方向：醫(yī)院藥學(xué)。E-mail：Lh76117611@163.com

2009-11-25

2010-03-29）