輔酶依賴型和不依賴型甘油脫水酶的比較

楊仲麗,方柏山,余勁聰,王慶花,李梓君

(華僑大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)福建省高等學(xué)校重點實驗室,福建泉州362021)

輔酶依賴型和不依賴型甘油脫水酶的比較

楊仲麗,方柏山,余勁聰,王慶花,李梓君

(華僑大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)福建省高等學(xué)校重點實驗室,福建泉州362021)

實驗比較源自肺炎克氏桿菌(K.pneumoniae)和丁酸梭狀芽孢桿菌(C.butyricum)中的甘油脫水酶(GDHt)的輔酶依賴特性.采用生物信息學(xué)的方法,對兩種酶的異同點進行分析,發(fā)現(xiàn)兩種酶結(jié)構(gòu)上相似性較低、親緣性較遠、分屬于兩個不同的家族.SMART數(shù)據(jù)庫搜索結(jié)果表明,C.butyricum中不依賴輔酶的甘油脫水酶及其再激活酶,分別屬于gly-Radical和Radical-SAM家族,多序列比對得到的一段富含半胱氨酸殘基C＊＊C＊＊C的保守序列正是其共同特征.

肺炎克氏桿菌;丁酸梭狀芽孢桿菌;輔酶;甘油脫水酶;維生素B12;依賴性

甘油脫水酶(GDH t)是微生物發(fā)酵法生產(chǎn)3-羥基丙醛(3-HPA),進而生產(chǎn)1,3-丙二醇(1,3-PD)過程中的重要限速酶之一.在已發(fā)現(xiàn)能發(fā)酵甘油,產(chǎn)生1,3-丙二醇(1,3-PD)的微生物中[1],克氏肺炎桿菌(K.pneum oniae)和丁酸梭狀芽孢桿菌(C.butyricum)具有較高的1,3-PD轉(zhuǎn)化率及生產(chǎn)強度,是研究得比較多的兩種菌[2].K.pneumoniae以甘油為底物發(fā)酵生產(chǎn)(3-HPA)的一個關(guān)鍵的限制點,是編碼一種依賴輔酶B12的甘油脫水酶,即需要在培養(yǎng)基中額外地加入維生素B12.C.butyricum具有良好的1,3-PD耐受力,且其發(fā)酵過程具備對輔酶B12的不依賴性.該菌屬于嚴(yán)格厭氧菌,在實驗室培養(yǎng)條件苛刻,而在工業(yè)培養(yǎng)中方便.對于C.butyricum中甘油脫水酶不依賴輔酶的報道[3-5],使得該種甘油脫水酶催化機制的研究成為新的熱點.本文比較源自K.pneumoniae和C.butyricum中GDHt對輔酶B12的依賴性,并從生物信息學(xué)角度找出輔酶依賴型和不依賴型甘油脫水酶的異同點.

1 材料與方法

1.1 材料

(1)菌株.肺炎克氏桿菌(K.pneumoniae,DSM 2026),丁酸梭狀芽孢桿菌(C.butyricum, VPI1718),由德國生物技術(shù)研究中心惠贈.(2)試劑.輔酶B12,鹽酸3-甲基-2-苯并咪唑酮腙(MBTH),購自美國Sigma公司;其余試劑均為國產(chǎn)分析純.(3)生物學(xué)數(shù)據(jù)庫.NCB I,PDB,SM ART等.(4)應(yīng)用軟件.Cluster X,Molsoft ICM-Pro,Phylip等.

1.2 方法

1.2.1 GDH t的酶活測定方法 (1)預(yù)處理.將保存于-20℃的K.pneumoniae和C.butyricum經(jīng)過活化、擴大培養(yǎng)和發(fā)酵后,離心收集菌體,并采用超聲波細胞破碎法(1 s內(nèi)超聲0.6 s,間歇0.4 s)破碎;然后,將離心懸浮液,上清液即為無細胞抽提液,用于酶活性分析.其中,C.butyricum培養(yǎng)的整個過程都在嚴(yán)格厭氧條件下進行.

(2)測定方法.GDHt催化甘油脫水生成的醛類,其與MBTH反應(yīng)形成的復(fù)合物可用紫外分光光度法進行測定.采用Toraya等建立的MBTH(3-甲基-2-苯并噻唑腙煙酸鹽)法測定GDHt的活性.

(3)反應(yīng)體系.適量無細胞抽提液,0.12 mol·L-1甘油,0.035 mol·L-1磷酸鉀緩沖液,0.05 mol·L-1KCl,選擇性地添加15μmol·L-1輔酶B12,總體積為1 m L.在37℃下反應(yīng)一定時間后,加入1 m L的0.1 mol·L-1檸檬酸鉀緩沖液(p H=3.6)以終止反應(yīng);然后,加入0.5 mL的0.1%MBTH,于37℃下保溫15 m in,加入1 m L水,于305 nm下測定其吸光度值.

1.2.2 生物信息學(xué)比較 (1)一級結(jié)構(gòu)比較.從生物數(shù)據(jù)庫NCBI上搜索得到輔酶依賴型和不依賴型GDH t的氨基酸序列,K.pneum oniae中GDHt氨基酸序列的NCB I登陸號為U 60992,C.butyricum中GDHt的NCBI登陸號為A Y112989.利用NCBI數(shù)據(jù)庫的BLAST(兩條序列對齊)功能(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/),提交輔酶依賴型GDH t的α,β,γ亞基和不依賴型GDH t及其再激活酶基因序列;搜索其相似序列和區(qū)域,并對輔酶不依賴型GDHt的整個數(shù)據(jù)庫進行相似性分析.在此基礎(chǔ)上,選取相似性較高的幾條序列,利用Cluster X軟件進行多序列比對,以尋找保守區(qū)域.

(2)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域搜索.利用SMART數(shù)據(jù)庫搜索GDHt及其再激活酶結(jié)構(gòu)域,所得結(jié)構(gòu)域同時提供相關(guān)連接,如結(jié)構(gòu)域功能、分布范圍,以及是否具有已知空間結(jié)構(gòu).

(3)酶分子空間結(jié)構(gòu)的重疊分析.從PDB數(shù)據(jù)庫上搜索并下載輔酶依賴型和不依賴型GDHt的晶體結(jié)構(gòu),K.pneumoniae中GDH t晶體結(jié)構(gòu)的PDB登陸號為1MM F,C.butyricum中GDH t晶體結(jié)構(gòu)的PDB登陸號為1R9D.利用Molsoft ICM-Pro軟件對其3級結(jié)構(gòu)進行空間位置的重疊,以衡量其空間構(gòu)象的相似性.

(4)酶的親緣性分析.利用軟件Phylip,建立包括K.pneumoniae和C.butyricum的GDH t在內(nèi)的進化樹,分析兩者親緣性.

圖1 氧氣對C.butyricum中GDH t酶活的影響Fig.1 Effect of oxygen on the activity of GDHt from C.butyricum

2 結(jié)果與討論

2.1 GDHt輔酶依賴性的比較

在有氧條件下,分別測定添加與不添加輔酶的GDHt酶活,結(jié)果如圖1所示.實驗發(fā)現(xiàn),K.pneum oniae中GDH t在輔酶B12存在下,表現(xiàn)出的酶活為13.70 μkat·L-1,而不添加輔酶則沒有活性,反應(yīng)10 min后終止.由于C.butyricum中GDH t對氧氣較敏感,所以在有氧條件下測量其酶活時需通入去氧劑.

在不同的反應(yīng)終止時間,發(fā)現(xiàn)隨著GDH t在氧氣中暴露時間越長,酶活喪失越多(終止時間為1 min時,可近似看作厭氧).從圖1可看出,C.butyricum的GDHt在添加與不添加輔酶B12時,酶活相差較小.

2.2 一級結(jié)構(gòu)的序列分析

在NCB I服務(wù)器上使用BLAST程序中的BLOSUM 62矩陣,空位開放罰分和空位擴展罰分分別為11和1,對兩序列進行對齊分析,結(jié)果如圖2所示.圖2顯示,此兩條序列間沒有相似的序列及區(qū)域.

圖2 兩條序列對齊結(jié)果Fig.2 Alignment of the two sequences

利用綜合性軟件Molsoft ICM-Pro計算輔酶依賴型GDHt的α亞基和不依賴型GDHt完全對齊時相同堿基僅為19%,結(jié)果如圖3所示.由于兩序列同源性較小,而輔酶依賴型GDH t的催化機制已得到較透徹的研究,在此,以不依賴型GDHt為探索的重點.

圖3 Molsoft ICM-Pro計算兩序列的同源性結(jié)果Fig.3 Calculation of homology between the two sequences by Molsoft ICM-Pro

在NCBI服務(wù)器上使用BLAST程序,從SW ISS-PORT蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫中搜索輔酶不依賴型GDHt的相似序列,結(jié)果如圖4所示.圖4中列出的最高分值的擊中項,每一行顯示一條蛋白質(zhì)序列.從左到右依次是數(shù)據(jù)庫編號、序列名稱、序列長度,然后是兩個僅與技術(shù)有關(guān)的分值,末尾行是閥值E, E值由高到低.搜索使用的是BLOSUM 62矩陣,空位開放罰分和空位擴展罰分分別為8和2,其中設(shè)定閥值E為0.1.

圖4 輔酶不依賴型GDHt對庫檢索結(jié)果Fig.4 Retrieval of B12-independent GDHt in the NCB Idatabase

由圖4可看出,來自不同菌種的PFL序列聯(lián)配分值較高.選取幾種同源性較高的酶,利用ClusterX軟件進行多序列比對.找出圖5所示的保守區(qū)域,其中富含半胱氨酸殘基.活性中心的半胱氨酸殘基遇氧容易形成S-S鍵,失去轉(zhuǎn)移電子的能力.這可能是該酶對氧氣較敏感.

K.pneumoniae中的GDHt是6個亞基α2,β2,γ2,通過非共價鍵的疏水相互作用締合成的異六聚體,其中兩個α,β,γ異型三聚體組成了一個對二聚體.α亞基含一個丙糖磷酸異構(gòu)酶(TIM)桶狀結(jié)構(gòu),把活性中心圍在中間.B12位于TIM桶狀結(jié)構(gòu)和β亞基之間,如圖6所示[6].

C.butyricum中的GDH t是一個由單亞基通過非共價鍵的疏水相互作用締合成的二聚體,它的兩個單體呈幾乎完美的中心對稱,其單體由10個β/α桶狀結(jié)構(gòu)組成,氨基酸C端(黃色標(biāo)記)作為高度保守區(qū),是與再激活酶結(jié)合的位點,如圖7所示[7].從圖6,7可看出,輔酶不依賴型GDH t在氧氣中暴露時間越長,酶活喪失越多.其中,DhaB為輔酶不依賴型GDH t基因,PflC,TutE,N rdG的NCB I登陸號分別為Ec(P32675),T1(AAC38452),Ec(P39329).

圖7 C.butyricum甘油脫水酶的晶體結(jié)構(gòu) Fig.7 Crystal structure of GDHt from C.butyricum

圖6 K.pneumoniae甘油脫水酶的拓撲結(jié)構(gòu)圖Fig.6 Opology of GDHt from K.pneumoniae

圖5 ClusterX多序列比對搜索到的保守區(qū)域Fig.5 Conserved region found by multip le sequence alignments

2.3 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的搜索結(jié)果分析

在SMART搜索到的輔酶不依賴型GDH t的結(jié)構(gòu)域,如表1所示.從表1可知,該蛋白有一段相似于PFL家族的結(jié)構(gòu)域和一段gly-Radical結(jié)構(gòu)域.搜索輔酶不依賴型GDHt的再激活酶(GDH t-AE)時,發(fā)現(xiàn)其屬于“Radical-SAM”家族,如表1所示.

Heidi等[8]指出,這一家族的成員均可催化一系列不依賴輔酶的化學(xué)反應(yīng),但是每一種酶根據(jù)底物不同而需要不同的輔因子,并有著相同的催化機理.在搜索輔酶依賴型GDHt時,未發(fā)現(xiàn)有顯著的結(jié)構(gòu)域.

2.4 三級結(jié)構(gòu)重疊分析

利用Molsoft ICM-Pro軟件,對輔酶依賴型和不依賴型GDH t的3級結(jié)構(gòu)進行最大限度重疊,結(jié)果如圖8(a)所示.雖然兩者都為二聚體,但是空間結(jié)構(gòu)相差較大,重疊部分較少.

引入均方根偏差DRMS作為衡量重疊效果的參數(shù),DRMS越大,重疊部分越少.兩者重疊的DRMS值為27.104 749.作為比較,同時重疊來自Clostridium novyi的PFL與不依賴型GDHt,兩者相似性為78%,DRMS為9.607 466,如圖8(b)所示.

2.5 進化樹的建立

選擇兩種酶對庫檢索時產(chǎn)生的序列,利用Phylip軟件生成進化樹,如圖9所示.圖9中,黑框標(biāo)記為K.pneum oniae和C.butyricum中GDHt.從圖9可看出,輔酶不依賴型GDHt與一類PFL及同樣不依賴輔酶的GDHt有較近的親緣性,同屬于Radical-SAM家族[4,9].

表1 SMART的結(jié)構(gòu)域搜索結(jié)果Tab.1 Domains of GDHt found by SMART

圖8 三級結(jié)構(gòu)重疊結(jié)果Fig.8 Overlapping of tertiary structures

圖9 兩種GDH t的進化樹分析Fig.9 Analysis of the phylogenetic tree of the two enzymes

從多序列比對得到的一段C＊＊C＊＊C看出,此結(jié)構(gòu)域與Layer等[10]報道的Coproporphyrinogen-Ⅲoxidase中與[4Fe-4S]簇匹配的3～4個彼此間隔的半胱氨酸殘基基團C＊＊C＊＊C匹配.因此,推測輔酶不依賴型GDH t借助SAM斷裂所產(chǎn)生的活性5’-脫氧腺苷自由基替代B12起作用;而輔酶依賴型GDHt與一類同樣依賴輔酶B12的GDHt親緣性較近.當(dāng)輔酶B12與GDHt結(jié)合時,其Co-C鍵發(fā)生均裂,產(chǎn)生一個5’-脫氧腺苷自由基團,引發(fā)一系列電子轉(zhuǎn)移催化反應(yīng)[11],而兩者之間親緣性較遠.

綜上所述,來自K.pneumoniae中依賴輔酶B12和C.butyricum中不依賴輔酶,其甘油脫水酶相似性較低.從兩序列的對齊結(jié)果看,兩條序列同源性較低.從SMART搜索結(jié)果可看出,C.butyricum中不依賴輔酶的甘油脫水酶及其再激活酶分別屬于gly-Radical和Radical-SAM家族,多序列比對得到的一段富含半胱氨酸殘基C＊＊C＊＊C的保守序列正是其共同特征.

因此,B12-independent GDH t的催化機制同于Radical-SAM家族其他成員,即借助S-adenosylmethionine代替輔酶B12起作用.

3 結(jié)束語

研究結(jié)果可為C.butyricum中的甘油脫水酶基因工程改造,得到兼性厭氧,產(chǎn)不依賴輔酶的GDHt提供理論依據(jù).下一步研究是,通過定點突變等技術(shù),改造此保守區(qū)域的半胱氨酸殘基,使其在具備穩(wěn)定酶活的同時對氧氣有一定的抵御能力.

參考文獻:

[1] BIEBL H,M ENZEL K,ZENGA P,et al.M icrobial p roduction of 1,3-p ropanediol[J].M icrobiology And Biotechnology,1999,52(3):289-297.

[2] 王劍鋒,劉海軍,修志龍,等.生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)1,3-丙二醇的研究進展[J].化學(xué)通報,2001,64(10):621-625.

[3] STUBBE J,VAN DER DONKW A.Protein radicals in enzyme catalysis[J].Chemical Review s,1998,98(7):705-762.

[4] GUNH ILD L,DIRKW H,D IETER J,et al.Structure and function of radical SAM enzymes[J].Chemical Biology, 2004,8(5):468-476.

[5] CHEEK J,BRODERICK JB.Adenosylmethionine-dependent ironsulfur enzymes:Versatile clusters in a radical new role[J].Journal of Biological Inorganic Chemistry,2001,6(3):209-226.

[6] L IAO D I,DOTSON G,TURNER Jr I,et al.Crystal structureof substrate free form of glycerol dehydratase[J].Ino rg Biochem,2003,93(1/2):84-91.

[7] O’BRIEN J R,RA YNAUD C,CROUX C,et al.Insight into the mechanism of the B12-independent glycerol dehydratase from Clostridium butyricum:Preliminary biochemical and structural characterization[J].Biochemistry, 2004,43(16):4635-4645.

[8] SOFIA H J,CHEN G,HETZLER B G,et al.Rdiacal SAM,a novel p rotein superfamily linking unresolved steps in familiar biosynthetic pathways w ith radical mechanism s:Functional characterization using new analysis and info rmation visualization methods[J].Nucleic Acid Research,2001,29(5):1097-1106.

[9] HENSHAW T F,CHEEK J,BRODERICK JB.The[4Fe-4S]1+cluster of pyruvate formate-lyase activating enzyme generates the glycyl radical on pyruvate fo rmate-lyase:EPR-detected single turnover[J].Journal of the American Chemical Society,2000,122(34):8331-8332.

[10] LA YER G,VERFURTH K,MAHL ITZ,et al.Oxygen-independent cop roporphyrinogen-Ⅲoxidase HemN from Escherichia coli[J].Journal of Biological Chemistry,2002,277(37):34136-34142.

[11] TORA YA T.Radical catalysis of B12enzymes:Structure,mechanism,inactivation,and reactivation of diol and glycerol dehydratase[J].Journal of Cell and Molecular Life Science,2000,57(1):106-127.

Com parison between the B12-Dependen t and Independen t Glycerol Dehydratase

YANG Zhong-li,FANGBai-shan,YU Jin-cong, WANG Qing-hua,L IZi-jun
(Key Laboratory of Industrial Biotechnology Fujian Province,Huaqiao University,Quanzhou 362021,China)

In this paper,the coenzyme B12dependence of glycerol dehydratase between Klebsiella pneumoniae and Clostridia butyricum was compared.Their differences and similaritieswere analyzed w ith bioinfo rmatics.Results showed that these two enzymes belonged to two different familiesw ith low similarities.Searching the SMART database and the result also show s that the B12-independent glycerol dehydratase from Clostridia butyricum and its reactivate enzyme belong to gyl-Radical family and Radical-SAM family respectively,and the conserved sequence w hich is rich in half-cysteine obtained by multip le alignments is their common feature.

Klebsiella pneumoniae;Clostridia butyricum;coenzyme;glycerol dehydratase;vitamin B12;dependence

Q 55

A

(責(zé)任編輯:黃曉楠 英文審校:劉源崗)

1000-5013(2010)05-0542-06

2009-02-11

方柏山(1957-),男,教授,主要從事合成生物學(xué)的研究.E-mail:fangbs@hqu.edu.cn.

國家高技術(shù)研究發(fā)展(863)計劃項目(2006AA 020103);國家自然科學(xué)基金資助項目(20676048, 30770059)