應(yīng)用噬菌體展示技術(shù)篩選 H MGB1啟動(dòng)子結(jié)合蛋白＊

丁 寧, 肖 慧, 高 巨, 許立新△, 佘守章

(廣州市第一人民醫(yī)院1麻醉科和麻醉學(xué)實(shí)驗(yàn)室,2門診部,廣東廣州 510180;3廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院麻醉科,廣東廣州 510120)

應(yīng)用噬菌體展示技術(shù)篩選 H MGB1啟動(dòng)子結(jié)合蛋白＊

丁 寧1, 肖 慧2, 高 巨3, 許立新1△, 佘守章1

(廣州市第一人民醫(yī)院1麻醉科和麻醉學(xué)實(shí)驗(yàn)室,2門診部,廣東廣州 510180;3廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院麻醉科,廣東廣州 510120)

目的:篩選高遷移率族蛋白 B1(HMGB1)啟動(dòng)子結(jié)合蛋白。方法:應(yīng)用噬菌體展示技術(shù),以HMGB1啟動(dòng)子 DNA作為固相篩選分子,對(duì)噬菌體展示環(huán)七肽庫進(jìn)行 4輪“吸附 -洗脫 -擴(kuò)增”生物篩選,從第 4輪洗脫物中隨機(jī)挑選 20個(gè)單克隆噬菌體擴(kuò)增后進(jìn)行 EL ISA鑒定。對(duì)所篩選克隆進(jìn)行 DNA序列測(cè)定和生物信息學(xué)分析。結(jié)果:經(jīng)過 4輪篩選后,對(duì)隨機(jī)選取的 20個(gè)噬菌體克隆進(jìn)行鑒定,其中 11個(gè)可與 HMGB1啟動(dòng)子結(jié)合。DNA測(cè)序后經(jīng)過同源性搜索,確定了與 HMGB1啟動(dòng)子具有結(jié)合作用的蛋白,包括激活蛋白 -1(activator protein-1,AP-1)等 6種已知功能蛋白和 2種未知功能蛋白。結(jié)論:篩選到 HMGB1啟動(dòng)子的結(jié)合蛋白,為研究 HMGB1基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

高遷移率族蛋白 1;啟動(dòng)子;噬菌體展示;肽庫;基因表達(dá)調(diào)控

高遷移率族蛋白B1(high mobility group box protein 1,HMGB1)因在凝膠電泳中遷移速度快而得名,HMGB1是細(xì)胞內(nèi) DNA結(jié)合蛋白,參與 DNA復(fù)制、細(xì)胞分化及基因表達(dá)調(diào)控等多種細(xì)胞核生命活動(dòng)[1]。近年研究發(fā)現(xiàn),分泌至細(xì)胞外的 HMGB1作為關(guān)鍵性“晚期”炎癥介質(zhì)在膿毒癥和急性肺損傷等炎性疾病的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用[2,3],但是關(guān)于HMGB1基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制尚未闡明。本研究應(yīng)用噬菌體展示技術(shù)篩選與 HMGB1啟動(dòng)子相互作用的蛋白,在轉(zhuǎn)錄水平探索 HMGB1基因表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 材料

噬菌體展示隨機(jī)環(huán)七肽庫(Ph.D.-C7C,庫容 2×1016pfu/L)、宿主菌 E.coliER2738及 DNA全自動(dòng)測(cè)序引物 -96 gIII 5'-OH CCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3'(New England Biolabs),辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記的抗 M13單克隆抗體 (HRP/anti-M13,Amersham Phar macia),牛血清白蛋白 (bovine serum albumin,BSA)、吐溫 20(Tween 20)、聚乙二醇 (polythylene glycol,PEG)8000、異丙基 -β-D-硫代半乳糖苷 (isopropylβ-D-thiogalactoside,IPTG)和 5-溴 -4-氯 -3-吲哚-β-D-半乳糖苷 (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside,X-gal)(Sigma),Taq酶、dNTP、T4 DNA連接酶、RNA酶 (大連寶生物公司),DNA玻璃奶快速純化回收試劑盒 (南京凱基公司)。聚合酶鏈反應(yīng) (polymerasechain reaction,PCR)引物由上海生工生物工程公司合成。

2 方法

2.1 HMGB1啟動(dòng)子的擴(kuò)增 根據(jù) GenBank的HMGB1啟動(dòng)子基因序列 (GenBank登錄號(hào):AF255609),分別設(shè)計(jì)合成 2對(duì)寡核苷酸引物,正義鏈引物 P1 5'-CAG ATT TAT ATG CAC TGA GAG CG-3',反義鏈引物 P2 5'-ATC CCT TCC GGG GGA ACT C-3',其中反義鏈引物 5'-端行生物素化。EP管中依次加入 17.3μL雙蒸水、2.5μL 10×緩沖液(含 20 mmol/L MgCl2)、2μL dNTP(2.5 mmol/L)、1 μL P1和 P2(10μmol/L)、1μL基因組 DNA、0.5μL Taq酶 (5×106U/L)。PCR反應(yīng)條件為 94℃2 min、60℃30 s、72℃ 1 min,共 35次循環(huán),最后 72 ℃延伸 10 min。瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴(kuò)增結(jié)果,所有PCR產(chǎn)物均用玻璃奶法進(jìn)行回收。

2.2 生物篩選 按照我們建立的方法進(jìn)行篩選[4]:鏈親和素 100μL(0.1 g/L)包被 96孔板,4℃過夜。Tris緩沖液 (tris buffered saline,TBS)洗板 3次,加入HMGB1啟動(dòng)子回收片段 80μL,4℃孵育過夜。TBS洗板 3次,用含 1%BSA的 TBS(TBSB)4℃封閉,加肽庫 10μL(2.0×1011pfu)室溫溫和振蕩 1 h,TBST洗板 6次,加入 0.2 mol/L甘氨酸 -鹽酸緩沖液 (pH 2.2)100μL,室溫溫和振蕩 10 min,立即加入 1 mol/L Tris-HCl(pH 9.1)中和洗脫液 15μL,即得到第 1循環(huán)淘洗物。淘洗物與對(duì)數(shù)期 E.coliER2738培養(yǎng)物及 Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基混勻,取 20μL測(cè)滴度,其余于錐形瓶中劇烈振搖 5 h,PEG/NaCl 2次沉淀法制備噬菌體擴(kuò)增液。重復(fù)以上步驟進(jìn)行 4輪篩選。各輪篩選得到的稀釋液和擴(kuò)增液均用LB/IPTG/X-gal平皿培養(yǎng)測(cè)定噬菌體滴度。篩選結(jié)束后,挑取分隔良好的藍(lán)色噬菌斑 20個(gè),分別擴(kuò)增培養(yǎng),離心后上清即為噬菌體克隆貯存液。

2.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) (EL ISA)鑒定陽性噬菌體克隆 按照上述方法先后用鏈親和素和 HMGB1啟動(dòng)子片段包被酶標(biāo)板 20孔,以 TBS包被作為空白對(duì)照,4℃孵育過夜。經(jīng) TBSB封閉后,每孔分別加入50μL不同的噬菌體克隆,室溫孵育 2 h,TBST洗板后加入 HRP/anti-M13(1∶5 000稀釋),室溫振蕩孵育 1 h,TBST洗板后立即加入 tetrabenzidine(T MB)顯色,2 mol/L硫酸中止反應(yīng),于 450 nm讀取吸光度值(A450),以 A450值高于陰性對(duì)照 3倍以上作為陽性噬菌體克隆。

2.4 DNA測(cè)序及同源性搜索 擴(kuò)增的陽性噬菌體克隆以 PEG/NaCl純化后,再以碘化鈉溶解抽提單鏈DNA,進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定。紫外分光光度法定量后,采用雙脫氧末端終止法測(cè)序并推導(dǎo)外源七肽的氨基酸序列。序列同源性搜索由 NCB I網(wǎng)站的BLAST軟件完成 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 HM GB1啟動(dòng)子片段的 PCR擴(kuò)增

利用 HMGB1啟動(dòng)子序列的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,獲得了長(zhǎng)度約為 1 700 bp的 HMGB1啟動(dòng)子片段,見圖 1。

Fig 1 Amplification of HMGB1 promoter DNA by PCR.M:DNA ladder;Lane 1-3:HMGB1 promoter.圖 1 HM GB1啟動(dòng)子片段的 PCR擴(kuò)增

2 噬菌體隨機(jī)環(huán)七肽庫的篩選

以固相化的 HMGB1啟動(dòng)子片段作為靶分子,對(duì)噬菌體肽庫進(jìn)行 4輪篩選。結(jié)果顯示,隨著篩選輪次的增加,從固相平板洗脫的噬菌體數(shù)呈明顯的增加趨勢(shì),回收率 (回收 /投入噬菌體量)逐輪升高并趨于穩(wěn)定,說明每輪篩選后與 HMGB1啟動(dòng)子結(jié)合的噬菌體得到有效富集并最終接近飽和狀態(tài)。第 4輪篩選后與第 1輪相比,富集了 581倍 (富集倍數(shù) =第 4輪回收率 /第 1輪回收率),見表 1。

表 1 不同篩選輪次噬菌體的回收率Tab 1 Recovery rate of phage clones during different rounds ofbiopanning

3 陽性噬菌體克隆的鑒定

第 4輪洗脫下來的噬菌體鋪 LB/IPTG/X-gal平板,隨機(jī)挑取 20個(gè)分隔良好的藍(lán)色噬菌斑,進(jìn)行EL ISA鑒定,以高出陰性對(duì)照 3倍的噬菌體克隆作為陽性克隆,結(jié)果顯示,其中 11個(gè)噬菌體克隆可與HMGB1啟動(dòng)子高親和力結(jié)合,見圖 2。

Fig 2 Binding affinity of different phage clones with HMGB1 promoter.1-20 represent 20 phage clones acquired by biopanning with HMGB1 promoter.＊indicates positive phage clones.圖 2 噬菌體克隆與 HM GB1啟動(dòng)子的親和力

4 陽性噬菌體克隆的序列測(cè)定及同源性分析

選取與 HMGB1啟動(dòng)子高親和力結(jié)合的 11個(gè)陽性噬菌體克隆,提取單鏈DNA,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定純度及大小、紫外分光光度法定量分析后,用 -96 gIII測(cè)序引物進(jìn)行序列測(cè)定,根據(jù)核苷酸序列推導(dǎo)出外源七肽序列,經(jīng) BLAST程序與 SwissProt數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性比對(duì),見表 2。

表 2 篩選的陽性克隆與 SwissProt同源序列比對(duì)Tab 2 Homologous amino acid sequences from SwissProt of positive clones

討 論

在細(xì)胞核內(nèi),HMGB1具有穩(wěn)定核小體、協(xié)助基因轉(zhuǎn)錄的作用,而分泌到細(xì)胞外的 HMGB1則可與白細(xì)胞介素 -1β(interleukin-1β, IL-1β)、 IL-6、腫瘤壞死因子 -α(tumor necrosis factor,TNF-α)等炎癥因子相互誘生,作為一種“晚期”炎癥介質(zhì)參與膿毒癥的發(fā)病過程[5,6]。

HMGB1在大多數(shù)細(xì)胞和組織中都控制在一個(gè)基礎(chǔ)的表達(dá)水平,但其并非組成性表達(dá),而是被嚴(yán)格調(diào)控的[7]。然而,HMGB1基因的表達(dá)調(diào)控尚有很多不清楚的環(huán)節(jié)。真核細(xì)胞基因調(diào)節(jié)的主要機(jī)制是轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié),其分子基礎(chǔ)是啟動(dòng)子 DNA與轉(zhuǎn)錄因子之間的相互作用,研究基因啟動(dòng)子的結(jié)合蛋白,對(duì)于研究基因調(diào)節(jié)的分子生物學(xué)機(jī)制非常重要。噬菌體展示技術(shù)是一種基因表達(dá)產(chǎn)物和親和篩選相結(jié)合的技術(shù),可以在短時(shí)間內(nèi)篩選出與靶分子高親和力結(jié)合的噬菌體展示肽[8,9],方法簡(jiǎn)便、流通量大,已成為尋找和開發(fā)新的特異性結(jié)合肽的強(qiáng)有力工具,我們?cè)檬删w展示技術(shù)對(duì)蛋白和活細(xì)胞進(jìn)行了篩選,并對(duì)篩選過程進(jìn)行了改進(jìn)和優(yōu)化[10]。

本研究在成功擴(kuò)增了 HMGB1啟動(dòng)子 DNA片段的基礎(chǔ)上,以之為固相靶分子,對(duì) Ph.D.-C7C隨機(jī)環(huán)七肽庫進(jìn)行親和篩選。經(jīng)過 BLAST同源性搜索,獲得 4種位于真核細(xì)胞核中的蛋白,包括 CCAAT轉(zhuǎn)錄因子 (CCAAT transcription factor,CTF)、激活蛋白-1(activator protein-1,AP-1)、E2F-4轉(zhuǎn)錄因子和鋅指蛋白等。啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)分析顯示 HMGB1啟動(dòng)子上游 -861～-869 bp為 AP-1的結(jié)合位點(diǎn),AP-1是一類主要由 Jun和 Fos蛋白因子家族組成的轉(zhuǎn)錄因子,能與許多基因上 AP-1位點(diǎn)結(jié)合,參與眾多生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控,從而導(dǎo)致機(jī)體一系列生理和病理生理變化[11]。既往研究表明,TGA(C/G)TCA序列是 AP-1的 DNA結(jié)合基序,與本研究得到的七肽序列有很好的一致性,證實(shí)了利用噬菌體展示技術(shù)篩選啟動(dòng)子結(jié)合蛋白的可行性,為研究啟動(dòng)子 DNA結(jié)合蛋白開辟了新的研究策略和技術(shù)途徑。

一般來說,與啟動(dòng)子 DNA結(jié)合的蛋白都位于真核細(xì)胞核中。但是,本研究還篩選得到 2個(gè)位于細(xì)胞漿中的蛋白以及 2個(gè)非真核細(xì)胞蛋白。分析其原因,基序序列特征可能不一定是連續(xù)的氨基酸序列,而通過噬菌體展示技術(shù)篩選并經(jīng)過測(cè)序得到的氨基酸序列為連續(xù)序列,此時(shí)可能無法找到同源序列或與找到的同源序列有差異。因此,篩選結(jié)果還需要利用其它一些研究技術(shù),例如電泳遷移率試驗(yàn)、報(bào)告基因表達(dá)載體構(gòu)建和細(xì)胞共轉(zhuǎn)染等,進(jìn)一步證實(shí)基因啟動(dòng)子DNA與蛋白的結(jié)合以及對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控作用?？傊?本研究利用噬菌體展示技術(shù)成功篩選到一些與 HMGB1啟動(dòng)子結(jié)合的蛋白質(zhì),這些蛋白與 HMGB1基因啟動(dòng)子結(jié)合后,會(huì)調(diào)控 HMGB1基因的表達(dá),進(jìn)而對(duì) HMGB1的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)產(chǎn)生影響,為進(jìn)一步探索 HMGB1的轉(zhuǎn)錄機(jī)制提供新線索。

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Screen ing of binding proteins of HM GB1 promoter by phage display techn ique

D INGNing1,X IAO Hui2,GAO Ju3,XU Li-xin1,SHE Shou-zhang1
(1Department of Anesthesiology and Anesthesiology Laboratory,2Department of Out-patient,Guangzhou First M unicipal People's Hospital,Guangzhou510180,China;3Depar tm ent of Anesthesiology,The Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of Traditional ChineseM edicine,Guangzhou510120,China.E-m ail:gzxulixin@163.com)

A IM:To screen the binding proteins to HMGB1 promoter by phage display technique.M ETHODS:HMGB1 promoter was incubated with phage display library.Unbound phages were eluted and phages bound to HMGB1 promoterwere amplified.Twenty individual cloneswere randomly selected and identified by enzyme-linked immunosorbent assay(EL ISA).Positive cloneswere characterized byDNA sequencing and the sequenceswere subjected for computer analysis.RESULTS:Positive phages binding to HMGB1 promoter were enriched after 4 rounds of biopanning.Twenty phage cloneswere selected and eleven clones ofwhichwere identified to bind specifically to HMGB1 promoter.The sequences in full length were obtained and searched for homologous sequences from GenBank.Altogether eight coding sequenceswere obtained,six ofwhich were known proteins including activator protein-1(AP-1)and two of which were uncharacterized ones.CONCLUSI ON:Several proteinswere obtained that bind specifically with HMGB1 promoter.The resultswill be useful for further studying the expression and regulation mechanis m of HMGB1.

High mobility group box protein 1;Promoter;Phage display;Peptide library;Gene expression regulation

R378;R392.1

A

1000-4718(2010)01-0028-04

2009-03-24

2009-05-20

廣州市醫(yī)藥衛(wèi)生科技資助項(xiàng)目 (No.2008-YB-012;No.2009-YB-021);廣州市醫(yī)藥衛(wèi)生科技重點(diǎn)資助項(xiàng)目

(No.2008-ZDi-14);廣東省科技計(jì)劃資助項(xiàng)目 (No.2007B31509007);廣東省醫(yī)學(xué)科研基金資助項(xiàng)目 (No.A2009497)

△通訊作者 Tel:020-81048310;E-mail:gzxulixin@163.com