煙草病毒病抗性種質(zhì)資源鑒定與創(chuàng)新研究進展

楊 健，張金霖，王清友，唐瑞文，王 俊，凌壽軍

（1.廣東煙草清遠市有限公司連州市分公司，廣東 連州 513400；2.廣東煙草清遠市有限公司，廣東 清遠 511515）

煙草病毒病是全世界煙草栽培地區(qū)發(fā)生普遍、危害嚴重的重要病害之一。近年來，煙草病毒病在我國各煙葉主產(chǎn)區(qū)有日趨加重的趨勢，嚴重影響煙葉產(chǎn)量和品質(zhì)，已成為我國優(yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)的重要制約因素。煙草病毒病的病原種類多樣，國外已從煙草上分離到病毒32種，國內(nèi)報道發(fā)現(xiàn)18種[1]。其中，危害最為嚴重的病原種類主要有煙草普通花葉病毒（Tobacco Mosaic Virus，TMV）、黃瓜花葉病毒（Cucumber Mosaic Virus，CMV）、馬鈴薯 Y 病毒（Potato Virus Y，PVY）、煙草蝕紋病毒（Tobacco etch virus，TEV）等。田間調(diào)查顯示，當前煙草病毒病多混合發(fā)生，病害流行年份造成的損失可達30%～50%，早期發(fā)病的可達50%～70%，個別田塊甚至絕收，造成巨大的經(jīng)濟損失。在生產(chǎn)上，我國目前依舊缺乏煙草病毒病的廣譜高抗品種，抗源遺傳基礎(chǔ)狹窄以及品種結(jié)構(gòu)單一。這不僅是近年來病毒病日趨嚴重的重要原因，還帶來病害大面積流行爆發(fā)的潛在危險。因此，如何篩選和創(chuàng)新優(yōu)質(zhì)抗性種質(zhì)資源，培育優(yōu)良抗病品種，從根本上防治煙草病毒病已顯得尤為重要。本文從煙草病毒病抗性種質(zhì)資源的鑒定與培育，及其在煙草病毒病防治中的應(yīng)用研究等方面進行了綜述，以期為煙草病毒病多抗品種的選育提供參考。

1 煙草病毒病抗性種質(zhì)資源鑒定現(xiàn)狀

據(jù)不完全統(tǒng)計，國家煙草種質(zhì)庫現(xiàn)已收集保存煙草野生種35份，烤煙品種1 104份，晾曬煙1 978份，白肋煙61份，黃花煙326份，以及雪茄煙3份[2]，其中不乏對煙草病毒病具有優(yōu)良抗性的品種。如何在眾多的種質(zhì)資源中篩選鑒定出對病毒病具有廣譜高抗的材料，并用于抗病育種，是解決當前生產(chǎn)上主栽品種抗性基因單一所急需的手段。

近年來，我國煙草種質(zhì)資源相關(guān)研究已取得了一定的進展，主要集中在煙草種質(zhì)資源的收集、保存、分類鑒定[3－4]、遺傳多樣性分析[5]以及種質(zhì)創(chuàng)新上[6－7]。其中，煙草病毒病抗性種質(zhì)資源鑒定研究也有一定數(shù)量的報道。Gupton最初報道了一個栽培種Virgin突變體Virgin A Mutant（VAM）對PVY具有良好抗性[8]；陳榮平等[9]通過病圃發(fā)病情況調(diào)查和溫室接種鑒定，篩選到3份抗PVY材料，其中CV91在田間接種和溫室接種后都表現(xiàn)為高抗病性，可以作為很好的育種材料；另外，在2009年，陳榮平等[10]采用相同方法，對69份煙草種質(zhì)資源進行篩選，初步鑒定出C151、Hawana10、壩林曬煙和Criollo salteno 11等11份表現(xiàn)為高抗PVY的煙草種質(zhì)；而TN86、V.SCR、筑波2號也被報道是優(yōu)良的PVY抗源材料[6－11]。這些結(jié)果都表明，在已有的煙草種質(zhì)中存在一定數(shù)量的PVY抗性種質(zhì)資源，它們作為PVY抗性供體在PVY抗病改良中具有一定的應(yīng)用價值。盡管如此，由于鑒定病原單一，沒有獲得這些種質(zhì)其它病毒病的抗性指數(shù)信息，在病毒病多抗育種中依然存在一定的局限性。對此，戴培剛等選擇了1 000余份有代表性的煙草種質(zhì)，對包括TMV、CMV、PVY等7個主要病害的抗性進行了鑒定分析[12]。在黃淮煙區(qū)供試品種中，TMV抗性資源較為豐富，高抗及免疫材料所占比例達到17.19%，中抗品種占18.76%；而CMV抗性種質(zhì)缺乏，無高抗及免疫品種，中抗種質(zhì)占20.70%，并主要分布在東北及西南煙區(qū)；另外，在41份烤煙品種中，鑒定的PVY抗性品種占14.63%，中抗比例為24.39%。在另一項研究中，劉艷華[4-5]等對202份煙草種質(zhì)同樣進行了TMV、CMV、PVY3種病毒病的抗性鑒定，分別獲得抗TMV材料22份，抗CMV材料4份，以及抗PVY材料3份。這些研究結(jié)果為深入挖掘病毒病多抗種質(zhì)提供了較為系統(tǒng)及全面的數(shù)據(jù)參考，同時也為煙草病毒病抗病品種培育奠定了基礎(chǔ)。

表1統(tǒng)計了部分種質(zhì)資源對TMV、CMV、PVY的抗性情況。從統(tǒng)計結(jié)果可以看到，所有供試煙草種質(zhì)中，對2個及以上病毒表現(xiàn)為抗性的品種很少，僅為10個；而對3種病毒都具備抗性的品種只有陽高小蘭花1個品種，且其對CMV及PVY只表現(xiàn)中等抗性。這些結(jié)果表明，一方面煙草病毒病廣譜抗性種質(zhì)資源的相對缺乏，另一方面我國病毒病廣譜抗性種質(zhì)的鑒定研究需要進一步深入，尤其是要加強對野生種及農(nóng)家種的抗源挖掘。這些種質(zhì)經(jīng)長期自然進化及馴化后，往往具有較強的抗病、抗蟲及抗逆性狀，是廣譜抗病基因的天然寶庫，也是煙草多抗育種的重要基礎(chǔ)。

2 煙草病毒病抗性種質(zhì)資源創(chuàng)新現(xiàn)狀

2.1 物理化學誘變的應(yīng)用

在早期研究中，具有Virgin遺傳背景的VAM就是通過X-射線誘變得到的PVY高抗材料[8]，而VAM在抗PVY育種中也得到了實際應(yīng)用。Gooding[13]等以VAM及Cokeer86為親本育成了PVY抗性品種NC744，并用于商業(yè)推廣。我國煙草誘變育種也已起步，相關(guān)研究人員對經(jīng)太空誘變的13個烤煙品種進行篩選，獲得了一系列突變材料，后期研究發(fā)現(xiàn)突變體后代的整體抗病性得到了顯著提高[14]。另外，離子注入技術(shù)等誘變方法在煙草種質(zhì)創(chuàng)新中的應(yīng)用也已見所報道[15]，這些突變體極大地豐富了我國煙草種質(zhì)資源，在種質(zhì)創(chuàng)新及誘變育種中具有廣闊的應(yīng)用前景。

2.2 細胞工程的應(yīng)用

煙草野生種與栽培種往往存在種間不親合現(xiàn)象，利用傳統(tǒng)育種方法很難實現(xiàn)野生種優(yōu)良性狀向栽培種的轉(zhuǎn)移。而細胞工程是克服種間不親合障礙、解決性狀轉(zhuǎn)移困難的有效手段，其中以體細胞雜交在煙草種質(zhì)創(chuàng)新中的應(yīng)用最多。目前，我國利用體細胞雜交技術(shù)創(chuàng)新煙草種質(zhì)已取得相當進展。自70年代以來，我國先后成功誘導出普通煙草與8個野生煙草中的種間體細胞雜種。其中，普通煙草栽培品系86-1和N.nesophila的體細胞雜種株系，在接種TMV及CMV后表現(xiàn)枯斑反應(yīng)，具備良好的病毒病抗性[16]；另外，孫學永等用G140與抗花葉病的野生波葉煙草N.undalate進行體細胞雜交，也得到了優(yōu)良TMV抗性的體細胞雜交單株自交系[17]。除此之外，利用組織培養(yǎng)中高頻率的細胞變異現(xiàn)象，篩選煙草抗性材料也有相關(guān)報道[18]。通過細胞工程手段，獲得的煙草抗性材料，不僅是煙草種質(zhì)資源的重要來源，而且更多的是這些育種中間體作為新的煙草抗性種質(zhì)資源在改良煙草病毒病抗性性狀上具有巨大的應(yīng)用潛力。

2.3 轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用

自1986年P(guān)owell Abel將TMV外殼蛋白基因轉(zhuǎn)入煙草獲得第一例轉(zhuǎn)基因抗病毒植株以來[19]，利用現(xiàn)代生物技術(shù)獲得病毒病抗性植株，已成為煙草抗病種質(zhì)資源創(chuàng)新的重要技術(shù)策略。我國利用生物技術(shù)培育抗病毒煙草起步較早，在90年代中期，我國科研人員就利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)分別培育出CMV、

PVY抗性煙草植株[20－21]。之后，朱俊華等利用RNA沉默技術(shù)獲得RNA介導的PVY抗性煙草[22]；與之類似，顏培強等應(yīng)用RNAi技術(shù)培育出高抗TMV的轉(zhuǎn)基因煙草植株[7]；進一步的研究利用RNA介導的轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象，將一融合基因轉(zhuǎn)入受體，獲得了抗多種病毒病的轉(zhuǎn)基因煙草，研究結(jié)果顯示T1代轉(zhuǎn)基因植株兼具TMV、CMV、PVY的抗性，并且抗性性狀遺傳穩(wěn)定[23]。這些研究表明，轉(zhuǎn)基因技術(shù)不僅能突破自然界原本的種間隔閡，將其他物種的優(yōu)良病毒病抗病基因引入煙草種屬，重要的還是將其作為創(chuàng)新煙草病毒病抗性種質(zhì)的有效手段，尤其在煙草種質(zhì)庫中病毒病廣譜抗源普遍缺乏的情況下，利用多基因融合轉(zhuǎn)化技術(shù)能夠創(chuàng)造出新的多抗煙草材料，為煙草病毒病多抗育種提供更為多樣的材料選擇。

表1 部分煙草種質(zhì)的主要病毒病抗性

3 前景與展望

培育煙草病毒病廣譜抗性品種是防治煙草病毒病流行，降低病害經(jīng)濟損失的根本手段，而煙草病毒病抗性種質(zhì)的鑒定與創(chuàng)新是多抗育種的重要基礎(chǔ)。目前，盡管我國相關(guān)抗性鑒定研究取得一定進展，但所篩選到的病毒病抗性種質(zhì)依舊較少，尤其是所鑒定的廣譜抗性種質(zhì)極其缺乏，在生產(chǎn)上直接表現(xiàn)為抗病毒育種對病毒病防治的貢獻率較低。究其根源，這與對現(xiàn)有種質(zhì)資源的挖掘和利用不夠有很大關(guān)系。因此，在今后一段時間內(nèi)，煙草病毒病抗性種質(zhì)資源鑒定與創(chuàng)新研究應(yīng)加強以下幾個方面：（1）充分利用我國豐富的煙草種質(zhì)資源，擴大篩選范圍，尤其注重煙草野生種及農(nóng)家種的抗性評價，鑒定出更多的廣譜抗性種質(zhì)，并對部分重點種質(zhì)做到精準鑒定，篩選出多抗育種的骨干親本；（2）利用現(xiàn)代生物技術(shù)，充分發(fā)揮分子標記等手段在種質(zhì)遺傳多樣性、抗性鑒定以及優(yōu)質(zhì)基因挖掘上的優(yōu)勢，不斷提高病毒病抗性鑒定效率；（3）加大煙草病毒病抗性種質(zhì)創(chuàng)新力度，充分發(fā)揮細胞工程及轉(zhuǎn)基因技術(shù)在克服種間障礙中的優(yōu)勢，實現(xiàn)優(yōu)良抗病性狀的轉(zhuǎn)移，不斷豐富病毒病抗性遺傳基礎(chǔ)；（4）注重現(xiàn)代生物技術(shù)與傳統(tǒng)育種的結(jié)合，提高育種效率，加快優(yōu)良抗性性狀的應(yīng)用步伐。

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