金錢草、白玉蘭總黃酮的提取及體外抗氧化性研究

任雪峰，吳冬青，安紅鋼，林 敏，楊 揚(yáng)

（河西學(xué)院化學(xué)系，甘肅 張掖 734000）

黃酮類化合物廣泛存于與蔬菜、水果、牧草和藥用植物中，是植物長期在自然選擇過程中產(chǎn)生的一些次級代謝產(chǎn)物，是人體必需的營養(yǎng)素之一，許多植物的葉、皮、根和果實(shí)中都含有一定量的黃酮類化合物[1]。20世紀(jì)20年代，國外把槲皮素、蘆丁用于臨床后，才引起人們的關(guān)注。60年代末，人們發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物有抗炎、抗病毒、利膽、強(qiáng)心、鎮(zhèn)靜和鎮(zhèn)痛等作用。到70年代，又發(fā)現(xiàn)它們有抗氧化、抗衰老、免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤等作用[2]。

金錢草（Herba Lysimachiae）主要為報(bào)春花科（Primulaceae）植物過路黃（Lysimochia christinae Hance）的干燥全草，于夏、秋二季采收，除去雜質(zhì)曬干備用，全國大部分地區(qū)均產(chǎn)，主產(chǎn)于四川。金錢草味甘、咸，性微寒，入肝、膽、腎、膀胱經(jīng)，具有清熱消炎，利尿通淋，排除結(jié)石之功效。現(xiàn)代研究表明，金錢草總黃酮具有預(yù)防草酸鈣結(jié)石形成和復(fù)發(fā)的作用，還有顯著的抗炎、增加冠脈血流量等作用[3]。金錢草既可單用，也可與其他藥物相配組成復(fù)方，較為廣泛地運(yùn)用于臨床治病[4]。金錢草含有堿性成分，以黃酮類、甙類、鞣質(zhì)、揮發(fā)油、氨基酸、膽堿、甾醇、氯化鉀、內(nèi)酯類、苷類、槲皮素、山萘酚等物質(zhì)為主。其中，以黃酮類成分的研究較為深入[5-7]。

白玉蘭（Magnolia denudata）為木蘭科（Magnoliaceae）木蘭屬（Magnolia），別名木蘭、白玉蘭、望春花，主要分布在我國浙江、安徽、山西、湖南、湖北、貴州、廣東等省，是重要的綠化、園林美化、傳統(tǒng)中藥材及香精原料樹種，在我國有兩千多年的栽培與藥用歷史。在2000年版的中國藥典中，將望春玉蘭（Magnolia biondii Pamp.）、玉蘭（Magnolia denudata Desr）或武當(dāng)玉蘭（Magnolia sprengeri Pamp.）的干燥花蕾作為中藥辛夷的正品[8]?；ɡ倏扇胨?，性溫味辛，歸肺胃經(jīng)，具有散風(fēng)寒、通鼻竅之功能，用于外感風(fēng)寒，頭痛鼻塞，鼻淵、濁涕常流等癥[9]。

試驗(yàn)采用常溫浸提法、回流提取法、微波提取法和超聲波提取法等4種不同方法，分別對四川產(chǎn)金錢草、甘肅產(chǎn)白玉蘭進(jìn)行黃酮類物質(zhì)的提取和測定，并對微波提取法所得總黃酮提取液進(jìn)行體外抗氧化性研究。

1 材料與方法

1.1 供試材料

金錢草，2007年購于四川省德陽市；白玉蘭，2007年采于甘肅省蘭州市。上述原料洗凈后，自然風(fēng)干，粉碎，過60目篩，備用。

1.2 主要試劑

蘆丁（生化試劑，中國國藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑有限公司）、鄰二氮菲、雙氧水、硝酸鋁、亞硝酸鋁、氫氧化鈉、乙醇、磷酸緩沖液（PBS）、硫酸亞鐵、六氰合鐵化三鉀、三氯乙酸（TCA）、三氯化鐵等試劑均為國產(chǎn)分析純，蒸餾水。

1.3 主要儀器

WFJ-2100型可見分光光度計(jì)（尤尼柯儀器有限公司）；KQ-8型玻璃儀器氣流烘干器（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；SHB-Ш循環(huán)式多用真空泵 (鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；G8-204分析天平(上海精科天平)；FW117多功能中草藥粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司)；國華HH-6型數(shù)顯恒溫鍋（常州國華電器有限公司）；LDZ4-0.8A低速自動(dòng)平衡微型離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠）；DL-180J智能超聲清洗器（上海之信儀器有限公司）；LG燒烤型微波爐[樂金電子（天津）電器有限公司]；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海青浦瀘西儀器廠）。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 金錢草、白玉蘭中黃酮提取方法 （1）常溫浸提法提取。分別稱取金錢草、白玉蘭粉末各5.000 0 g，置于錐形瓶中，加入80%乙醇50 mL，在室溫下浸提24 h，減壓抽濾后蒸發(fā)一定量的乙醇；將濾渣重復(fù)以上方法進(jìn)行第2次、第3次浸提，合并濾液定容到100 mL，冰箱中儲藏備用。（2）回流提取法提取[10]。分別稱取金錢草、白玉蘭粉末各5.000 0 g，置于錐形瓶中，加入80%乙醇50 mL，常溫浸泡2 h后置于回流裝置中，回流提取2 h，減壓抽濾后蒸發(fā)一定量的乙醇；重復(fù)操作兩次，其余操作同（1）。（3）超聲波法提取[11]。分別稱取金錢草、白玉蘭粉末各5.000 0 g，置于錐形瓶中，加入80%乙醇50 mL，常溫浸泡2 h后在室溫下超聲處理30 min，超聲功率為90 W。重復(fù)操作兩次，其余操作同（1）。（4）微波提法提取[12]。分別稱取金錢草、白玉蘭粉末各5.000 0 g，置于錐形瓶中，加入80%乙醇50 mL，溫室浸提2 h后，微波低火提取3 min，冷卻，抽濾，濾渣進(jìn)行第2次、第3次微波提取，合并濾液并濃縮定容至100 mL，備用。

1.4.2 黃酮總量的測定[13]（1）對照品溶液的制備。精密稱取蘆丁對照品30.000 0 mg，用80%乙醇微熱溶解后，置于50 mL容量瓶中，用同濃度的乙醇定容。精密吸取已配好的蘆丁溶液20.00 mL，再用乙醇定容至50 mL，搖勻，即得濃度為0.240 0 mg/mL的蘆丁對照液。（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備。精密吸取 蘆 丁 對 照 液 0.00、0.20、0.60、1.20、1.80、2.40、3.00、3.60 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加水補(bǔ)至4.00 mL，再加入5%亞硝酸鈉0.40 mL，搖勻，放置6 min，加入 10%Al（NO3）30.40 mL，搖勻，放置 6 min，然后加入5%氫氧化鈉溶液4.00 mL，補(bǔ)水至刻度，放置10 min后，在510 nm下測定其吸光度值（以試劑空白作參比），以蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)作圖。（3）清除羥基自由基能力的測定[14]。準(zhǔn)確移取0.5 mL 5 mmol/L鄰二氮菲溶液置于10.00 mL容量瓶中，再加入2.00 mL pH值7.40的PBS溶液，混勻后加入1.00 mL 7.5 mmol/L硫酸亞鐵溶液，加入1.00 mL 2%過氧化氫溶液，補(bǔ)水至10 mL，置于37℃水浴下加熱反應(yīng)1 h后，在536 nm處測得吸光度值為A損傷。同上法，加入樣品液后再加1.00 mL 2%過氧化氫溶液，測得A加藥。同上法，不加入過氧化氫和樣品液測得A未損傷。羥基自由基清除率C的計(jì)算方法見以下公式。提取物還原力的測定－普魯士蘭法[15]。準(zhǔn)確移取不同量的樣品液，分別加入0.2 mol/L pH值6.60的磷酸鹽緩沖液和濃度為1%的K3Fe（CN）6溶液各2.50 mL并混合均勻，混合液在50℃水浴中保溫20 min，加入2.50 mL 10%的TCA溶液，混合后在3 000 r/min的離心機(jī)上離心10 min。取上層清液2.50 mL，加入2.50 mL蒸餾水和0.50 mL 0.1%的FeCl3溶液。測定反應(yīng)液在700 nm處的吸光度值，用吸光度的大小表示還原力的強(qiáng)度。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與回歸方程

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 提取物中的黃酮總量

精密吸取一定體積的樣品儲備液，根據(jù)1.4.2（2）的方法測定樣品液在510 nm處的吸光度值，代入回歸方程，計(jì)算出樣品中的黃酮含量，結(jié)果見表1。

表1 四種總黃酮提取方法結(jié)果比較

結(jié)果表明，常溫浸提法、回流法、超聲波法、微波法這4種方法中，微波法提取金錢草、白玉蘭中黃酮類物質(zhì)的量最多。

2.3 提取物清除羥基自由基的能力

精密吸取一定體積的樣品備用液，根據(jù)1.4.2（3）的方法測定樣品液在536 nm處的吸光度值，計(jì)算其清除率，結(jié)果見圖2。

由圖2可知，微波法所得提取液對羥基自由基的清除能力隨著提取液濃度的變化而變化。金錢草提取液在體積為0.8 mL時(shí)出現(xiàn)最大值，測得其對羥基的清除率為81.66%，再增加提取液體積時(shí)清除率開始下降；白玉蘭提取液在體積為0.70 mL時(shí)出現(xiàn)最大值，測得其對羥基的清除率為58.40%，再增加提取液體積時(shí)清除率開始下降。

2.4 提取物還原力的測定

精密吸取一定體積的樣品備用液，根據(jù)1.4.2（4）的方法測定樣品液在700 nm處的吸光度值，計(jì)算其還原力，結(jié)果見圖3。

圖3 提取液的還原力

由圖3可知，微波提取法所得提取液還原能力隨著提取液濃度的變化而變化。金錢草提取液在體積為0.50 mL時(shí)出現(xiàn)峰值，測得其還原力為0.844，再增加提取液體積時(shí)發(fā)現(xiàn)還原力減弱；白玉蘭提取液在體積為0.60 mL時(shí)也出現(xiàn)峰值，測得其還原力為0.832，再增加提取液體積時(shí)還原力減弱。

圖2 提取液清除羥基自由基的能力

3 結(jié)論

（1）用常溫浸提法、回流法、超聲波提取法和微波提取法提取金錢草、白玉蘭中總黃酮類化合物，其中以微波提取法所得總黃酮含量最多，提取率分別為6.032 8 mg/g、36.713 6 mg/g；常溫浸提法所得金錢草、白玉蘭中的總黃酮含量最少，提取率分別為 4.177 7 mg/g、23.163 2 mg/g。（2）采用鄰二氮菲-Fe2+-H2O2體系分光光度法測定金錢草、白玉蘭中總黃酮提取液清除羥基自由基的能力的結(jié)果表明，二者對羥基自由基均有不同程度的清除能力，清除率與提取液用量成正比，金錢草、白玉蘭清除·OH的最佳用量分別1.60、0.70 mL，清除率分別為81.66%、58.40%。（3）采用普魯士藍(lán)光度法測定金錢草、白玉蘭提取液的還原能力的結(jié)果表明，金錢草、白玉蘭的總黃酮提取液均具有較強(qiáng)的還原能力，其還原能力分別為0.844與0.832。

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