輔酶 I誘導(dǎo) Cerasome聚集及乳酸脫氫酶對(duì)聚集的影響

王劍鋒,劉寶全,范圣第

(大連民族學(xué)院生物化學(xué)工程國(guó)家民委 -教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧大連 116605)

輔酶 I誘導(dǎo) Cerasome聚集及乳酸脫氫酶對(duì)聚集的影響

王劍鋒,劉寶全,范圣第

(大連民族學(xué)院生物化學(xué)工程國(guó)家民委 -教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧大連 116605)

用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)分別在 500 nm和 340 nm考察了由肽脂質(zhì)—溴化N,N-二 -十六烷基 -Nα-6-三乙氧基硅基己?；?-L-甘氨酰胺 ((EtO)3SiC3N+C5Ala2C16)形成的陽(yáng)離子脂質(zhì)體——Cerasome,在還原型輔酶 I(NADH)的作用下,以及在乳酸脫氫酶(LDH)和底物丙酮酸的存在下,其光密度 (吸光度)隨時(shí)間的變化。結(jié)果表明:隨著NADH濃度的增加,Cerasome懸液的光密度(吸光度)明顯增加,脂質(zhì)體產(chǎn)生了聚集,但是聚集體不能被乳酸脫氫酶重新分散;而由溴化N,N-二 -十六烷基 -Nα-6-三甲胺基己?；?-L-丙氨酰胺 (N+C5Ala2C16)形成的陽(yáng)離子脂質(zhì)體聚集體,在乳酸脫氫酶的作用下,可以被重新分散。

輔酶 I(NADH);脂質(zhì)體;乳酸脫氫酶;聚集

Cerasome是 Kiyofumi Katagiri等首先制備的含有無(wú)機(jī)硅的有機(jī) -無(wú)機(jī)雜化的脂質(zhì)體[1-4]。Cerasome由含有硅醚基團(tuán)的類脂在水溶液中經(jīng)過(guò)溶膠 -凝膠(sol-gel)過(guò)程,通過(guò)自組裝聚集形成雙層膜結(jié)構(gòu),分子中的有機(jī) -無(wú)機(jī)部分通過(guò)穩(wěn)定的 Si-C鍵連接在一起 (如圖 1),其表面具有類似硅酸鹽的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。與傳統(tǒng)的脂質(zhì)體相比,它具有更加穩(wěn)定的特性,容易保持其結(jié)構(gòu)形態(tài),相互間不易產(chǎn)生融合,而且不毒害細(xì)胞,具有血清相容性。Cerasome可作為細(xì)胞膜的模型、基因輸送的載體及構(gòu)成納米材料的組件[5-11]。

圖 1 Cerasome脂質(zhì)體的形成過(guò)程

在我們以前的研究中,曾以丙氨酸肽脂質(zhì)N+C5Ala2C16(如圖 2)所構(gòu)成的脂質(zhì)體研究了還原型輔酶 I(NADH)誘導(dǎo)的聚集以及乳酸脫氫酶的酶催化作用對(duì)聚集的影響[12]。本研究則考察由NADH誘導(dǎo)產(chǎn)生 Cerasome的聚集作用及乳酸脫氫酶對(duì)聚集的影響。

圖2 實(shí)驗(yàn)所用肽脂質(zhì)

1 材料與方法

1.1 試劑

肽脂質(zhì)—溴化N,N-二 -十六烷基 -Nα-6 -三乙氧基硅基己?；?-L-丙氨酰胺((EtO)3SiC3N+C5Gly2C16)按文獻(xiàn) [2]方法合成,溴化N,N-二 -十六烷基 -Nα-6-三甲基己?；?-L-丙氨酰胺 (N+C5Ala2C16)按文獻(xiàn)[13]方法合成,以上兩化合物均經(jīng)核磁共振表征為純品。4-羥乙基哌嗪乙磺酸 (HEPES,≥99.5%,北京夏斯生物有限公司),還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸二鈉鹽 (NADH,上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司(進(jìn)口分裝,≥99.0%)),丙酮酸鈉 (≥99.0%, Fluka試劑),L-乳酸脫氫酶 (LDH,提取自豬心肌,德國(guó)),millipore超純水。

1.2 儀器

核磁共振儀 (VarianMercury plus 400,美國(guó)), Lambda 25紫外 -可見(jiàn)分光光度計(jì) (PerkinElmer,美國(guó)),Sonifier 250D超聲儀 (BRANSON,美國(guó)),原子力顯微鏡 (D imension T M 3100,Veecoo,美國(guó)),Milli-Q超純水機(jī)(美國(guó))。

1.3 方法

1.3.1 雙層膜脂質(zhì)體的制備

(E tO)3SiC3N+C5Ala2C16或 N+C5Ala2C16溶于氯仿,在氮?dú)饬鞔祾呦率孤确聯(lián)]發(fā)制成薄膜。30℃真空干燥,徹底去除殘留氯仿,加入 HEPES緩沖液(10 mmol·L-1,pH 7.0),漩渦振蕩 5 min后,用探頭式超聲儀,30W超聲處理 5 min(脈沖間隔 1 s),得到相應(yīng)的脂質(zhì)體(0.5 mmol·L-1)溶液。

1.3.2 脂質(zhì)體的聚集/分散測(cè)定

1 cm光徑的石英比色皿中依次加入脂質(zhì)體溶液、NADH(0.15～0.70 mmol·L-1)、丙酮酸鈉(1.0 mmol·L-1)、LDH(2.24 nmol·L-1),以上濃度均為各物質(zhì)在比色皿中的濃度。用紫外 -分光光度計(jì)在 500 nm和 340 nm下分別測(cè)定吸光值隨時(shí)間的變化。

1.3.3 Cerasome聚集體的原子力顯微鏡觀察

Cerasome懸液中加入 0.4 mmol·L-1的NADH后,35℃靜止 20 min,取脂質(zhì)體懸浮液少量樣品平攤于載玻片上,在原子力顯微鏡下觀察脂質(zhì)體聚集狀態(tài)。

2 結(jié)果與討論

形成 Cerasome的肽脂質(zhì) ((EtO)3SiC3N+C5Ala2C16)(如圖 2),與曾介紹過(guò)的肽脂質(zhì) (N+C5Ala2C16)結(jié)構(gòu)上類似[12],在水溶液中的 sol-gel過(guò)程產(chǎn)生硅羥基,使 Cerasome容易形成帶有負(fù)電荷無(wú)機(jī)硅酸鹽表面,且呈現(xiàn)負(fù)電性,但是在 pH= 7.0的緩沖溶液中,Cerasome由于所具有的季銨鹽結(jié)構(gòu)使其抵消了表面的負(fù)電性,并使 Cerasome呈現(xiàn)正電性[2]。在本實(shí)驗(yàn)條件下,Cerasome懸浮液外觀澄清,沒(méi)有聚集的發(fā)生。當(dāng)向其懸液中逐步加入NAD+,直至達(dá)到 3.0 mmol·L-1時(shí),溶液外觀仍沒(méi)有明顯的變化,表明脂質(zhì)體沒(méi)有發(fā)生聚集;而當(dāng)向體系中分別加入不同濃度的NADH時(shí),吸光度隨NADH濃度的增加而增大。在紫外 -可見(jiàn)分光光度計(jì)下,觀察到光密度隨時(shí)間的變化情況(如圖3)。可以看出,當(dāng)加入NADH濃度較低的時(shí)候 (≤0.45 mmol·L-1),光密度的變化并不十分明顯,其濃度達(dá)到 0.5 mmol·L-1后,吸光度增加很快,從外觀上也可以明顯看到白色混濁的出現(xiàn),因此可以判斷產(chǎn)生了脂質(zhì)體的聚集。從所拍攝的原子力顯微鏡照片上觀察,進(jìn)一步印證了聚集的發(fā)生(如圖 4)。

圖 3 在 500 nm和 35℃下,Cerasome懸浮液中加入NADH光密度隨時(shí)間的變化

圖 4 Cerasome與 0.40 mmol·L-1的NADH形成的聚集懸浮液的原子力顯微鏡照片

對(duì)于已經(jīng)由NADH誘導(dǎo)產(chǎn)生的 Cerasome的聚集體系,加入 LDH和底物丙酮酸后,聚集體系的光密度有所降低(如圖 5),但是與N+C5Ala2C16脂質(zhì)體在相同情況下產(chǎn)生的解聚效果有明顯差距。當(dāng)用 Cerasome時(shí),產(chǎn)生的光密度差為 0.06,而用N+C5Ala2C16脂質(zhì)體時(shí),光密度差為0.16(如圖 6)。從外觀上看,前者的濁度變化不大,而后者則從白色渾濁變得澄清。

圖 5 在 500 nm和 35℃下,Cerasome懸浮液中加入NADH后產(chǎn)生聚集,而后加入LDH及底物丙酮酸后光密度隨時(shí)間的變化

圖 6 在 500 nm和 35℃下,N+C5Ala2C16脂質(zhì)體中加入NADH后產(chǎn)生聚集,而后加入LDH及底物后光密度隨時(shí)間的變化

圖 7 在 340 nm和 35℃下,Cerasome懸浮液中加入NADH后產(chǎn)生聚集,而后加入LDH及底物后吸光度隨時(shí)間的變化

NADH在 340 nm有強(qiáng)吸收 (如圖 7),而NAD+則沒(méi)有,因此可通過(guò)在 340 nm的吸光度的變化來(lái)判斷其是否被轉(zhuǎn)化消耗,從的吸光度的變化看,LDH的催化反應(yīng)消耗了NADH,使其轉(zhuǎn)化為NAD+。盡管酶使 NADH轉(zhuǎn)化為不能使 Cerasome聚集的 NAD+,但是從圖 3中已經(jīng)反映出 Cerasome沒(méi)有完全解聚,也就意味著,還有部分與Cerasome結(jié)合的NADH沒(méi)有被轉(zhuǎn)化。

從NADH的結(jié)構(gòu)上看,在兩個(gè)糖環(huán)之間含有一個(gè)焦磷酸基團(tuán),在本實(shí)驗(yàn)條件下焦磷酸基團(tuán)所帶的電荷將全部解離,含有兩個(gè)凈負(fù)電荷;而NAD+的煙酰胺基團(tuán)由于增加了一個(gè)正電荷,整個(gè)分子僅帶一個(gè)凈負(fù)電荷,因此 Cerasome與N+C5Ala2C16脂質(zhì)體都可以與NADH相作用,而與NAD+則不發(fā)生明顯作用[12]。

從形成聚集的程度上看,Cerasome相對(duì)容易,而且這種聚集體容易通過(guò)離心的辦法獲得沉淀(具體數(shù)據(jù)本文未給出),而在相同條件下, N+C5Ala2C16脂質(zhì)體獲得的聚集體則不能得到離心沉淀。這可能與 Cerasome表面形成的無(wú)機(jī)三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)有關(guān),使 Cerasome的比重相對(duì)較大。

這兩個(gè)聚集體系在酶作用下的解聚效果上存在較大差異,分析原因:從 Cerasome的結(jié)構(gòu)上看,它不僅具有正電性,可以吸引NADH,而且其無(wú)機(jī)硅酸鹽結(jié)構(gòu)的表面富含有羥基基團(tuán)和 -O-離子,因此盡管是在水溶液中,但是由于膜表面的特殊疏水作用,可使含有多個(gè)羥基的NADH與其形成氫鍵,增強(qiáng)了 Cerasome與 NADH的作用,同時(shí)Cerasome表面的無(wú)機(jī)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)使膜上肽脂質(zhì)分子的橫向移動(dòng)受到相當(dāng)?shù)募s束,這樣有利于使 Cerasome與NADH形成的復(fù)合物更加牢固。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)離子脂質(zhì)體在分別加入生物小分子物質(zhì)——氧化型輔酶 I(NAD+)和還原型輔酶 I (NADH)后,產(chǎn)生不同的聚集現(xiàn)象。其中只含有一個(gè)凈負(fù)電荷的NAD+不能使實(shí)驗(yàn)所用的脂質(zhì)體產(chǎn)生聚集;而含有兩個(gè)凈負(fù)電荷的NADH能夠產(chǎn)生聚集。Cerasome形成的聚集體與以前使用的N+C5Ala2C16脂質(zhì)體相比,前者形成的聚集相對(duì)容易,但是不容易被乳酸脫氫酶解聚,而后者形成的聚集體容易在乳酸脫氫酶的作用下重新分散開(kāi)。關(guān)于NADH等小分子物質(zhì)產(chǎn)生的脂質(zhì)體聚集的機(jī)理,目前還在做進(jìn)一步的研究。

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(責(zé)任編輯 鄒永紅)

On Aggregation of Cerasome Induced by Coenzyme Iand Effects of Lactate Dehydrogenase on Aggregation

WANG Jian-feng,L IU Bao-quan,FAN Sheng-di
(KeyLaboratory ofBiochemical Engineering of the State Ethnic Affairs Commission-Ministry of Education,College ofLife Science,Dalian NationalitiesUniversity,Dalian Liaoning,116605,China)

The over-time variation of the optical density(or absorbance)of cerasome,a cationic liposome prepared from a peptide lipid,N,N-dihexadecyl-Nα-[6-[(3-triethoxysilyl) -propyl dimethyl ammonio)hexanoyl]alaninamide bromide((EtO)3SiC3N+C5Gly2C16),under the action of a reducing coenzyme I(NADH)and in the presence of lactate dehydrogenase (LDH)and the substrate,pyruvate,was studied using the ultraviolet-visible spectrophotometer at 500 nm and 340 nm respectively.The result showed that:the aggregation of the liposome occurred as the optical density(or absorbance)of the cerasome suspension increased obviously along with the concentration ofNADH,but it couldn’t be redispersed byLDH;nonetheless,the aggregation of a cationic liposome prepared from N,N-dihexadecyl-Nα-[6-(trimethyl ammonio)hexanoyl]alaninamide bromide(N+C5Ala2C16)could be redispersed byLDH.

coenzyme I;liposome;LDH;aggregation

book=9,ebook=252

TQ464.8

A

1009-315X(2010)05-0422-04

2010-07-03

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 (20872013);遼寧省教育廳基金項(xiàng)目(2009A154)。

王劍鋒 (1968-),男,遼寧錦州人,副教授,主要從事超分子化學(xué)和化學(xué)生物學(xué)研究。