結(jié)核分枝桿菌膜蛋白Rv0849免疫學(xué)特性的初步檢測

胡志東, 陳淑丹, 羅如松, 劉 偉, 曹 健, 王洪海, 張雪蓮

(1.復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院遺傳工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海200433; 2.河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院 河南鄭州450001)

結(jié)核分枝桿菌膜蛋白Rv0849免疫學(xué)特性的初步檢測

胡志東1,2, 陳淑丹1, 羅如松1, 劉 偉1, 曹 健2, 王洪海1, 張雪蓮1

(1.復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院遺傳工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海200433; 2.河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院 河南鄭州450001)

探討了結(jié)核分枝桿菌膜蛋白Rv0849作為藥泵蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)功能及其作為外源蛋白免疫誘導(dǎo)C57BL/6小鼠產(chǎn)生免疫應(yīng)答的能力.從H37Rv基因組中擴(kuò)增獲得Rv0849基因,酶切后連接到分枝桿菌穿梭質(zhì)粒pMV 261上構(gòu)建重組質(zhì)粒pMV 0849,并以恥垢分枝桿菌為載體構(gòu)建獲得重組菌株SM(0849).檢測藥物對重組菌株SM(0849)的最小抑菌濃度(M IC)變化,用重組菌株免疫C57BL/6小鼠檢測其作為外源蛋白免疫誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的免疫應(yīng)答反應(yīng).結(jié)果表明,重組菌株SM(0849)對藥物的耐受性沒有明顯提高,但能夠較早、較好地誘導(dǎo)小鼠體液免疫應(yīng)答水平,并能通過刺激小鼠脾臟淋巴細(xì)胞促使其分泌高水平的腫瘤壞死因子-α和干擾素-γ.Rv0849所編碼的蛋白具有較弱的藥泵功能,但有潛力成為一種新的免疫抗原.

結(jié)核分枝桿菌;Rv0849;恥垢分枝桿菌;TNF-α;IFN-γ

0 引言

結(jié)核分枝桿菌(M ycobacterium tubercu losis,M TB)是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最為嚴(yán)重的傳染病病原體之一.據(jù)估計(jì),全世界有1/3的人口感染此菌.近年來,卡介苗對成人保護(hù)效果的下降以及多重耐藥結(jié)核分枝桿菌的出現(xiàn)給臨床治療帶來了很大挑戰(zhàn)[1].

膜蛋白和膜相關(guān)蛋白在細(xì)菌生長繁衍中扮演著至關(guān)重要的角色,例如細(xì)胞間的相互作用、離子和營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞信號以及與致病機(jī)制相關(guān)[2].其中,藥物外排泵是細(xì)菌膜蛋白比較重要的功能之一,細(xì)菌主動(dòng)外排是導(dǎo)致其產(chǎn)生多重耐藥的重要原因[3].另外,膜蛋白直接暴露在細(xì)胞表面,與宿主免疫活性細(xì)胞的相應(yīng)膜受體相互作用,刺激細(xì)胞和體液免疫的形成,具有良好的免疫原性[4].因此,膜蛋白被認(rèn)為是抗結(jié)核藥物和疫苗開發(fā)的主要靶點(diǎn)所在.Rv0849是結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組中編碼膜蛋白的基因之一,被定義為可能的藥物外排泵編碼基因[5].進(jìn)行TM HMM分析表明其含有12個(gè)跨膜區(qū),具有較好的免疫原性.目前國內(nèi)外尚未見到關(guān)于此蛋白在藥物外排中的作用以及免疫特性的報(bào)道,本文針對該基因編碼蛋白進(jìn)行了探索性研究.

1 材料與方法

1.1 材料

結(jié)核分枝桿菌H37Rv、大腸桿菌菌株(Escherichia coli)DH5α、恥垢分枝桿菌(M ycobacterium smegm atis,SM)、穿梭載體pMV 261均為本實(shí)驗(yàn)室保存;卡那霉素購自Sigma公司;限制性內(nèi)切酶Eco RI、H indⅢ、DNA M arker以及T4DNA連接酶購自TaKaRa公司;p fu Tag DNA聚合酶、膠回收試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒購自全式金生物公司;引物合成和DNA序列測定由上海生工生物工程有限公司完成;M illerbrook 7H9、7H10培養(yǎng)基購自D IFCO公司;C57BL/6(平均25 g,雌性)小鼠購自上海第二軍醫(yī)大學(xué);EL ISA試劑盒購自eBioscience公司;其余化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 根據(jù)GenBank中結(jié)核分枝桿菌Rv0849的基因序列,使用軟件p rimer5設(shè)計(jì)引物.上游引物:CACA TGGGAGCGCGCGCTA TA TTC,下游引物:CTTCACCGGGGTGCA GCCCA,其中下劃線部分分別為Eco RⅠ和H indⅢ限制性酶切位點(diǎn).PCR反應(yīng)條件:94℃變性30 s,60℃退火1 min,72℃延伸2 min,如此30個(gè)循環(huán).PCR產(chǎn)物純化回收后,與穿梭載體pMV 261經(jīng)核酸內(nèi)切酶酶切后用T4DNA連接酶16℃連接過夜,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,涂布在含有50 mg/L卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上,篩選陽性克隆.抽提重組質(zhì)粒,酶切鑒定正確后,提交上海生工生物工程有限公司測序.

1.2.2 恥垢分枝桿菌的感受態(tài)制備 恥垢分枝桿菌培養(yǎng)于7H9培養(yǎng)基(含體積分?jǐn)?shù)10%ADC),37℃搖床培養(yǎng)2～3 d后達(dá)到對數(shù)生長期,菌液先冰浴2 h,然后8 000 r/min離心15 min收集菌體,用無菌預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)10%甘油洗滌3次后,重懸于預(yù)冷的甘油中過夜,備用.

1.2.3 恥垢分枝桿菌的電轉(zhuǎn)化 采用0.2 cm間距電轉(zhuǎn)杯(Bio-Rad Laboratories,Inc.,Hercules,CA), Gene PulserⅡ電轉(zhuǎn)化系統(tǒng)(Bio-Rad Laboratories,Inc.),感受態(tài)恥垢分枝桿菌細(xì)胞500μL,重組質(zhì)粒30μL.電轉(zhuǎn)化條件為:室溫,500 V,25μF,1 000Ω.細(xì)菌在7H9培養(yǎng)基中37℃活化4 h后,涂布于含有50 mg/L卡那霉素的7H10培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)2 d.挑取可以在卡那霉素抗性平板上生長的單個(gè)陽性克隆.經(jīng)過大量培養(yǎng)后提取陽性克隆的基因組,并利用PCR方法進(jìn)行目的條帶鑒定.同時(shí),從可擴(kuò)增出目的條帶的陽性克隆中提取質(zhì)粒,酶切鑒定,正確者命名為SM(0849),保存菌種.同樣方法將空載體pM V 261電轉(zhuǎn)化到恥垢分枝桿菌中,獲得重組菌株并命名為SM(261),在后期實(shí)驗(yàn)中作為對照.

1.2.4 重組菌株最小抑菌濃度(M IC)測定 為評價(jià)Rv0849是否具有藥泵蛋白的功能,特別是對喹諾酮類藥物的耐藥性,采用測定過表達(dá)目的基因的重組恥垢分枝桿菌對各類藥物的M IC的方法.將相同菌量(106CFU/m L,100μL)的菌液均勻涂布在含有不同濃度藥物的細(xì)菌培養(yǎng)板,37℃培養(yǎng)2 d后,觀察細(xì)菌生長情況,統(tǒng)計(jì)不同藥物對細(xì)菌的生長影響,M IC定義為抑制細(xì)菌生長的最小藥物濃度.檢測的藥物包括抗結(jié)核一線藥物異煙肼(INH)、利福平(RIF)、乙胺丁醇(EMB)和鹽酸四環(huán)素(Tet)、氯霉素(CAF)、紅霉素(ETM)、氧氟沙星(OFL)和青霉素(PC)等,其中氧氟沙星屬于喹諾酮類藥物,藥物濃度梯度和溶劑各有不同.異煙肼、利福平、乙胺丁醇、氧氟沙星以及青霉素的質(zhì)量濃度從10 mg/L倍比稀釋到0.039 mg/L.氯霉素質(zhì)量濃度從250 mg/L倍比稀釋到0.98 mg/L,紅霉素與鹽酸四環(huán)素質(zhì)量濃度從20 mg/L倍比稀釋到0.002 3 mg/ L.異煙肼、乙胺丁醇、鹽酸四環(huán)素和青霉素采用無菌超純水稀釋;紅霉素和氯霉素采用無水乙醇稀釋;利福平采用二甲基亞砜(DM SO)稀釋;氧氟沙星采用0.4 mo l/L的乙酸稀釋.同時(shí)分別以相對應(yīng)的溶劑做陰性對照.測定所使用菌株包括SM(0849),SM(261)以及SM.

1.2.5 小鼠的免疫 將C57BL/6小鼠隨機(jī)分為4組,每組6只.實(shí)驗(yàn)分組包括生理鹽水組、SM對照組、SM (261)組以及SM(0849)組.將培養(yǎng)好的細(xì)菌用PBS緩沖液沖洗2次,最后懸浮于PBS中,取一部分細(xì)菌涂板計(jì)數(shù).取計(jì)數(shù)好的細(xì)菌液200μL,含細(xì)菌量約為5×106CFU對小鼠腹股部皮下進(jìn)行注射免疫.

1.2.6 應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(EL ISA)測定IgG滴度以及IgG2a/IgG1比值[6]免疫后分別于第3周和第6周處死小鼠,每組每次各3只,眼球取血,分離血清.采用EL ISA方法檢測小鼠血清中的IgG含量.以全菌作為抗原,無菌超聲后用包被液沖洗3次,用包被液稀釋成相同濃度,取100μL菌液包被96孔板過夜,其余步驟參照試劑盒說明書,顯色后用分光光度計(jì)(Bio Tek,ELx808)在490 nm處讀板.

1.2.7 應(yīng)用EL ISA檢測TN F-α和IFN-γ 無菌分離小鼠脾臟,用PBS將壓磨后的單個(gè)淋巴細(xì)胞從尼龍膜上濾過.在無菌離心管中用PBS定容至4 m L,加入等量淋巴分離液,2 500 r/min離心20 min使之分層.吸取中間層云霧狀的淋巴細(xì)胞到干凈離心管中,用PBS洗滌3次,最后用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPM I-1640培養(yǎng)基懸浮.取少量計(jì)數(shù),將細(xì)胞濃度調(diào)整為5×105CFU/m L.將計(jì)數(shù)后的細(xì)胞接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,接種量為每孔5×105個(gè)細(xì)胞.然后分別在相對應(yīng)的細(xì)胞孔中加入等量免疫小鼠的恥垢分枝桿菌(5× 106CFU)或生理鹽水后,37℃,在體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)36 h,每孔做3個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn).

應(yīng)用EL ISA技術(shù)檢測脾細(xì)胞受到細(xì)菌刺激后產(chǎn)生的TNF-α和IFN-γ水平,具體步驟參照試劑盒說明書操作,顯色后用分光光度計(jì)(BioTek,ELx808)在490nm處讀板.

1.2.8 數(shù)據(jù)處理 用Excel自帶軟件進(jìn)行分析.根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程式以及標(biāo)本的OD490nm值,求出相應(yīng)標(biāo)本的TNF-α與IFN-γ的濃度.

2 結(jié)果

2.1 重組恥垢分枝桿菌的轉(zhuǎn)化鑒定

Rv0849從結(jié)核分枝桿菌H37Rv全基因組中成功擴(kuò)增并克隆入分枝桿菌穿梭質(zhì)粒pMV261中.重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入SM,大量培養(yǎng)后提取基因組進(jìn)行鑒定.通過生物信息學(xué)比較分析,結(jié)核分枝桿菌Rv0849基因在SM中的同源性很低,而Rv0849特異性引物可以從陽性克隆SM (0849)中擴(kuò)增出目的條帶,不能從SM(261)和SM菌中擴(kuò)增出目的條帶.另外,重組質(zhì)粒的酶切結(jié)果也證明Rv0849基因成功轉(zhuǎn)入到SM中,如圖1所示.

圖1 重組恥垢分枝桿菌SM(0849)的鑒定Fig.1 IdentificationoftherecombinantSM(SM(0849))

2.2 重組菌株最小抑菌濃度測定

如表1所示,各類藥物對SM(0849)、SM(261)和SM的MIC差異不大,在1～2倍之間.因此,過表達(dá)Rv0849的重組恥垢分枝桿菌并沒有明顯提高對所測藥物的耐受性,表明膜蛋白Rv0849在重組菌株中沒有發(fā)揮對所測藥物的外排功能.

表1 藥物對SM(0849)、SM(261)和SM的MIC測定Tab.1 TheMICofdrugsvsSM(0849),SM(261)andSM

2.3 重組恥垢分枝桿菌免疫小鼠血清IgG的分泌

圖2顯示,免疫后3周和6周,SM(0849)誘導(dǎo)的IgG水平顯著高于生理鹽水(P<0.01).免疫后3周, SM(0849)組的IgG水平顯著高于其他組(P<0.05),而隨著免疫時(shí)間延長至6周,SM以及SM(261)組的IgG水平和SM(0849)組相近(P>0.05).表明重組SM(0849)較快地誘導(dǎo)了IgG的產(chǎn)生,并可有效刺激機(jī)體維持產(chǎn)生的IgG水平,但是其誘導(dǎo)的IgG分泌水平并沒有隨時(shí)間延長而進(jìn)一步升高.圖3顯示,SM(0849)組的IgG2a/IgG1比值在3周和6周情況下都比其他組高,且呈現(xiàn)IgG2a升高的趨勢,差異極顯著(P<0.01),表明隨著重組菌株所誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答隨時(shí)間變化向Th1型轉(zhuǎn)變.

2.4 重組恥垢分枝桿菌對感染小鼠細(xì)胞免疫水平的影響

圖4和圖5顯示,與SM和SM(261)相比,SM(0849)免疫小鼠后,較強(qiáng)地刺激了脾淋巴細(xì)胞分泌TNF-α和IFN-γ,且分泌水平隨著時(shí)間的延長(從3周到6周)持續(xù)上升,數(shù)據(jù)差異極顯著(P<0.01).表明重組菌株有效誘導(dǎo)了小鼠的細(xì)胞免疫應(yīng)答.

3 討論

盡管Rv0849在結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組中定義為可能的藥物外排泵編碼基因,但本實(shí)驗(yàn)并沒有發(fā)現(xiàn)重組菌株對所測藥物耐受性的增加,提示膜蛋白Rv0849可能并不是一個(gè)外排藥物的泵蛋白,當(dāng)然這也不排除膜蛋白Rv0849在轉(zhuǎn)運(yùn)其他物質(zhì)或者其他藥物的可能性.Vipona等[7]利用DNA微陣列分析技術(shù)發(fā)現(xiàn),該蛋白在碳饑餓的條件下上調(diào)表達(dá)[7],提示Rv0849蛋白可能參與營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn).本文通過生物信息學(xué)對Rv0849基因序列與蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)Rv0849蛋白含有12個(gè)跨膜區(qū),具有較好的免疫原性,提示其具有潛在疫苗靶位的可能性.因此,將重組菌株作為抗原免疫小鼠并檢測了其引發(fā)的免疫應(yīng)答.

免疫系統(tǒng)分為細(xì)胞免疫和體液免疫,細(xì)胞免疫主要由Th1細(xì)胞介導(dǎo),體液免疫主要由Th2細(xì)胞介導(dǎo). Th1細(xì)胞主要分泌以IFN-γ為主的細(xì)胞因子,且IFN-γ可以激活單核巨噬細(xì)胞,產(chǎn)生TNF-α、IL-6和IL-1等細(xì)胞因子[8],所以IFN-γ和TNF-α的分泌水平可反映小鼠T細(xì)胞的活性,是細(xì)胞免疫的檢測指標(biāo)[9].而IgG1和IgG2a的檢測可以代表Th1/Th2平衡,是一種Th1/Th2功能的粗略檢測方法.機(jī)體中如Th1占優(yōu)勢,IgG2a將多于IgG1;如Th2占優(yōu)勢,IgG1將多于IgG2a[10].本研究結(jié)果表明,Rv0849外源抗原的引入能夠快速誘導(dǎo)免疫小鼠產(chǎn)生體液免疫,但隨著時(shí)間的增加,機(jī)體的體液水平不再持續(xù)升高;在細(xì)胞免疫水平上,重組SM(0849)能夠有效地激起免疫小鼠體內(nèi)IFN-γ和TNF-α的分泌,分泌水平明顯高于SM(261)和SM免疫組,初步驗(yàn)證了Rv0849作為免疫抗原的可行性.而IgG2a/IgG1比值的升高,可能預(yù)示著體內(nèi)免疫反應(yīng)傾向于向Th1型免疫反應(yīng)轉(zhuǎn)變.研究表明,Th1細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-γ及其刺激巨噬細(xì)胞所產(chǎn)生TNF-α殺死結(jié)核分枝桿菌起著至關(guān)重要的作用,而Th2反應(yīng)在抗結(jié)核分枝桿菌的過程中不是有利的免疫應(yīng)答方式[11].因此有必要繼續(xù)深入研究該重組菌株作為抗原在機(jī)體內(nèi)結(jié)核分枝桿菌感染免疫保護(hù)中作用.

本實(shí)驗(yàn)所用的載體為恥垢分枝桿菌,屬于無致病性快速生長的分枝桿菌屬成員,2～3 d就可長出典型粗糙型菌落,并且具有和BCG相似的免疫學(xué)特性,其用于結(jié)核的預(yù)防和治療已顯示出良好的效果[12].因此,本實(shí)驗(yàn)利用恥垢分枝桿菌作為構(gòu)建結(jié)核疫苗的基因工程載體也是發(fā)展新型抗結(jié)核疫苗的一個(gè)方向.

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Immunology Characteristics of M ycobacterium tuberculosis Membrane Protein Rv0849

HU Zhi-dong1,2,CHEN Shu-dan1,LUO Ru-song1,L IU Wei1, CAO Jian2, WANG Hong-hai1, ZHANG Xue-lian1
(1.State Key L aboratory of Genetic Engineering,Institute of Genetics,School of L ife Sciences, Fudan University,Shanghai 200433,China;2.College of B ioengineering, Henan University of Technology,Zhengzhou 450001,China)

The function of M ycobacterium tuberculosis membrane p rotein Rv0849 as a drug efflux pump and a p romising vaccine antigen target is characterized.Rv0849 gene is amp lified from M ycobacterium tubercu losis H 37Rv strain genom ic DNA and linked into shuttle p lasmid pMV 261 to construct recombinant plasmid pMV 0849,then using M ycobacterium smegm atis(SM)as a host to construct recombinant strains named SM(0849).The M ICs of recombinant strains against various drugs are analyzed and the effect of immunity response using C57BL/6 mice inoculated by SM(0849)is evaluated.The tolerance of recombinant strains SM(0849)against drugs is not increased obviously compared w ith w ild type.Moreover,it can considerably inducemice’s humoral imm unity earlier and stimulate T lymphocytes to secrete high level of tumo r necrosis facto r-α (TNF-α)and interferon-γ(IFN-γ),w hich participate in cellular immunity.The results indicate that Rv0849 has less ability as a drug efflux,butmight be a novel immune antigen target worthy of further investigation.

M ycobacterium tubercu losis;Rv0849;M ycobacterium smegm atis;TNF-α;IFN-γ

Q 939.93

A

1671-6841(2010)03-0114-05

2009-11-03

國家“863”高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃資助項(xiàng)目,編號2007AA 02Z316;國家“十一五”重大傳染病計(jì)劃資助項(xiàng)目,編號2008ZX10003006-2;國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目,編號30901828.

胡志東(1986-),男,碩士研究生,主要從事抗結(jié)核藥靶和疫苗研究,E-mail:huzhidong2008@163.com;通訊聯(lián)系人:張雪蓮(1975-),女,講師,博士,主要從事防治結(jié)核病基礎(chǔ)研究,E-mail:xuelianzhang@fudan.edu.cn.