HPLC法檢測藥用白花泡桐熊果酸及木犀草素的含量

李 科，吾魯木汗·那孜爾別克，陳功錫，姚福成，恩特馬克·布拉提白

(1.吉首大學(xué)生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，湖南 吉首 416000；2.湘西宏成制藥有限責(zé)任公司，湖南 吉首 416000）

泡桐屬植物（Paulownia）有毛泡桐（P.tomentosa），蘭考泡桐（P.elongata），楸葉泡桐（P.catapifolia），白花泡桐（P.fortunei），臺灣泡桐（P.kawakamii），川泡桐（P.fargesii）和南方泡桐（P.australis）等 7個種。除東北北部，內(nèi)蒙古，新疆北部，西藏等地區(qū)外，泡桐在全國均有分布，是我國重要的速生用材樹種之一。趙留振用泡桐的葉、花、皮和根有效地治療人體凍瘡、下肢潰瘍、風(fēng)鶴膝風(fēng)、蜂螫傷、骨折和肩炎等外科常見病，暗示了泡桐的葉、花、皮和根等組織器官可能含有具有治療作用的次生代謝產(chǎn)物[1]。李曉強(qiáng)等采用硅膠色譜層析柱和波譜分析從白花泡桐葉中分離鑒定出洋芹素（Ⅰ）、木犀草素（Ⅱ）、橙皮素（Ⅲ）、柚皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷（Ⅳ）、熊果苷（Ⅴ）、4-羥芐基-β-D-葡萄糖苷（Ⅵ）、落葉酸（Ⅶ）、1-乙酰基-2-(3′2羥基)十八烷酸甘油酯（Ⅷ）等8種新的化合物[2]。張培芬、李沖用硅膠柱色譜和聚酰胺柱色譜從白花泡桐花中分離純化次生代謝產(chǎn)物，經(jīng)波譜分析鑒定出11種黃酮類化合物[3]。陳保紅和李寅超以卵蛋白致敏的引喘小鼠為動物模型，觀察泡桐花精油對小鼠哮喘氣道炎癥的抗炎作用，結(jié)果表明，泡桐花精油對哮喘鼠氣道過敏性炎癥具有較好的抗炎作用[4]。Kassi等用MTT法、流式細(xì)胞術(shù)和蛋白印跡等方法檢測熊果酸對細(xì)胞活性和細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果表明，熊果酸顯著地抑制了PC-3和LNCaP等癌細(xì)胞的增殖，并導(dǎo)致了PC-3和LNCaP等癌細(xì)胞的凋亡[5]。Kim等用ELISA、RT-PCR和電泳運動轉(zhuǎn)移等技術(shù)檢測金銀花木犀草素對人結(jié)腸上皮細(xì)胞HT29合成IL-8的作用，結(jié)果表明，木犀草素通過封鎖結(jié)腸上皮細(xì)胞有絲分裂原激活蛋白激酶的磷酸化、降解I-κB和活化NF-κB等途徑抑制腸上皮細(xì)胞分泌IL-8的作用[6]。湖南湘西宏成制藥有限責(zé)任公司以白花泡桐葉為原料研發(fā)“復(fù)方桐葉燒傷油”，其國藥準(zhǔn)字為Z20063825，臨床試驗結(jié)果證實，該藥物對燒燙傷具有很好的效果。上述國內(nèi)外研究結(jié)果表明，白花泡桐的葉、皮、根、花等組織器官含有熊果酸、木犀草素等多種生物活性的次生代謝產(chǎn)物，可制成抗癌、抗菌和抗感染的藥品。目前，國內(nèi)外有關(guān)湖南湘西白花泡桐葉中熊果酸和木犀草素含量比較的報道尚未出現(xiàn)。本文采用高效液相色譜法，對湖南湘西宏成制藥有限責(zé)任公司4個中藥種子繁殖基地白花泡桐葉中熊果酸及木犀草素含量進(jìn)行測定，以期為白花泡桐藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器與材料

島津系統(tǒng)高效液相色譜儀：包括SPD-20A檢測器，LC-20AT雙泵；Metiler Toledo AG285型電子天平；150 mL索氏提取器；步琪R-210型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

熊果酸、木犀草素標(biāo)準(zhǔn)品（含量>98%）購自貴州迪大科技有限責(zé)任公司；甲醇為色譜純，購自天津恒興公司；乙醚、石油醚、乙酸均為分析純。檢測樣品取自湘西宏成制藥公司4處原料基地，對照樣品采自吉首大學(xué)新校區(qū)，所有樣品經(jīng)吉首大學(xué)生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院張代貴老師通過形態(tài)學(xué)鑒定為白花泡桐。

1.2 試驗方法

1.2.1 熊果酸色譜條件 按照Chen等報道的方法[7]對熊果酸色譜條件進(jìn)行檢測。色譜柱：Shim-Pack C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動相：甲醇-水-乙酸（85∶15∶0.5）；檢測波長：210 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；理論板數(shù)不低于 6 000。

在上述條件下，將熊果酸對照品和白花泡桐樣品分別進(jìn)行測定，色譜圖見圖1－A和圖1－B。

圖1 熊果酸對照品和白花泡桐樣品的高效液相色譜儀圖譜

1.2.2 木犀草素色譜條件 參照邸多隆等的方法[10]對木犀草素色譜條件進(jìn)行檢測。色譜柱：Shim-Pack C18柱（4.6 mm×150mm，5 μm）；流動相：甲醇-水-乙酸（55∶44∶1）；檢測波長：350 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；理論板數(shù)不低于 6 000。

在上述條件下，將木犀草素對照品和白花泡桐樣品分別進(jìn)行測定，色譜圖見圖2－A和圖2－B。

圖2 木犀草素對照品和白花泡桐樣品的高效液相色譜儀圖譜

1.2.3 對照品溶液的制備 取熊果酸對照品10 mg，置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，制成1 mg/mL的熊果酸對照溶液。取木犀草素對照品10 mg，置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，制成1 mg/mL的木犀草素對照品存儲液，再用甲醇稀釋10倍，制成0.1 mg/mL的對照品溶液，備用。

1.2.4 供試品溶液的制備 參照黃麗霞等的方法[8]制備熊果酸樣品。取白花泡桐葉片細(xì)粉約0.5 g，精密稱定，置于索氏提取器中，加乙醚適量，連續(xù)回流提取6 h，濾液揮干溶劑，殘渣用石油醚（30～60℃）浸泡2次，每次20 mL，浸泡約2 min，傾去石油醚液，殘渣加甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶，搖勻，定容，用0.45μm微孔濾膜過濾，取繼濾液作為供試溶液。

參照邸多隆等的方法[9]制備木犀草素樣品。取白花泡桐葉細(xì)粉約0.5 g，精密稱定，加50 mL甲醇，超聲波提取（功率240 W，頻率 50 kHz）1.5 h，濾液揮干溶劑，殘渣用石油醚（30～60℃）洗4次，每次10 mL，傾去石油醚，殘渣加甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶，搖勻，定容，用0.45μm微孔濾膜過濾，取繼濾液作為供試溶液。

2 結(jié)果分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

分別吸取 1、3、5、10、15 μL 的熊果酸對照品溶液，按已定色譜條件進(jìn)樣，測峰面積積分值。以對照品的進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，熊果酸濃度在1～15 μg的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為Y=0.020 6 X-0.466 6，R=0.999 0。

分別吸取 1、3、5、7、10 μL 的木犀草素對照品溶液，按已定色譜條件進(jìn)樣，測峰面積積分值。以對照品的進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，木犀草素濃度在0.1～1μg的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程Y=0.020 1 X+0.002 0，R=0.999 0。

2.2 精密度測試

分別取對照品，按照已定的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次，測得熊果酸、木犀草素峰面積RSD值分別為0.84%、0.92%，表明儀器性能良好。

2.3 重復(fù)性試驗

取同一樣品組的待測樣品，平行制備5份，按照已定的色譜條件進(jìn)樣，分別測定峰面積，測得熊果酸、木犀草素的峰面積RSD值分別為1.69%、1.61%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4 穩(wěn)定性試驗

取同 1 份供試品溶液，在 0、2、4、8、12、24 h 分別進(jìn)樣，每次進(jìn)樣10 mL，測得熊果酸、木犀草素的峰面積RSD值分別為1.85%、1.73%。這表明供試溶液在24 h穩(wěn)定性良好。

2.5 回收率試驗

精密稱取已知含量的一組樣品各0.25 g，共5份，分別精密加入相應(yīng)含量的對照品，按1.2.4的方法制備供試品溶液，根據(jù)已定色譜條件進(jìn)行測定。結(jié)果表明，熊果酸、木犀草素的平均回收率分別為96.1%、96.5%，RSD值分別為1.47%和1.65%。

2.6 樣品含量測定

不同產(chǎn)地的樣品按照1.2.4的方法制備供試品溶液，分別平行三次取樣，根據(jù)已定色譜條件進(jìn)行測定。結(jié)果表明，4號基地白花泡桐葉中熊果酸和木犀草素含量顯著高于其他3個基地白花泡桐（表1）。

表1 不同基地白花泡桐葉中熊果酸和木犀草素的含量比較 （n=3）

3 小結(jié)與討論

本文建立了通過HPLC來檢測藥用白花泡桐中熊果酸和木犀草素含量的方法，此法具有簡單、靈敏、準(zhǔn)確度高以及重復(fù)性好的特點，可以用于藥用泡桐葉片原料選取的控制。

熊果酸為五環(huán)三萜類化合物，極性較弱，所以采用甲醇作為流動相。起初實驗發(fā)現(xiàn)用甲醇與水按85∶15的比例配制流動相即可將熊果酸與相鄰成分有效分離，但其峰型稍有前展，所以加入乙酸進(jìn)行測試，發(fā)現(xiàn)加入0.5%的乙酸后峰型達(dá)到對稱，由此確定熊果酸檢測的流動相。木犀草素參照邸多隆的方法[9]即可達(dá)到比較好的分離效果，并得到較好的峰型。

試驗結(jié)果表明，湘西宏成制藥不同基地所產(chǎn)的白花泡桐葉片中熊果酸和木犀草素的含量差別很大，其中4號基地白花泡桐葉片中熊果酸和木犀草素的含量均最高，與黃麗霞等報道的夏枯草中熊果酸含量[8]相比，其熊果酸含量更高，可以考慮增加該基地產(chǎn)量。另一方面，應(yīng)對幾個基地的白花泡桐品種、土壤成分進(jìn)行研究對比，找出差異所在，以期提高其他基地原料的含量。

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