人乳鐵蛋白對細(xì)胞增殖的影響

仇志琴李志沭黃玉政楊 歡成 勇

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫市第二人民醫(yī)院,江蘇 無錫 214002)

人乳鐵蛋白對細(xì)胞增殖的影響

仇志琴1李志沭2黃玉政1楊 歡3成 勇1

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫市第二人民醫(yī)院,江蘇 無錫 214002)

目的 探討人乳鐵蛋白(hLF)對體外培養(yǎng)細(xì)胞生長特性的影響。方法 M TT法評定 hLF對人鼻咽癌細(xì)胞、中國倉鼠卵巢細(xì)胞、人肝臟細(xì)胞的生長抑制作用。結(jié)果 乳鐵蛋白對人鼻咽癌細(xì)胞系CNE的增殖有抑制作用并呈現(xiàn)劑量依賴性,對正常細(xì)胞無抑制作用。結(jié)論 hLF可能是一種效果較好的新的抗腫瘤化學(xué)劑。

人乳鐵蛋白;癌細(xì)胞;細(xì)胞增殖

人乳鐵蛋白(Hum an Lactoferrin,hLF)是主要存在于人乳清中的球蛋白,乳汁中特別是初乳中含量最高,具有廣譜抗菌、抗病毒、抗腫瘤等作用〔1,2〕。國外有學(xué)者將其應(yīng)用于腫瘤患者的治療〔3〕,但是對其作用機(jī)制的研究較少。目前國內(nèi)較少有關(guān)于hLF作用于細(xì)胞的報道,我們選用易早期轉(zhuǎn)移的鼻咽癌(NPC)細(xì)胞作為研究對象〔4〕,以中國倉鼠卵巢細(xì)胞 (CHO)、人肝臟細(xì)胞(L02)作為正常細(xì)胞對照,觀察 hLF在體外是否具有抑制癌細(xì)胞生長的作用,探討 hLF抗腫瘤的作用機(jī)制,從而為腫瘤的治療提供研究基礎(chǔ),為臨床實驗及應(yīng)用提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人鼻咽癌細(xì)胞(CNE)、中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)、人肝臟細(xì)胞(L02)均購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞資源中心。重組hLF(Lot:L0520,溶于 PBS中,儲存濃度 5mg/m l,-20℃儲存?zhèn)溆?和噻唑藍(lán)(M TT,Lot:M 2128)均購自 Sigma公司。RPM I1640、胎牛血清購自 HyC lone公司。其他試劑均為分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 各細(xì)胞系均應(yīng)用含 10%胎牛血清和 1%青鏈霉素的 RPM I1640培養(yǎng)基,5%CO2,37℃培養(yǎng)。

1.2.2 M TT法檢測細(xì)胞增殖 設(shè)空白對照組和 hLF干預(yù)組。待細(xì)胞生長至對數(shù)生長期,接種于 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,接種數(shù)為5×104/孔。每組細(xì)胞設(shè) 5個平行孔,各組細(xì)胞分別加入不同濃度的 hLF(0,1.25×10-3,2.5×10-3,5×10-3,10×10-3, 20×10-3,40×10-3g/L),每孔均為 200μl。作用 24 h后,加入M TT(5 g/L,每孔 20μl),繼續(xù)培養(yǎng) 4 h,測定A 570 nm吸光度。1.2.3 細(xì)胞形態(tài)觀察 細(xì)胞經(jīng) hLF處理后,傾去上層懸浮死細(xì)胞并用 PBS洗兩遍,加入新鮮培養(yǎng)基。同樣處理對照孔細(xì)胞,將細(xì)胞置于倒置顯微鏡下,觀察細(xì)胞形態(tài)的變化。

2 結(jié) 果

2.1 重組 hLF對鼻咽癌細(xì)胞 CNE、人肝臟細(xì)胞L02、中國倉鼠細(xì)胞CHO系的增殖能力的影響 對CNE呈現(xiàn)劑量依賴性的抑制作用,而對正常細(xì)胞無抑制作用,見表 1。

表 1 人乳鐵蛋白對各細(xì)胞體外增殖的影響(±s)

表 1 人乳鐵蛋白對各細(xì)胞體外增殖的影響(±s)

與空白對照比較:1)P<0.05

hLF劑量(g/L) CNE細(xì)胞系 L02細(xì)胞系 CHO細(xì)胞系0 2.795±0.05 1.900±0.05 2.312±0.15 1.25×10-32.488±0.10 1.810±0.10 2.229±0.05 2.5×10-32.512±0.21 1.792±0.14 2.230±0.10 5×10-32.001±0.051)1.800±0.03 2.152±0.04 10×10-31.810±0.151)1.716±0.30 2.178±0.10 20×10-31.665±0.041)1.780±0.30 2.155±0.05 40×10-31.300±0.051)1.690±0.15 2.104±0.18

2.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 顯微鏡鏡下可見,空白對照組癌細(xì)胞密集成片生長,如鋪路卵石狀,細(xì)胞膜圓潤,透明,顆粒較少,細(xì)胞間界限清楚,并可隱約見到細(xì)胞核。hLF處理組癌細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯的改變,隨 hLF濃度增加,細(xì)胞從正常的增殖旺盛的貼壁生長,逐漸表現(xiàn)為生長緩慢,黏附力降低,細(xì)胞變圓,細(xì)胞胞質(zhì)粗糙,細(xì)胞內(nèi)顆粒逐漸增多,且透明度降低,立體感較差,細(xì)胞形態(tài)完整性受損,而正常細(xì)胞在hLF作用下無顯著變化 (見圖 1)。

圖1 細(xì)胞鏡檢圖

3 討 論

hLF多種生物學(xué)功能通過免疫系統(tǒng)的激活與調(diào)節(jié)得以實現(xiàn)〔5〕。Bezaul〔6〕研究發(fā)現(xiàn),乳鐵蛋白能抑制鼠實體瘤的生長和轉(zhuǎn)移。腫瘤內(nèi)注射LF,可以明顯的減小實體瘤的體積,且作用效果與 LF干預(yù)天數(shù)相關(guān)。研究〔7,8〕發(fā)現(xiàn),乳鐵蛋白的抗頭頸部腫瘤作用是通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖實現(xiàn)的。W o lf〔3〕等發(fā)現(xiàn),人乳鐵蛋白通過阻斷頭頸部腫瘤細(xì)胞由 G0到 G1期的轉(zhuǎn)化來抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。人乳鐵蛋白對鼠的 SCC細(xì)胞系生長的抑制作用,與劑量成正相關(guān);而且人乳鐵蛋白抑制頭頸部細(xì)胞癌的作用是通過直接的細(xì)胞毒作用及系統(tǒng)性的免疫調(diào)節(jié)作用實現(xiàn)的。Varadhachary〔9〕等人做了大量的口服臨床試驗,證實乳鐵蛋白無藥物相關(guān)的有害作用。鼻咽癌作為頭頸部腫瘤之一,其惡性程度較高〔4〕,早期即可出現(xiàn)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,臨床上有轉(zhuǎn)移至骨盆、肺、肝等多器官的病例〔10〕。選用鼻咽癌細(xì)胞作為研究對象,具有一定的代表意義。

本研究結(jié)果顯示,人乳鐵蛋白可以抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖,且呈劑量依賴性,對正常細(xì)胞的增殖無明顯抑制作用。這一結(jié)果,為開發(fā)乳鐵蛋白的抗癌功效提供了理論依據(jù)。

1 曹勁松 .初乳功能性食品〔M〕.北京:中國輕工業(yè)出版社,2000:1-10.

2 黃玉政,成 勇,柏亞軍,等 .人乳鐵蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠雜交選育的研究〔J〕.動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2007;28(6):39-43.

3 W olf JS,L i GY,Varadhachary A,et a l.O ral lactoferrin results in T cell dependent tumor inhibition of head and neck squamous cell carcinoma in vivo〔J〕.C lin Cancer Res,2007;13(5):1601-10.

4 張本華 .臨床腫瘤學(xué)〔M〕.北京:科學(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社,2007:30-40.

5 CumberbatchM,Dearman RJ,U ribe-Luna S,et a l.Regulation of ep iderm alLangerhans cellm igration by lactoferrin〔J〕.Immunology,2000;100 (1):21-8.

6 Bezault J,Bhimani R,W ipm vnick J,et a l.Human lactoferrin inhibits grow th of solid tumors and development of experim entalmetastases in m ice〔J〕.CancerRes,1994;54(9):2310-2.

7 X iao Y,M onitto CL,M inhas KM,et a l.Lac toferrin dow n regu lates G1 cyclin-dependen t kinasesduring grow th arrestof head and neck cancer cells〔J〕.Clin Cancer Res,2004;10(23):8683-6.

8 Dam iens E,Elyazid i I,M azu rier J,eta l.Lactoferrin inhibitsG1 cyclin-dependent kinases du ring grow th arrest of hum an breast carcinom a〔J〕.J CellB iochem,1999;74(3):486-98.

9 Varadhachary A,W o lf JS,Petrak K,et a l.O ral lactoferrin inhibits grow th of estab lished tumo rsand poten tiatesconventionalchemotherapy〔J〕.Int J Cancer,2004;111(3):398-403.

10 蘇沛珠,黃 泳 .鼻咽癌轉(zhuǎn)移相關(guān)分子標(biāo)志物的研究進(jìn)展〔J〕.中國現(xiàn)代醫(yī)生,2009;47(3):50-2.

〔2009-02-16收稿 2009-10-30修回〕

(編輯 賈春澍/張 慧)

Study on inh ib ition of lactoferr in on prolifera tion of cells in v itro

Q IU Zh i-Q in,L IZh i-Shu,HUANG Y u-Zheng,et a l.

The Second Hosp ita l ofW ux i,A ffilia ted to Nan jingM ed ica l Un iversity,W ux i214002,Jiangsu,Ch ina

O b jective To exp lore the effectof lactoferrin on p ro liferation of the cu ltured cells in vitro.M ethods M TT assaywas used to evaluate the grow th inhibition effectof lactoferrin on CNE,L02 and CHO cell lines.Resu lts Lactoferrin significantly inhibited the p ro liferation of CNE cells in a dose-dependentm anner,but had no effect on the norm al cells.Conc lusion s Lactoferrin as a new cancer chemo-p reventive agent cou ld significantly inhibit the grow th of carcinom a cells.

Hum an lactoferrin;Carcinom a cells;Cellp ro liferation

book=30,ebook=24

R-331

A

1005-9202(2010)04-0504-02

江蘇省 135重點實驗室開放課題(W K0511);江蘇省衛(wèi)生廳科研項目(X2007036)

1 揚(yáng)州大學(xué)江蘇省轉(zhuǎn)基因制藥工程研究中心

2 江蘇省沭陽人民醫(yī)院 3 蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院

成 勇(1956-),男,教授,博士生導(dǎo)師,主要從事胚胎工程與轉(zhuǎn)基因研究。

黃玉政(1982-),男,碩士,助理研究員,主要從事胚胎工程與轉(zhuǎn)基因研究。

仇志琴(1982-),女,住院醫(yī)師,主要從事臨床婦產(chǎn)醫(yī)學(xué)與生殖醫(yī)學(xué)等工作。