pTAT-X IAP重組表達(dá)載體的構(gòu)建與酶切鑒定

蔣常文 夏春波 徐雅娟陽(yáng)秋娣劉源劼 周 思

(桂林醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室,廣西 桂林 541004)

pTAT-X IAP重組表達(dá)載體的構(gòu)建與酶切鑒定

蔣常文 夏春波 徐雅娟1陽(yáng)秋娣2劉源劼 周 思

(桂林醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室,廣西 桂林 541004)

目的 探索p TAT-X IAP融合表達(dá)載體的構(gòu)建方法。方法 在體外合成大鼠 X IAP基因,將其插入pTAT-HA質(zhì)粒,構(gòu)建 pTAT-HA/ X IAP融合表達(dá)載體,將 pTAT-HA/X IAP質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至DH 5α感受態(tài)細(xì)胞,篩選培養(yǎng)轉(zhuǎn)化成功的單克隆,N co I/Xho I雙酶切后瓊脂糖電泳鑒定。結(jié)果轉(zhuǎn)化pTAT-HA/X IAP質(zhì)粒的DH5α在含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上呈分散菌落生長(zhǎng)。電泳結(jié)果顯示重組pTAT-HA/X IAP質(zhì)粒約4 500 bp,酶切后可觀察到 PTAT-HA質(zhì)粒約 3 000 bp,X IAP目的基因條帶 1 494 bp,pTAT空質(zhì)粒約3 000 bp,條帶大小與質(zhì)粒圖譜一致。結(jié)論 將大鼠 X IAP基因成功插入pTAT-HA質(zhì)粒,構(gòu)建pTAT-X IAP融合蛋白表達(dá)載體,提取的質(zhì)?？捎糜谙掠畏肿由飳W(xué)實(shí)驗(yàn)。

TAT;X IAP;融合蛋白;原核表達(dá)載體

近年的研究表明老年性癡呆等神經(jīng)退行性疾病與氧化應(yīng)激損傷和細(xì)胞凋亡有關(guān)〔1〕。X連鎖凋亡抑制蛋白 (X IAP)是重要的抑制凋亡蛋白,具有明顯的抗凋亡作用,在惡性腫瘤中高表達(dá)〔2〕。X IAP已成為抗凋亡和腫瘤治療的新靶點(diǎn),有較大的研究潛能和應(yīng)用價(jià)值 。然而,X IAP是分子量大,不易通過(guò)血腦屏障,使其進(jìn)一步研究和臨床應(yīng)用受到極大限制。最近發(fā)現(xiàn)的人類(lèi)免疫缺陷病毒-反式轉(zhuǎn)錄激活因子 (TAT)蛋白的轉(zhuǎn)導(dǎo)域 (PTD)是TAT蛋白的堿性氨基酸區(qū),是轉(zhuǎn)導(dǎo)功能較強(qiáng)與 TAT連接構(gòu)成融合蛋白,在體內(nèi)、外已成功將膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子等生物大分子導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)或通過(guò)血腦屏障至腦內(nèi)〔3〕。本實(shí)驗(yàn)用分子克隆方法,將大鼠X IAP基因克隆至 pTAT-HA質(zhì)粒載體,構(gòu)建了pTAT-HA/X IAP融合蛋白表達(dá)載體,為T(mén)AT-X IAP融合蛋白表達(dá)和下游分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 pTAT-HA質(zhì)粒由美國(guó) Steven FDow dy惠贈(zèng),DH 5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自 TIANGEN公司,B iosp in質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒購(gòu)自B IOER公司,Cat#BSC01M 1,T4DNA連接酶、N co I和Xho I限制性?xún)?nèi)切酶購(gòu)自 Prom ega公司,胰蛋白胨,酵母提取物,瓊脂粉購(gòu)自 Sigm a公司。氨芐青霉素購(gòu)自上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠X IAP基因的合成 根據(jù)大鼠 X IAP的 cDNA序列,按照大腸桿菌的偏愛(ài)密碼子進(jìn)行優(yōu)化,合成基因序列,兩端分別帶有Nco I和 Xho I酶切位點(diǎn)。

1.2.2 pTAT-X IAP融合蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建 用 N co I和Xho I酶對(duì) pTAT-HA質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切,將 X IAP基因插入 Nco I和 Xho I酶切位點(diǎn)之間,構(gòu)建 pTAT-HA/X IAP融合蛋白表達(dá)載體。取 100m lDH5α感受態(tài)細(xì)胞于冰水浴,向感受態(tài)細(xì)胞中加入10μlpTAT-X IAP質(zhì)粒DNA,冰浴靜置30m in,將離心管置于42℃水浴 90 s,冰浴冷卻 2～3m in,向離心管中加入 900μlLB液體培養(yǎng)基 (不含抗生素),37℃搖床震蕩培養(yǎng) 45 m in。取100μl轉(zhuǎn)化菌液涂到 LB固體培養(yǎng)基 (含氨芐青霉素),37℃培養(yǎng) 12～16 h。未轉(zhuǎn)化菌和轉(zhuǎn)化 pTAT空載體的菌珠作為對(duì)照。

1.2.3 pTAT-X IAP質(zhì)粒擴(kuò)增及鑒定 取 pTAT-HA/X IAP質(zhì)粒或 PTAT-HA質(zhì)粒單個(gè)轉(zhuǎn)化菌落接種至LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)夜培養(yǎng)。質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。提取的 pTAT-HA/X IAP質(zhì)粒經(jīng)Nco I和 Xho I雙酶切,1%瓊脂糖凝膠電泳觀察。質(zhì)粒于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2 結(jié) 果

2.1 DH 5α在LB固體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況 培養(yǎng)結(jié)果顯示, pTAT-X IAP質(zhì)粒或 pTAT-HA質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌液在含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上呈分散菌落生長(zhǎng),在無(wú)氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上成片生長(zhǎng),未經(jīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的DH5α感受態(tài)細(xì)胞在含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上未見(jiàn)菌落生長(zhǎng)。

2.2 p TAT-HA質(zhì)粒電泳結(jié)果 p TAT-HA/X IAP質(zhì)粒經(jīng)N co I和 Xho I雙酶切后,電泳結(jié)果顯示重組 pTAT-HA/X IAP質(zhì)粒約4 500 bp,酶切后可觀察到 PTAT-HA質(zhì)粒約 3 000 bp,X IAP目的基因條帶 1 494 bp(不含酶切位點(diǎn)),見(jiàn)圖 1。

圖1 pTAT-X IAP質(zhì)粒電泳結(jié)果

3 討 論

X IAP是凋亡抑制蛋白 (IAP)家族中最有效的半胱天冬酶 (caspase)抑制物,通過(guò)結(jié)合與抑制 caspase-9、-3、-7及減少細(xì)胞色素養(yǎng) C的釋放而阻止細(xì)胞凋亡。最近的研究表明X IAP除了抑制 caspase外,還可通過(guò)上調(diào)線粒體產(chǎn)生抗氧化劑,減輕缺血 /缺氧等造成的氧化應(yīng)激損傷〔4,5〕,以腺病毒介導(dǎo)βTC-Tet細(xì)胞過(guò)表達(dá) X IAP可抑制缺氧/復(fù)氧、腫瘤壞死因子誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,促進(jìn)細(xì)胞的存活;將表達(dá) X IAP的βTCTet細(xì)胞移植至鏈脲霉素誘導(dǎo)的糖尿病動(dòng)物模型的皮下,觀察到 X IAP轉(zhuǎn)染的β細(xì)胞與對(duì)照組相比可存活較長(zhǎng)時(shí)間,對(duì)糖尿病動(dòng)物模型有治療作用〔6〕。Cooper等經(jīng)圓窗將腺相關(guān)病毒介導(dǎo) X IAP表達(dá)質(zhì)粒注入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物耳蝸,可明顯抑制順鉑所致的耳蝸外毛細(xì)胞凋亡〔7〕。Eberhard t等將表達(dá) X IAP的腺病毒載體注入帕金森病小鼠動(dòng)物模型的紋狀體,結(jié)果證明 X IAP對(duì)M PTP誘導(dǎo)的黑質(zhì)神經(jīng)元損傷有保護(hù)作用〔8〕。神經(jīng)退行性疾病與細(xì)胞凋亡密切相關(guān),X IAP強(qiáng)大的抗凋亡作用,有望成為治療神經(jīng)退形性疾病、腦缺血等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的新藥。TAT蛋白的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域 (PTD)是轉(zhuǎn)導(dǎo)功能較強(qiáng)而確切的一種PTD,以 TAT-PTD連接的融合蛋白在體內(nèi)、外已成功將膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子、Bcl-X1等生物大分子轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)或跨越血腦屏障至腦內(nèi),蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)是一種很有前途的技術(shù),在基礎(chǔ)研究和臨床治療方面都有著非常廣泛的應(yīng)用前景〔3,9〕。因此,將 X IAP與 TAT轉(zhuǎn)導(dǎo)域連接構(gòu)建融合蛋白表達(dá)載體,必將為抗凋亡治療開(kāi)辟一條新途徑。

大腸桿菌DH 5α菌株經(jīng)特殊工藝處理后得到DH5α感受態(tài)細(xì)胞,菌細(xì)胞在低溫和低滲溶液中,菌細(xì)胞壁通透性增加,菌體膨脹成球形,此時(shí)轉(zhuǎn)化液中的DNA形成抗DNA酶的羥基-鈣磷酸復(fù)合物,黏附于細(xì)胞表面,經(jīng)短暫的熱休克后容易進(jìn)入菌體細(xì)胞中〔10〕。熱休克溫度是決定轉(zhuǎn)化成敗及轉(zhuǎn)化效率高低的關(guān)鍵因素,溫度過(guò)低轉(zhuǎn)化效果不理想,過(guò)高使大腸桿菌細(xì)胞壁的通透性過(guò)強(qiáng),易導(dǎo)致質(zhì)粒的丟失,所以應(yīng)選擇42℃作為最佳熱休克溫度〔11〕。有報(bào)道〔12〕,轉(zhuǎn)化時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響顯著,在 15～60m in之間,隨著轉(zhuǎn)化時(shí)間的延長(zhǎng),轉(zhuǎn)化率提高,而超過(guò)60m in,轉(zhuǎn)化率則無(wú)進(jìn)一步的提高。本實(shí)驗(yàn)采用冰浴30m in,42℃熱休克作用 90 s,冰浴冷卻 2～3m in, 37℃孵育 45m in可獲得較高的轉(zhuǎn)化效果。pTAT-X IAP質(zhì)粒中有抗氨芐青霉素基因,故含 pTAT-X IAP質(zhì)粒的 DH5α (轉(zhuǎn)化子)能在氨芐青霉素 +LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng),其余不能存活。而未經(jīng)轉(zhuǎn)化的DH5α在氨芐青霉素 +LB培養(yǎng)基中不能生長(zhǎng),說(shuō)明在氨芐青霉素 +LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的 DH 5α是由外源基因(即 pTAT-HA/X IAP質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化成功發(fā)揮了作用。在提取pTAT-HA/TAT質(zhì)粒進(jìn)行鑒定時(shí),需注意提取的菌細(xì)胞不宜過(guò)多,否則會(huì)影響質(zhì)粒的質(zhì)量。加入菌體裂解液后不宜劇烈振動(dòng)、作用時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng),以防止基因組DNA被剪切,出現(xiàn)非特異性條帶,影響鑒定。

本實(shí)驗(yàn)將體外合成的 X IAP基因插入 pTAT-HA質(zhì)粒,成功構(gòu)建了 pTAT-HA/TAT融合蛋白表達(dá)載體,為 TAT-X IAP融合蛋白的表達(dá)和下游分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。

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〔2009-01-13收稿 2009-07-20修回〕

(編輯 賈春澍/張 慧)

book=1110,ebook=56

Q78

A

1005-9202(2010)08-1110-03

1 桂林醫(yī)學(xué)院病原學(xué)與免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室 2 桂林市衛(wèi)校解剖教研室

蔣常文(1953-),男,教授,醫(yī)學(xué)博士,碩士生導(dǎo)師,主要從事神經(jīng)生物學(xué)研究。