構(gòu)建啟動(dòng)大鼠肝組織中TGF－β/Smad信號(hào)傳導(dǎo)通路的急性肝損傷動(dòng)物模型

張 濤，黃順玲，孫克偉，譚德明，孟 瓊，陳 晨

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院感染病科，長(zhǎng)沙 410007;2.湖南省衛(wèi)生廳，長(zhǎng)沙 410005; 3.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院感染病科，長(zhǎng)沙 410005;4.湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，長(zhǎng)沙 410007)

研究報(bào)告

構(gòu)建啟動(dòng)大鼠肝組織中TGF－β/Smad信號(hào)傳導(dǎo)通路的急性肝損傷動(dòng)物模型

張 濤1，黃順玲2，孫克偉1，譚德明3，孟 瓊4，陳 晨1

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院感染病科，長(zhǎng)沙 410007;2.湖南省衛(wèi)生廳，長(zhǎng)沙 410005; 3.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院感染病科，長(zhǎng)沙 410005;4.湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，長(zhǎng)沙 410007)

目的在傳統(tǒng)CCl4急性肝損傷模型的基礎(chǔ)上，構(gòu)建啟動(dòng)大鼠肝組織中的TGF－β/Smad信號(hào)傳導(dǎo)通路的急性肝損傷動(dòng)物模型。方法將30只大鼠隨機(jī)分為3組，每組各10只，分別為模型組，對(duì)照組和空白組，模型組大鼠予小動(dòng)脈夾夾閉肝總動(dòng)脈15 min手術(shù)處理，隨后分別在第6天和第10天，予25%CCl4花生油溶液6 mL/kg體重腹腔注射;對(duì)照組則單用兩次CCl4，空白組不做任何處理;第二次CCl448 h后處死所有動(dòng)物。結(jié)果模型組與對(duì)照組及空白組比較:血清指標(biāo)ALT、AST、HA顯著上升(P＜0.01);肝組織HE染色病理觀測(cè)，肝組織出現(xiàn)明顯炎癥、變性、壞死，纖維組織增生等現(xiàn)象;PT－PCR檢測(cè)Ⅰ、Ⅲ型膠原、TGF－β1、Smad3 mRNA表達(dá)顯著增強(qiáng)(P＜0.01);免疫組化檢測(cè)Ⅰ、Ⅲ型膠原、TGF－β1、Smad3蛋白的表達(dá)增強(qiáng)(P＜0.01)。結(jié)論成功啟動(dòng)急性肝損傷大鼠肝組織中的TGF－β/Smad信號(hào)傳導(dǎo)路，該急性肝損傷動(dòng)物模型兼?zhèn)涓卫w維化活躍，和TGF－β/Smad信號(hào)傳導(dǎo)通路信號(hào)增強(qiáng)特征，在評(píng)價(jià)早期抗肝纖維化藥物及方法時(shí)具有耗時(shí)少、有效和經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)，值得進(jìn)一步研究。

CCl4;肝總動(dòng)脈夾閉;TGF－β/Smad信號(hào)傳導(dǎo)通路;模型，動(dòng)物

肝纖維化的形成是多因素所致，而目前傳統(tǒng)的肝纖維化動(dòng)物模型大多采用單一因素處理，在慢性肝損傷基礎(chǔ)上刺激膠原組織增生而造成肝組織纖維化［1，2］，此類模型中TGF－β/Smad信號(hào)傳導(dǎo)通路明顯增強(qiáng)，但造模所需時(shí)間長(zhǎng)、成本高、成模比例低。如能在急性肝損傷的模型中也能啟動(dòng)TGF－β/Smad信號(hào)傳導(dǎo)通路，也就提示在急性肝損傷同時(shí)，可能伴隨著抗損傷過程的潛在活化，這在研究早期肝纖維化中意義重大，它不僅可評(píng)價(jià)藥物早期干預(yù)的效果，也較傳統(tǒng)的肝纖維化動(dòng)物模型更省時(shí)，更經(jīng)濟(jì)。但目前并沒有此類兼?zhèn)涓卫w維化活躍，和TGF－β/Smad信號(hào)傳導(dǎo)通路信號(hào)增強(qiáng)特征的急性肝損傷動(dòng)物模型的文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)。本實(shí)驗(yàn)擬在傳統(tǒng)CCl4急性肝損傷模型的基礎(chǔ)上，通過夾閉肝總動(dòng)脈產(chǎn)生缺血后再灌注損傷，構(gòu)建啟動(dòng)大鼠肝組織中的TGF－β/Smad信號(hào)傳導(dǎo)通路的急性肝損傷動(dòng)物模型。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物:健康SD大鼠30只，清潔級(jí)，體重300 ±50 g/只，雌雄各半，湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供［SYCK(湘)2003－0003］。

1.1.2 手術(shù)器械:止血鉗4把、有齒鑷、持針器各1把，12.5 cm顯微鑷1把，系線鑷2把，小動(dòng)脈夾、縫合針數(shù)枚。

1.1.3 儀器:蘇州 Z20P5 10倍手術(shù)顯微鏡，美國(guó)PE公司PCR儀，美國(guó)Ewgle Eye II型病理圖像分析儀，美國(guó) NUAIRE超低溫冰箱，上海天能 UV－2000紫外分析儀。

1.1.4 主要藥品及試劑:戊巴比妥鈉(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào):F20041117，25 g/瓶);分析純CCl4(湖南師大化學(xué)試劑廠，純度99.99%);RTPCR引物 (日本 TAKARA生物技術(shù)有限公司合成);兔抗大鼠 COL－1、COL－3、TGF－β1、Smad3親和抗體(武漢博士德生物工程有限公司);SABC試劑盒，含復(fù)合消化液，正常山羊血清，生物素化山羊抗兔lgG、SABC試劑等(武漢博士德生物工程有限公司);DAB顯色試劑盒，含顯色液A(DAB×20倍稀釋液)，顯色液B(H2O2×20倍稀釋液)，顯色液C (×20倍TBS濃縮緩沖液)(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 造模:2%戊巴比妥鈉45 mg/kg腹腔注射麻醉，劍突以下腹部剃毛、消毒，常規(guī)無菌手術(shù)規(guī)程操作。腹部正中切口2.5～3.0 cm，用無齒鑷提起腹肌沿腹白線剪開腹肌，止血鉗鉗夾切口兩側(cè)的腹肌，暴露肝臟。在10倍手術(shù)顯微鏡下，棉簽鈍性分離肝臟乳頭葉，在其下方找到肝總動(dòng)脈分枝出肝固有動(dòng)脈和胃十二指腸動(dòng)脈處，祛除血管外壁的結(jié)締組織與脂肪組織，將各血管分離，在胃十二指腸動(dòng)脈分出胃右動(dòng)脈前方用絲線結(jié)扎血管，用小動(dòng)脈夾夾閉肝總動(dòng)脈，持續(xù)15 min后松開動(dòng)脈夾，縫合腹壁肌層及皮膚，皮膚切口用70%酒精消毒。將手術(shù)后的大鼠，分別在隨后的第6天和第10天，以25% CCl4花生油溶液6 mL/kg體重腹腔注射，自由飲水、進(jìn)食普通顆粒飼料。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、分組:30只大鼠隨機(jī)分為3組，每組10只，分別為模型組、對(duì)照組、空白組。模型組予手術(shù)加CCl4處理，對(duì)照組單用兩次 CCl4處理，空白組不做任何處理，通過預(yù)實(shí)驗(yàn)設(shè)定第二次給予CCl4后0.5 h、24 h、48 h、72 h為觀測(cè)點(diǎn)比較，選定第二次CCl448 h為最佳觀測(cè)時(shí)間，此時(shí)間點(diǎn)處死所有動(dòng)物。

1.2.3 動(dòng)物處死及取材:大鼠戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，腹中線切皮，暴露游離膈肌心臟取血，離心取血清。充分暴露游離肝臟，從不同肝葉處剪下大小約1 cm ×1 cm ×0.5 cm的兩塊肝組織，用10%中性甲醛溶液固定，留作病理學(xué)和免疫組化檢測(cè);再取約100 mg肝組織提取RNA。

1.2.4 觀察指標(biāo)及各指標(biāo)的測(cè)定

1.2.4.1 血清生化指標(biāo):由湖南中醫(yī)藥大學(xué)附一院檢驗(yàn)科全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清ALT、AST，放射免疫分析法檢測(cè)HA。

1.2.4.2 肝組織:HE染色及病理組織學(xué)評(píng)估:甲醛固定標(biāo)本，石蠟包埋，切片5 μm，二甲苯、乙醇脫水透明，染色后在鏡下觀察肝臟病變情況。

1.2.4.3 RT－PCR檢測(cè)Ⅰ、Ⅲ型膠原(COL－1、COL－3)、TGF－β1、Smad3 mRNA的表達(dá):TRIzol提取大鼠肝組織RNA，方法按照試劑說明書操作。以上四個(gè)指標(biāo)引物參照文獻(xiàn)，并在基因庫(kù)上進(jìn)行核對(duì)，GADPH為內(nèi)參照。COL－1引物如下，上游引物序列5′－CAT AAA GGG TCA TCG TGG CTT C－3′，下游引物序列5′－GTG ATA GGT GAT GTT CTG GGA G－3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為489 bp;COL－3上游引物序列5′－AAC CCA GTA TTC TCC ACT CTT－3′，下游引物序列5′－CGA GGT AACAGA GGT GAA AGA－3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為 349 bp;TGF－β1上游引物序列 5′－CAA AGA CAT CAC ACA CAG TA－3′，下游引物序列5′－AGG TGT TGA GCC CTT TCC AG－3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為 441 bp;Smad3上游引物序列 5′－AAG GGC GAG CAG AAC GGG－3′，下游引物序列 5′－GGG ATG GAA TGG CTG TAG TC－3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為425 bp;GADPH上游引物序列5′－GGT GAA GGT CGG TGT GAA CGG A－3′，下游引物序列5′－TGT TAG TGG GGT CTC GCT CCT G－3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為245 bp;RT－PCR按照試劑盒說明操作，PCR條件為95℃ 5 min，94℃ 30 s，60℃ 40 s，72℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)，72℃ 7 min。取10 μL PCR產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠圖像分析系統(tǒng)檢測(cè)灰度值(IVD)，對(duì)條帶量化處理。

1.2.4.4 免疫組織化學(xué)檢測(cè)肝組織COL－1、COL－3、TGF－β1、Smad3蛋白表達(dá):肝組織標(biāo)本用10%甲醛液固定，石蠟包埋4 μm連續(xù)切片，采用SABC法作免疫組化染色。全自動(dòng)圖像分析儀計(jì)算 COL－1、COL－3、TGF－β1、Smad3的陽(yáng)性信號(hào)，并以此反映該樣本中 COL－1、COL－3、TGF－β1、Smad3含量的相對(duì)多少。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。各組之間采用Sidak法比較，方差不齊者進(jìn)行H檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 血清ALT、AST及HA測(cè)定結(jié)果

對(duì)照組、空白組與模型組比較，在血清 ALT、AST及HA上差異顯著(P＜0.01)，對(duì)照組與空白組在以上三個(gè)指標(biāo)比較差異同樣顯著(P＜0.01)，說明對(duì)照組與模型組在以上三個(gè)指標(biāo)上明顯異常，且以模型組表現(xiàn)最為顯著(表1)。

表1 血清ALT、AST HA的測(cè)定結(jié)果(mean±s)Tab.1 Serum ALT，AST，HA of the determination results(mean±s)

2.2 肝組織病理組織學(xué)評(píng)估

肝組織病理檢查結(jié)果顯示:模型組肝細(xì)胞廣泛性脂肪變性及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肝細(xì)胞索破壞，肝細(xì)胞呈片狀壞死，并可見纖維組織增生分割，纖維隔形成，部分肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞有假小葉形成趨勢(shì);而對(duì)照組僅表現(xiàn)為急性肝損傷病理改變，且損傷程度小于模型組，未發(fā)現(xiàn)纖維組織增生(圖1，見彩插Ⅰ)。

2.3 RT-PCR檢測(cè) COL-1、COL-3、TGF-β1、Smad3 mRNA的表達(dá)

RT－PCR檢測(cè)顯示與空白組、對(duì)照組比較，模型組在 COL－1、COL－3、TGF－β1、Smad3 mRNA的表達(dá)明顯增強(qiáng)，而對(duì)照組與空白組之間，二者沒有明顯差異(圖2)。

經(jīng)PCR產(chǎn)物電泳及半定量分析，與模型組比較，對(duì)照組和空白組在 COL－1、COL－3、TGF－β1、Smad3的灰度值上差異顯著(P＜0.01)，對(duì)照組與空白組之間，4個(gè)測(cè)試值之間未見明顯差異(P＞0.05)(表2)。

2.4 免疫組化檢測(cè)肝細(xì)胞內(nèi)COL-1、COL-3、TGF-β1、Smad3蛋白表達(dá)

以上各指標(biāo)在肝細(xì)胞內(nèi)蛋白水平的表達(dá)，以細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核及部分細(xì)胞膜，呈界限清楚的棕黃色或深棕色反應(yīng)為陽(yáng)性細(xì)胞。與空白組、對(duì)照組比較，在模型組表達(dá)明顯增加，主要分布在炎性細(xì)胞浸潤(rùn)區(qū)、壞死灶、匯管區(qū)及纖維間隔等地方，免疫組化檢測(cè)結(jié)果具有特異性(圖3，見彩插1，2)。

圖2 各實(shí)驗(yàn)組RT－PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖Fig.2 RT－PCR products of gel electrophoresis in all experimental groups

表2 不同組的 COL－1、COL－3、TGF－β1、Smad3灰度值Tab.2 Gray value of different groups of COL－1，COL－3，TGF－β1，Smad3

經(jīng)各實(shí)驗(yàn)組肝細(xì)胞內(nèi) COL－1、COL－3、TGF－β1、Smad3免疫組化陽(yáng)性信號(hào)定量結(jié)果分析，與模型組比較，對(duì)照組和空白組在 COL－1、COL－3、TGF－β1、 Smad3的免疫組化蛋白相對(duì)量差異顯著(P＜0.01)，對(duì)照組與空白組之間，4個(gè)測(cè)試值之間未見明顯差異(P＞0.05)(表3)。

表3 不同組的COL－1、COL－3、TGF－β1、Smad3免疫組化蛋白相對(duì)量Tab.3 Different groups of COL－1，COL－3，TGF－β1，Smad3 relative amount of protein by immunohistochemistry

3 討論

TGF－β/Smad信號(hào)傳導(dǎo)通路是肝纖維化時(shí)主要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑［3，4］，是已知最強(qiáng)烈的肝纖維化促進(jìn)因子－轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF－β1)［5］發(fā)揮生物學(xué)作用的主要通路，而Smad 3介導(dǎo)TGF－β1的大多數(shù)促纖維化效應(yīng)［6，7］。故該通路是肝損傷后向肝纖維化病變的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，阻斷該信號(hào)傳導(dǎo)通路，能較早地逆轉(zhuǎn)肝纖維化。因此構(gòu)建啟動(dòng)TGF－β/Smad信號(hào)傳導(dǎo)通路的模型，在急性肝損傷及肝損傷后早期肝纖維化的實(shí)驗(yàn)研究中意義重大。

本實(shí)驗(yàn)中，模型組在反映血清肝功能指標(biāo)ALT、AST顯著增高;肝臟病理組織學(xué)上改變明顯，可見廣泛性肝細(xì)胞脂肪變性及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肝細(xì)胞索破壞，肝細(xì)胞呈片狀壞死，表明肝細(xì)胞損傷嚴(yán)重。在急性肝損傷的同時(shí)也可見抗損傷機(jī)制的活化，表現(xiàn)為反映纖維化活躍的指標(biāo)也明顯增高，如血清透明質(zhì)酸 (hyaluronic acid，HA)在模型組組明顯升高，反映肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cellular，HSC)活化指標(biāo)和肝臟細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的主要成分Ⅰ、Ⅲ型膠原也明顯增加。與此同時(shí)TGF－β1、Smad3 mRNA轉(zhuǎn)錄水平及蛋白表達(dá)水平明顯升高。而單用CCl4的對(duì)照組僅反映出急性肝損傷，并沒有出現(xiàn)明顯肝纖維化及 TGF－β/Smad信號(hào)通路的傳導(dǎo)。

本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ褪窃谝暂^大劑量的 CCl4，間隔5 d兩次腹腔注射，外加夾閉肝總動(dòng)脈基礎(chǔ)上構(gòu)建成功的。所見到的 TGF－β/Smad信號(hào)傳導(dǎo)通路被啟動(dòng)，肝纖維化指標(biāo)明顯升高的表現(xiàn)在其他的急性肝損傷模型中少見，查閱文獻(xiàn)及本實(shí)驗(yàn)所示，在短時(shí)間若單以CCl4造模，并不能啟動(dòng)TGF－β/Smad信號(hào)傳導(dǎo)通路。分析成功原因可能是本實(shí)驗(yàn)中一方面通過對(duì)肝總動(dòng)脈約15 min的夾閉，阻斷了肝臟的血液的供應(yīng)，產(chǎn)生缺血后再灌注損傷(ischemiareperfusion injury，I－R)，促使 Kupffer細(xì)胞和白細(xì)胞被激活產(chǎn)生大量炎性細(xì)胞介質(zhì)和氧自由基，使肝微循環(huán)障礙，加重肝臟損傷［8］;另一方面，使用了大劑量的CCl4重復(fù)注射，在肝內(nèi)活化的－OOCl3直接損傷質(zhì)膜，啟動(dòng)脂質(zhì)過氧化作用，破壞肝細(xì)胞膜性結(jié)構(gòu)等，造成肝細(xì)胞變形壞死;兩種因素所造成的損傷可能有相加或協(xié)同作用，同時(shí)也可能加快了抗損傷機(jī)制的啟動(dòng)，表現(xiàn)在TGF－β/Smad信號(hào)傳導(dǎo)通路信號(hào)增強(qiáng)，和Ⅰ、Ⅲ型膠原水平的升高。這些表象的存在，提示這一急性肝損傷動(dòng)物模型也有可能對(duì)于研究早期抗肝纖維化藥物和方法有重要價(jià)值。今后我們將對(duì)模型形成機(jī)理、模型改進(jìn)、實(shí)驗(yàn)價(jià)值等做進(jìn)一步的研究。

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Construction of an Acute Liver Damage Animal Model for Priming TGF-β/Smad Signal Conduction Pathway in Hepatic Tissue of Rats

ZHANG Tao1，HUANG Shun－ling2，SUN Ke－wei1，TAN De－ming3，MENG Qiong4，CHEN Chen1
(1.Department of Infectious Diseases，F(xiàn)irst Affiliated Hospital of Hunan Chinese Medical University，Changsha 410007，China; 2.Hunan Provincial Department of Health，Changsha 410005，China; 3.Department of Infectious Diseases，Xiangya Hospital of Central South University，Changsha 410008，China; 4.Laboratary animal Centre，Hunan Chinese Medical University，Changsha 410007，China)

ObjectiveTo construct an acute liver damage animal model for priming TGF－β/Smad signal conduction pathway in hepatic tissue of rats on the basis of traditional model induced by carbon tetrachloride(CCl4). Methods Thirty rats were randomly divided into three groups as model group，control group and blank group.The model group was prepared by clamping the hepaticarterycommuniswith bulldogclamp for 15 minuteswasinjected intraperitoneally with 25% of CCl4contained in arachis oil on the following sixth and tenth day after the operation，respectively.The dosage of the liquor was 6 mL per kg.The control group was only injected intraperitoneally with CCl4twice，while the blank group without any treatment.After 48 hours of the second injection，the rats were sacrificed. Results The levels of ALT，AST and HA in plasma were apparently increased in model group compared with that incontrol group and blank group(P ＜0.01).The liver HE staining in model group showed that there were obvious inflammation，apomorphosis，cellular necrosis and fibroplasias，the gene expression and protein expression of typeⅠ，Ⅲcollagen，TGF－β1 and Smad3 enhanced obviously with RT－PCR detection and Immunohistochemistry technology in the model group than that in control group and blank group(P ＜0.01)。ConclusionAnimal model of acute liver injury have two features:active liver fibrosis and TGF－β/Smad signaling pathway signal enhancement.The acute liver injury rat model priming TGF－β/Smad signal conduction pathway in liver tissue has advantages of less time consuming，utility and economy in evaluating the drugs and methods for early anti－h(huán)epatic fibrosis.

CCl4;Clamping the hepatic artery communis;TGF－β/Smad signal conduction pathway;Model，animal

R－332

A

1671－7856(2010)07－0005－05

2010－01－28

湖南省科技計(jì)劃項(xiàng)目(NO:2007fj4176)，湖南省衛(wèi)生廳中醫(yī)藥科研基金(NO:2006103)。

張濤(1977－)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事傳染病學(xué)及肝病研究。E－mail:emailzt@tom.com

黃順玲(1958－)，女，博士，主任醫(yī)師，主要從事肝病防治及研究。E－mail:huangshunlin@163.com