菟絲子黃酮對慢性肝損傷保護作用的研究

宋 敏，于季軍，楊丹彤，孟景會

（1.河南大學生命科學學院，河南 開封 475004；2.開封市第二人民醫(yī)院，河南 開封 475002；3.山東省優(yōu)生技術(shù)重點實驗室，山東 濟南 250002；4.廣東嘉應制藥股份有限公司，廣東 梅州 514021）

菟絲子為旋花科一年生寄生性蔓草菟絲子（Cuscu ta ch inensis L am.）或大菟絲子（C.j ap on ica Choisy）的成熟種子，具有補陽益陰、固精縮尿、明目止瀉的功效[1]。黃酮類物質(zhì)是菟絲子的主要活性成分，其中以槲皮素和山萘酚為代表[2]，在免疫、心血管方面有顯著作用，在抗氧化、抗衰老方面也有一定作用，有試驗報道菟絲子還具有促進皮膚細胞分化的功能[3]。菟絲子醇提水溶液皮下注射小白鼠半數(shù)致死量為2.465 g/kg，30～40 g/kg灌胃并不出現(xiàn)中毒癥狀，是一味溫而不燥、補而不滯、平補肝腎的良藥。但目前菟絲子的保肝功能研究較少，僅見宋敏報道[4]。筆者通過腹腔注射10%四氯化碳/橄欖油建立小鼠慢性肝損傷模型并對模型動物灌服菟絲子黃酮來探討菟絲子黃酮對小鼠慢性肝損傷的保護作用。以期為利用菟絲子植物資源作為保肝藥物的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物 昆明種小白鼠，購自鄭州大學醫(yī)學院動物試驗中心，體重18～22 g，雄性。

1.1.2 試劑及藥品 菟絲子（Semen cuscutae flavonoids） 購自開封市中醫(yī)院；ALT、AST、SOD、MDA、GSH檢測試劑盒、蘇木精、伊紅染液（南京建成生物工程研究所）；蘆丁（中國藥品生物制品鑒定所）；四氯化碳、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、石油醚、95%乙醇、無水乙醇、二甲苯、甲醇、橄欖油等藥品均為分析純（河南大學設備科）。

1.1.3 儀器設備 721分光光度計、高速臺式離心機、電子分析天平、電熱恒溫水浴鍋、索氏提取器。

1.2 試驗方法

1.2.1 藥品制備 取菟絲子干燥種子，粉碎。石油醚去脂，用8倍體積95%乙醇90℃提取6 h?；厥找掖迹ㄈ?。以燥至恒重的蘆丁為標準品，500 nm處測定吸收度，作標準曲線。測定提取液中菟絲子黃酮濃度。經(jīng)測定，菟絲子干燥種子黃酮含量為1%，將樣品制成終濃度5.5 mg/mL以備后用。

1.2.2 動物處理 將45只小鼠隨機分成3組，每組15只。對照組：自由飲水取食；模型組：腹腔注射10%CCl4/橄欖油10 mL/kg、每周2次、自由飲水取食；藥劑組：腹腔注射10%CCl4/橄欖油10 mL/kg、每周2次、自由飲水取食，按10 mL/kg體重灌服5.5 mg/mL菟絲子黃酮。試驗期間喂正常顆粒飼料，不限食量。連續(xù)4周后停止給藥。

1.2.3 樣品處理及生化指標的檢測 最后一次注射藥物后3組動物禁食，正常飲水，16 h后，眼球采血，采血后立即將裝有血樣的試管放入37℃恒溫箱中靜置3 h，1 500 r/min分離心15 min，分離血清，血清分裝貯存于4℃冰箱中待分析，測定方法按照試劑盒說明書進行。肝臟組織用10%甲醛固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，常規(guī)石蠟包埋、切片，HE染色，光學樹脂封片，光鏡下觀察肝臟組織病理學改變。

2 結(jié)果與分析

2.1 各組小鼠生長發(fā)育情況

試驗過程中，對照組小鼠精神狀態(tài)好，毛發(fā)有光澤，食欲佳，排便正常。菟絲子水煎劑組、菟絲子大劑量黃酮組、菟絲子小量黃酮組及模型組在試驗初期外觀相似，毛發(fā)無光澤，食欲差，體重增長緩慢，多數(shù)小鼠出現(xiàn)腹瀉。但隨著治療時間的延長，黃酮組小鼠狀態(tài)逐漸好轉(zhuǎn)。解剖學觀察，空白組小鼠肝臟表面無脂肪附著。本試驗選取肝體比作為測定指標，即（全肝濕重/體重）×100。正常時各肝臟與體重的比值比較恒定。動物染毒后，受損肝臟重量可以發(fā)生改變，故肝體比也隨之而改變。肝體比增大，表示臟器充血、水腫或增生肥大等；肝體比減小，表示臟器萎縮及其他退行性改變。經(jīng)t檢驗分析表明，模型組小鼠的肝體比明顯高于對照組（p<0.01），肝臟表面附著脂肪。菟絲子黃酮組小鼠肝體比較模型組降低顯著（p<0.01），肝臟表面附著少量脂肪但未見點狀壞死。

表1 小鼠的肝體比

2.2 各組小鼠ALT、AST檢測結(jié)果

各組小鼠AST、ALT檢測結(jié)果顯示：與對照組相比，模型組小鼠AST、ALT水平明顯升高，經(jīng)t檢驗分析表明兩者差異極顯著（p<0.01），菟絲子黃酮藥劑組能夠降低血清AST、ALT水平，效果顯著（p<0.01）。

表2 小鼠的ALT及AST的活性

2.3 各組小鼠SOD、MDA、GSH檢測結(jié)果

各組小鼠SOD、MDA、GSH檢測結(jié)果顯示：與對照組相比，模型組小鼠SOD、GSH水平明顯降低，經(jīng)t檢驗分析表明兩者差異極顯著（p<0.01），MDA水平明顯升高（p<0.01）。菟絲子黃酮藥劑組能夠提高SOD、GSH水平，降低MDA水平，效果顯著（p<0.01）。

表3 小鼠的SOD、MDA、GSH的活性

2.4 肝臟的病理學檢測

對照組小鼠肝臟被膜光滑，呈紅褐色，質(zhì)地均勻。模型組小鼠肝臟被膜不光滑并有少量脂肪附著，肝臟顏色較對照組小鼠暗淡，質(zhì)地較硬。菟絲子黃酮藥劑組肝臟顏色較對照組小鼠暗淡，但顏色明顯比模型組深，質(zhì)地較硬。顯微結(jié)構(gòu)顯示，空白組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細胞索以中央靜脈為中心呈放射狀排列、肝竇結(jié)構(gòu)規(guī)整，肝細胞核圓形，胞質(zhì)紅染，肝細胞無變性、壞死、炎癥細胞浸潤及纖維增生。模型組多數(shù)肝小葉正常結(jié)構(gòu)被破壞，肝細胞變性壞死明顯，表現(xiàn)為脂肪變性和細胞水腫，胞漿疏松化、核深染，伴有點狀、灶狀程度不等、范圍不一的肝細胞壞死及炎癥細胞浸潤，匯管區(qū)擴大，有粗細不均的纖維束從匯管區(qū)伸出，纖維增生。菟絲子黃酮藥劑組肝小葉結(jié)構(gòu)模糊，少數(shù)肝細胞壞死，肝小葉中央?yún)^(qū)及部分門管區(qū)可見輕度脂肪變性，炎性細胞浸潤和肝纖維化程度有不同程度的減輕。這說明菟絲子黃酮藥劑組有明顯的保肝作用。

3 討論

CCl4是經(jīng)典的藥物性肝損害造模藥物，CCl4進入機體，在肝臟經(jīng)微粒體細胞色素P-450激活后，產(chǎn)生活潑的三氯甲基自由基（CCl3·），三氯甲基自由基可攻擊細胞膜上的磷脂分子，引起脂質(zhì)過氧化反應，最終導致生物膜破壞，肝細胞壞死[5-6]。由于肝細胞壞死，細胞膜通透性增加，ALT、AST大量滲入血液使血中酶活增高[7]。所以血清中ALT、AST這兩種轉(zhuǎn)氨酶活性的增高在一定程度上反映了肝細胞損害和壞死的程度。

SOD是細胞內(nèi)天然的氧自由基清除劑，而MDA則是氧自由基與細胞表面不飽和脂肪酸反應（脂質(zhì)過氧化反應）的產(chǎn)物[8]。SOD活力的高低間接反映了機體清除氧自由基的能力，而MDA的高低又間接反映了機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度。小鼠腹腔注射CCl4導致慢性肝損傷，過量的氧自由基產(chǎn)生于肝細胞并對其損傷，會引起SOD水平的降低和MDA水平的升高。

谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）是機體內(nèi)廣泛存在的一種重要的催化過氧化氫分解的酶。它特異的催化GSH對過氧化氫的還原反應，可以起到保護細胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整的作用。小鼠腹腔注射CCl4導致慢性肝損傷，細胞膜表面發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應，最終導致細胞膜破壞，會引起GSH水平的降低。

本試驗結(jié)果顯示，菟絲子黃酮能夠降低血清中ALT、AST、MDA水平，提高血清中SOD、全血中GSH水平，即能夠有效地保護肝細胞，使肝細胞損傷程度降低，減少纖維化。其作用機制可能是通過清除氧自由基、抑制脂質(zhì)過氧化、穩(wěn)定肝細胞膜而達到的。

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