S W1990和 Capan-2紅色熒光標(biāo)記胰腺癌移植腫瘤模型的建立和比較

李小穎,蘇 衛(wèi),張連峰

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心,衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點實驗室,北京 100021)

研究報告

S W1990和 Capan-2紅色熒光標(biāo)記胰腺癌移植腫瘤模型的建立和比較

李小穎,蘇 衛(wèi),張連峰

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心,衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點實驗室,北京 100021)

目的建立穩(wěn)定表達(dá)紅色熒光蛋白基因的人胰腺癌細(xì)胞系,為體內(nèi)監(jiān)測腫瘤的早期生長及抗腫瘤藥物的藥效評價建立一種新的腫瘤動物模型。方法以 Lipofectamine 2000介導(dǎo) chickenβ-actin-RFP-NEO轉(zhuǎn)染人胰腺癌細(xì)胞 S W1990和 Capan-2,經(jīng)梯度濃度 G418篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)紅色熒光蛋白的細(xì)胞克隆并擴大培養(yǎng)。BALB/ cA-nu裸鼠皮下接種 1×106個發(fā)光細(xì)胞使其成瘤,活體熒光成像系統(tǒng)觀察腫瘤的生長情況。結(jié)果獲得了穩(wěn)定表達(dá) RFP的兩種不同的人胰腺癌細(xì)胞株,將其接種到裸鼠體內(nèi)可成瘤,利用活體成像系統(tǒng)觀察了腫瘤的生長動態(tài)過程,并且 S W1990腫瘤細(xì)胞的生長速度較 Capan-2細(xì)胞快。結(jié)論用紅色熒光蛋白標(biāo)記的人胰腺癌細(xì)胞建立的裸鼠腫瘤模型為胰腺癌的研究和相關(guān)藥物篩選提供了可進行熒光影像活體、動態(tài)分析的動物模型。

人胰腺癌細(xì)胞;紅色熒光蛋白;活體熒光成像系統(tǒng)

腫瘤細(xì)胞系 S W1990和 Capan-2均為源于男性白人的胰腺癌細(xì)胞,組織培養(yǎng),呈現(xiàn)上皮樣細(xì)胞特征;接種裸鼠后,組織病理學(xué)上類似于原發(fā)癌,腫瘤呈現(xiàn)高分化的腺癌樣生長[1,2]。人胰腺癌細(xì)胞株S W1990為高轉(zhuǎn)移人胰腺癌細(xì)胞株,1978年取自一名 58歲胰尾癌并脾轉(zhuǎn)移的男性患者,CEA陽性, 1979年患者死于肝轉(zhuǎn)移。S W1990由美國學(xué)者Kyriazis等建株[1]。人胰腺癌細(xì)胞株 Capan-2取自胰腺導(dǎo)管腺癌,產(chǎn)生高水平粘蛋白 MUC-1的mRNA,低水平粘蛋白MUC-2的mRNA但是不表達(dá)粘蛋白MUC-3基因.目前國內(nèi)外學(xué)者主要集中于胰腺癌轉(zhuǎn)移機制的研究[3-7]。

本實驗利用紅色熒光蛋白 (red fluorescent protein,DsRed)基因分別標(biāo)記 S W1990和Capan-2腫瘤細(xì)胞,結(jié)合光學(xué)影像分析技術(shù),連續(xù)、動態(tài)地觀察和比較兩種不同的人胰腺癌細(xì)胞在裸鼠皮下生長及形成瘤體的過程,建立了光學(xué)腫瘤模型。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與儀器:人胰腺癌細(xì)胞 S W1990和Capan-2本實驗室凍存,L-谷氨酰胺 (G IBCO公司)、雙抗(G IBCO公司)、DMEM(G IBCO公司)、胎牛血清 (G IBCO公司 )、G418(AMRESCO公司 )、Lipofectamine 2000 Reagent(Invitrogene公司 )。Whole-body optical imaging system (I.C.E.,日本Roper公司)、倒置熒光顯微鏡(OLY MPUS IX71)、倒置顯微鏡 (Nikon TS100)。

1.1.2 實驗動物:BALB/cA-nu裸小鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[XCXK(京)2007-0001],鼠齡 5周,體重 15～18 g,在本實驗室無特定病原體 (specific-pathogen free,SPF)的飼養(yǎng)間飼養(yǎng)。所有實驗操作程序均經(jīng)過實驗動物研究所實驗動物使用管理委員會批準(zhǔn) (批準(zhǔn)號為 GC-09-2001)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng):用含 10%胎牛血清、100 IU/mL青霉素,100μg/mL鏈霉素的 DMEM培養(yǎng)基作為S W1990和 Capan-2細(xì)胞的培養(yǎng)液,于 5%CO2,37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.2 構(gòu)建帶有篩選標(biāo)記的載體:chickenβ-actin-RFP由本實驗室構(gòu)建[8,9]。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和篩選:采用 Lipofectamine 2000 Reagent轉(zhuǎn)染 S W1990和 Capan-2細(xì)胞 (具體轉(zhuǎn)染步驟參照 Lipofectamine 2000 Reagent操作說明)。轉(zhuǎn)染后 24 h,用含 1000μg/mL G418的培養(yǎng)液篩選細(xì)胞 3周,獲得穩(wěn)定表達(dá) RFP的細(xì)胞株,選擇其中高表達(dá)的克隆株擴大培養(yǎng)。

1.2.4 腫瘤細(xì)胞的植入及活體熒光成像:收集處于生長對數(shù)期的轉(zhuǎn)染細(xì)胞,稀釋至 5×106/mL。各取三只BALB/cA-nu裸鼠進行皮下接種,1×106個細(xì)胞/只,每隔一周觀察一次,飽和三溴乙醇 (0.18 mL/10 g)麻醉后放入活體熒光影像系統(tǒng)攝像,Slide Book 4.0軟件進行分析。

2 結(jié)果

2.1 穩(wěn)定高表達(dá)D sRed的細(xì)胞株克隆

S W1990和 Capan-2采用脂質(zhì)體 2000轉(zhuǎn)染,用含 1000μg/mL G418的培養(yǎng)液篩選細(xì)胞三周,獲得穩(wěn)定表達(dá) RFP的細(xì)胞株。穩(wěn)定高表達(dá) DsRed的兩種細(xì)胞,在熒光顯微鏡下均呈強熒光,并且熒光較均勻的分布于整個細(xì)胞內(nèi)。單克隆 DsRed細(xì)胞在無 G418篩選壓力下,傳代數(shù)次后仍能穩(wěn)定高水平表達(dá)DsRed(圖 1,彩插 1)。細(xì)胞形態(tài)和未轉(zhuǎn)染細(xì)胞無明顯區(qū)別。

2.2 D sRed熒光標(biāo)記 SW 1990和 Capan-2小鼠腫瘤模型的動態(tài)觀察

分別將對數(shù)生長期的DsRed標(biāo)記的 S W1990和Capan-2腫瘤細(xì)胞皮下接種于 3只 BALB/cA-nu,1 ×106/只。在接種后的 7、14、21、28和 35 d觀察腫瘤的生長情況。在接種的第 7天就可以觀察到腫瘤熒光,通過腫瘤組織發(fā)出的熒光的光子數(shù)確定腫瘤的大小,隨著觀察天數(shù)的增加,腫瘤的體積和發(fā)光強度增加,且具有很好的相關(guān)性 (圖 2和圖 3,彩插2)。以腫瘤細(xì)胞發(fā)射的光子數(shù)對小鼠荷瘤時間作圖得到熒光蛋白標(biāo)記的兩種不同腫瘤細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的生長曲線 (圖 4),發(fā)現(xiàn) S W1990腫瘤明顯比Capan-2快。

3 討論

DsRed是紅色熒光蛋白 (red fluorescent protein, RFP)的一種,是從印度洋-太平洋中?？嚓P(guān)的Discosoma sp中分離得到的生物發(fā)光蛋白,相對分子質(zhì)量為 28×103。它能在紫外線激發(fā)時發(fā)出紅色熒光,其最大激發(fā)波長為 558 nm,最大發(fā)射波長為583 nm,且發(fā)射峰位于培養(yǎng)基、組織培養(yǎng)玻璃器材及細(xì)胞成分等產(chǎn)生的熒光背景范圍之外[10]。RFP能在哺乳動物細(xì)胞中高效表達(dá),可用于示蹤活細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)調(diào)控、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運及蛋白質(zhì)之間的相互作用等。與綠色熒光蛋白各種變異體比較,DsRed能提供更高的信噪比。而且,由于 DsRed為長發(fā)射波長,故細(xì)胞中熒光轉(zhuǎn)換效率更高,較短發(fā)射波長的綠色和藍(lán)色熒光信號更為清楚。與其他報告基因比較,DsRed具有觀察方便、靈敏度高、對極端 pH值和光漂白抗性強、定性和定量測定方便等特點,因而日益受到關(guān)注。

圖 4 紅色熒光標(biāo)記兩種胰腺腫瘤的生長曲線Fig.4 Thegrowthcurve of Capan-2-DsRedand S W1990-DsRed in vivo

活體動物體內(nèi)光學(xué)成像技術(shù)對疾病動物模型微小病灶的檢測靈敏度極高,該技術(shù)能夠進行無創(chuàng)、實時、動態(tài)的動物活體觀察,從而對同一實驗對象進行不同時間點的觀察,減少實驗動物個體間差異,與傳統(tǒng)的實驗方法相比,可以大大減少動物的用量,符合替代、減少、優(yōu)化的“3R”原則。本實驗中將強啟動子 chickenβ-actin啟動的 RFP基因轉(zhuǎn)染到人胰腺癌細(xì)胞株 S W1990和 Capan-2中得到了高表達(dá)DsRed熒光蛋白細(xì)胞株。經(jīng)過多次傳代表達(dá)水平穩(wěn)定,標(biāo)記細(xì)胞的形態(tài)、生長方式、生長速度及致瘤能力等與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞無明顯差異,可以反映S W1990和 Capan-2腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的標(biāo)記細(xì)胞,其他標(biāo)記細(xì)胞的研究報道也證實了類似的結(jié)果[11]。將 RFP標(biāo)記的兩種人胰腺癌細(xì)胞經(jīng)皮下接種至BALB/cA-nu裸鼠,用活體熒光成像系統(tǒng)連續(xù)觀察,發(fā)現(xiàn)能夠成瘤,并且腫瘤的體積與發(fā)光強度有相關(guān)性,建立了一種新的能夠用于活體內(nèi)連續(xù)監(jiān)測腫瘤生長的動物模型。此癌癥模型利用無創(chuàng)傷活體熒光成像對癌細(xì)胞生長的檢測,可對癌癥治療之前和過程中的癌細(xì)胞的變化進行實時觀測和評估,可應(yīng)用于癌癥體內(nèi)用藥的療法中。另外,從兩種不同腫瘤細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的生長曲線發(fā)現(xiàn)S W1990腫瘤細(xì)胞的惡性程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于 Capan-2腫瘤細(xì)胞,S W1990高肝轉(zhuǎn)移的人胰腺癌細(xì)胞株具有侵襲力強、轉(zhuǎn)移效率高和轉(zhuǎn)移范圍廣的特點,常用來深入研究胰腺癌肝轉(zhuǎn)移機理的理想細(xì)胞系[12-15]。綜上,活體成像系統(tǒng)具有較高的靈敏度,能夠客觀評價 S W1990-Ds Ded和 Capan-2-DsRed細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的生長情況,為成像系統(tǒng)在胰腺癌的發(fā)展機制、藥物治療、基因治療等方面的研究提供重要的參考依據(jù)。

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The Establishment and Comparison of TwoM ouse Transplanted Tumor M odels with D sRed-labeled SW1990 and Capan-2 Human Pancreas Cancer CellL ines

L IXiao-ying,SU Wei,ZHANGLian-feng
(KeyLaboratory of Human Diseases ComparativeMedicine,Ministry of Health;Institute ofLaboratoryAnimal Science, Chinese Academy ofMedical Sciences(CAMS)&ComparativeMedicine Centre,PekingUnionMedical Collage(PUMC),Beijing 100021,China)

ObjectiveTo establish DsRed-labeled human pancreas cancer cell lines and to generate a noninvasive model for monitoring tumor growth in vivo.M ethod Human pancreas cancer cells of S W1990 and Capan-2 were transfected with chickenβ-actin-DsRed-neo byLipofectamine 2000 reagent and screened with G418 to produce the stable DsRed-expressing clone.Then the labeled S W1990 and Capan-2 cellswere implanted into the subcutaneous tissue of nude mice and the growth of the implanted tumorwas observed and analyzed with the whole-body optical imaging system.Result The stable DsRed-expressing S W1990 and Capan-2 cell lines were established and the cell line was used to duplicate the implanted tumormousemodel.The growth of the tumormasswith red fluorescentprotein labeled S W1990 and Capan-2 was observed after inoculation of the cells below dorsal blank ofBALB/cA-nu。ConclusionThe implanted tumormousemodel ofDsRed-labeled S W1990 and Capan-2 cell was established,which was a convenient model for the dynamic and in vivoresearch on the human pancreas cancer and drug discovery.

Human pancreas cancer cell;Red fluorescent protein;Whole-body optical imaging system

R541

A

1671-7856(2010)03-0012-03

2009-09-15

衛(wèi)生部行業(yè)基金,實驗動物和人類疾病動物模型資源擴展(200802036)和十一五新藥專項支持(2009ZX09501-026)。

李小穎,實習(xí)研究員,主要研究方向:人類疾病動物模型。

張連峰。E-mail:zhanglf@cnilas.org