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    栝蔞脫毒苗組培快繁技術(shù)體系研究

    2010-09-04 03:00:38丁茁荑鄭明福楊博智吳藝飛周曉波
    湖南農(nóng)業(yè)科學(xué) 2010年23期
    關(guān)鍵詞:叢生大田試管

    丁茁荑,鄭明福,楊博智,吳藝飛,周曉波

    (湖南省蔬菜研究所,湖南省蔬菜工程技術(shù)研究中心,湖南 長(zhǎng)沙 410125)

    栝蔞又名瓜蔞、藥瓜等,為多年生草質(zhì)藤本的葫蘆科栝蔞屬植物,目前主要利用的有栝蔞(Trichosanthes rosthornii Kirilowii Maxim)及雙邊栝蔞(Trichosanthes rosthornii Harms)。栝蔞的根、籽(果仁)、皮(果皮)均可入藥,具有清涼解熱、止咳、消腫、治療糖尿病等多種疾病的功效[1]。近年來(lái),因發(fā)現(xiàn)栝蔞籽具有獨(dú)特的風(fēng)味和保健作用,被作為一種高檔食用瓜子開(kāi)發(fā)進(jìn)入市場(chǎng),使得栽培面積急劇增長(zhǎng)。

    近年來(lái)栝蔞在湘南也具有一定的種植規(guī)模,并取得了較好的經(jīng)濟(jì)效益。農(nóng)民及栝蔞加工企業(yè)對(duì)發(fā)展栝蔞產(chǎn)業(yè)積極性很高,但因種苗問(wèn)題,嚴(yán)重制約了生產(chǎn)的發(fā)展。由于栝蔞種子發(fā)芽率低且雌雄異株,種子繁育的苗中只有約30%為可用的雌株,且要在開(kāi)花后才能辨別,費(fèi)時(shí)費(fèi)力。同時(shí)種子繁殖也易導(dǎo)致品種分離,故主要采取分株無(wú)性繁殖的方法,但該法繁殖速度慢,容易導(dǎo)致品種退化和加快病害的傳播。

    為解決生產(chǎn)中的這一問(wèn)題,研究組自2005年開(kāi)始對(duì)栝蔞種苗的快繁技術(shù)進(jìn)行了較為全面的研究,建立了其莖尖培養(yǎng)快繁技術(shù)體系,有效地解決了這一難題。現(xiàn)繁殖的栝蔞幼苗性狀整齊一致,雌株率100%,種苗無(wú)病無(wú)毒,生活力明顯優(yōu)于分根繁殖苗,已大規(guī)模應(yīng)用于生產(chǎn)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    本次試驗(yàn)樣品取自湖南省蔬菜研究所試驗(yàn)田,從中選擇人工接種并明顯感染黃瓜花葉病毒的植株,剪取其分枝前端。

    1.2 方法

    1.2.1 外植體消毒與處理 (1)預(yù)處理:將采回的栝蔞嫩枝條,留腋芽及頂芽,截成2~3 cm長(zhǎng)的莖段,先用自來(lái)水沖洗2~3次,再用蒸餾水沖洗1次,待用。(2)消毒:70%的乙醇滅菌30 s,3%的次氯酸鈉溶液滅菌15 min,無(wú)菌水沖洗3~4次。切去切口端少許。(3)預(yù)培養(yǎng):將上述消毒處理好的外植材料接種于MS+6-BA 2.0 mg/L培養(yǎng)基中,約15 d后,腋芽或頂芽生長(zhǎng),形成小苗,備用。

    1.2.2 莖尖剝?nèi)∨c培養(yǎng) 切取上述小苗莖尖,在解剖鏡下用解剖針剝?nèi)∑浞謩e為0.2、0.5、0.8 mm莖尖各50個(gè)以上,接種在不添加激素的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)30 d后,轉(zhuǎn)到MS+2.0 mg 6-BA培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。每瓶2~3個(gè),光照強(qiáng)度為3 000 Lx,光照時(shí)間為每天 10 h,溫度為(28±2)℃。

    1.2.3 黃瓜花葉病毒檢測(cè) 采用王麗花等所述RT—PCR 法[2]。

    1.2.4 愈傷組織誘導(dǎo)及增殖培養(yǎng)基的篩選 以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基,添加3%白糖(市售)、0.7%瓊脂和不同激素濃度配比,pH 5.8(表1)。

    表1 誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基不同激素配比 (mg/L)

    以0.5 cm長(zhǎng)莖切段作為外植體接種于上述培養(yǎng)基上,在28℃、光照強(qiáng)度3 000 Lx、光照時(shí)間每天12 h的條件下進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)。

    1.2.5 叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的篩選 將帶有芽點(diǎn)的愈傷組織分割成邊長(zhǎng)為0.5 cm的小塊,分別接種到叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基,添加3%白糖及0.7%瓊脂以及不同濃度NAA和6-BA,pH 5.8(表2)。每處理接種愈傷組織25瓶,每瓶4塊,培養(yǎng)條件為20℃(夜)~28℃(日)、光照強(qiáng)度3 000 Lx、光照時(shí)間每天12 h。觀察叢芽發(fā)生和生長(zhǎng)情況。

    表2 叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基不同激素配比 (mg/L)

    1.2.6 繼代培養(yǎng) 將初代培養(yǎng)出的芽取出,按節(jié)切下,接種于繼代培養(yǎng)基中,獲得發(fā)育健壯的栝蔞無(wú)根苗。 繼代培養(yǎng)基設(shè)計(jì)了兩種配方:MS+6-BA 2.0 mg/L 和 MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L,培養(yǎng)條件同上。

    1.2.7 生根培養(yǎng)基的篩選 以1/MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基,3%白糖(市售)、0.7%瓊脂,pH 5.8,分別添加0.2、0.4、0.6 mg/L NAA不同激素濃度配比,對(duì)照中不加任何激素。每種激素濃度配25瓶培養(yǎng)基。

    將繼代培養(yǎng)苗按3~4節(jié)長(zhǎng)切下,接入以上生根培養(yǎng)基中,每處理接種25瓶,每瓶接種苗切斷4個(gè),培養(yǎng)條件為18℃(夜)~28℃(日)、光照強(qiáng)度3 000 Lx、光照時(shí)間每天12 h。觀察統(tǒng)計(jì)根的發(fā)生和生長(zhǎng)情況。

    1.2.8 試管苗移栽 15~20 d生根培養(yǎng)后,去培養(yǎng)瓶蓋,在室內(nèi)煉苗2~3 d后,沖洗掉根系上的培養(yǎng)基,移栽至塑料大棚珍珠巖基質(zhì)中。溫度保持23~28℃,白天采用自控微噴系統(tǒng)噴霧保濕,晴天每1~1.5 h噴霧5 min,陰雨天每2~4 h噴霧4 min,3 d后噴霧次數(shù)減半,一周后,隨著幼苗新根發(fā)生,逐步停止噴霧,期間每天噴營(yíng)養(yǎng)液5 min(1/2園試無(wú)土栽培配方)。

    1.2.9 栝蔞的扦插 試驗(yàn)用插穗有兩種:一種取自移栽組培苗,另一種取自大田兩年生植株,分別剪取有2~3葉的莖尖或側(cè)枝作為插穗。用0.2%生根粉浸泡插穗,處理時(shí)間分別設(shè)為:0(不泡生根劑直接扦插)、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h。

    將上述處理過(guò)的插穗(每處理200個(gè))分別扦插于珍珠巖基質(zhì)苗床上,管理方式同試管苗移栽。10 d后觀察新根發(fā)生情況,每處理隨機(jī)取樣10株測(cè)量生根數(shù),取平均值。

    1.2.10 育苗大田定植 移栽的試管苗或扦插苗根系發(fā)育良好后,停止肥水5 d左右煉苗,選擇陰天或晴天傍晚,帶根定植于大田,密度約4 000株/667m2。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 不同莖尖大小成苗率和CMV檢出率

    接種于不添加激素的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)30 d后,莖尖大多生成愈傷組織,轉(zhuǎn)到MS+2.0 mg 6-BA培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)30 d左右后,生長(zhǎng)出小苗,其中部分生根。統(tǒng)計(jì)其成苗率和取其葉片檢測(cè)CMV,結(jié)果見(jiàn)表3。其中成苗率=(成苗數(shù)/接種數(shù))×100%,脫毒率=(1-CMV 檢出數(shù)/成苗數(shù))×100%。

    表3 不同莖尖大小成苗率和CMV檢出率

    從表3中可以看出,不同莖尖大小的成苗率和病毒檢出率差異很大,莖尖越小,成苗率越低,但脫毒效果越好。其中0.8 mm大小的莖尖成苗最為容易,成苗率高達(dá)83.7%,但幾乎不能脫除病毒,其中只有一株未能檢出CMV,脫毒率僅為1.4%。0.5 mm的莖尖成苗率為34.8%,脫毒效果較為明顯,達(dá)到了29.2%(見(jiàn)圖1)。而0.2 mm的莖尖成苗率雖然很低,只有13.7%,但脫毒效果最好,沒(méi)有檢出CMV,脫毒率達(dá)到100%。

    圖1 部分0.5 mm莖尖培養(yǎng)植株CMV RT-PCR檢測(cè)

    為防止連續(xù)無(wú)性繁殖可能導(dǎo)致的病毒積累而退化的問(wèn)題,對(duì)栝蔞進(jìn)行脫毒培養(yǎng)是必要的。但栝蔞的主要病毒種類不是很清楚,本試驗(yàn)以大田中感染較為普遍的黃瓜花葉病毒作為標(biāo)志性病毒,人工接種后,通過(guò)檢測(cè)莖尖培養(yǎng)對(duì)黃瓜花葉病毒的脫除效果,來(lái)評(píng)價(jià)整體脫毒效果。莖尖培養(yǎng)脫毒的原因是小莖尖分生組織尚未形成微管束,病毒無(wú)法移動(dòng)感染,因此,在一定大小的莖尖下CMV不能感染,以至其他病毒也不能感染,表明以CMV作為脫毒標(biāo)志應(yīng)該是可行的。也就是說(shuō),如果該方法能有效脫除黃瓜花葉病毒,那么同樣也能脫除其他病毒(如果存在的話)。據(jù)此可以認(rèn)為,采用0.2 mm大小的莖尖培養(yǎng),能有效脫除栝蔞病毒,獲得無(wú)病毒苗。

    2.2 不同激素配比對(duì)栝蔞愈傷組織誘導(dǎo)的影響

    栝蔞外植體接種在添加如表1所示不同濃度激素MS培養(yǎng)基上,培養(yǎng)約10 d時(shí),所有培養(yǎng)基上的莖尖和莖切段基部均有淡黃色的愈傷組織形成。繼續(xù)培養(yǎng)約10 d,形成的愈傷組織開(kāi)始分化出淡綠色芽點(diǎn),但不同激素配比培養(yǎng)基培養(yǎng)的效果不同(見(jiàn)表 4)。

    表4 不同培養(yǎng)基接種20 d后愈傷組織誘導(dǎo)效果

    培養(yǎng)結(jié)果表明,添加適宜濃度的NAA有利于愈傷組織的形成,但添加0.5 mg/L與1.0 mg/L的6-BA效果并無(wú)明顯差異。觀察發(fā)現(xiàn),在添加0.4 mg/L和0.6 mg/L NAA的MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)形成的愈傷組織較大,色澤較淡而明亮,是較優(yōu)激素配比。而較高濃度的NAA則抑制愈傷組織的生長(zhǎng)。

    2.3 不同激素配比對(duì)栝蔞愈傷組織叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)的影響

    將栝蔞0.5 cm大小愈傷組織小塊接種到表2所示不同激素配比的MS培養(yǎng)基中,培養(yǎng)10 d后,絕大多數(shù)愈傷組織分化出3個(gè)左右小芽,各處理間差異不明顯。培養(yǎng)20 d后的叢生芽誘導(dǎo)情況見(jiàn)表5。結(jié)果表明,Ⅶ號(hào)激素配比培養(yǎng)基(6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L)效果最佳,其誘導(dǎo)的叢芽數(shù)目相對(duì)較多,生長(zhǎng)速度快,植株健壯,長(zhǎng)勢(shì)良好(見(jiàn)圖2)。

    圖2 叢生芽誘導(dǎo)效果

    當(dāng)培養(yǎng)基中6-BA濃度較低時(shí),叢生芽生長(zhǎng)速度較慢,節(jié)間較短;而濃度偏高時(shí),腋芽發(fā)育,也抑制叢生芽的生長(zhǎng)速度。較低濃度NAA(0.2 mg/L)也有促進(jìn)叢生芽生長(zhǎng)的效果,但濃度較高且6-BA濃度偏低時(shí),愈傷組織生長(zhǎng)并分化出根系,叢生芽生長(zhǎng)緩慢,節(jié)間短縮。

    表5 不同激素配比對(duì)栝蔞愈傷組織叢生芽的誘導(dǎo)效果

    2.4 繼代培養(yǎng)效果

    有研究表明,組織培養(yǎng)通過(guò)愈傷組織分化再誘導(dǎo)成苗,雖然繁殖系數(shù)高,但有變異退化的風(fēng)險(xiǎn)。特別是重復(fù)地進(jìn)行誘導(dǎo)愈傷組織—分化—誘導(dǎo)—分化的過(guò)程,這種風(fēng)險(xiǎn)將顯著增加。

    作為工廠化脫毒苗生產(chǎn),繁殖代數(shù)高,為了避免變異退化的風(fēng)險(xiǎn),選擇了利用葉芽增殖的方式,即類似于試管扦插,雖然繁殖系數(shù)較低,但加代時(shí)間較短,總體增殖速度與愈傷組織培養(yǎng)途徑基本相當(dāng)。

    兩種配方的繼代培養(yǎng)基都表現(xiàn)良好,之間沒(méi)有明顯差異。接種的莖節(jié)沒(méi)有產(chǎn)生大的愈傷組織,而葉芽都萌發(fā)生長(zhǎng),幼苗及葉芽健壯無(wú)畸變,生活力高(見(jiàn)圖3)。幼苗生長(zhǎng)速度快,在第15天左右可生長(zhǎng)2~3節(jié),即可按單節(jié)莖段分切繼代,完成一個(gè)繁殖周期。

    圖3 MS+6-BA 2.0 mg/L培養(yǎng)基繼代產(chǎn)生的腋芽

    因?yàn)閮煞N培養(yǎng)基培養(yǎng)效果無(wú)明顯差異,故選擇較為簡(jiǎn)單的MS+6-BA 2.0 mg/L作為最適繼代培養(yǎng)基。

    2.5 生根培養(yǎng)效果

    1/2 MS添加不同濃度NAA的培養(yǎng)基對(duì)栝蔞苗根系誘導(dǎo)效果見(jiàn)表6。

    表6 不同激素濃度對(duì)栝蔞根系的誘導(dǎo)效果

    由表6及圖3可知,將無(wú)根苗接種到1/2MS+NAA 0.2 mg/L培養(yǎng)基上,單株根分化較多,形成的白色根系較發(fā)達(dá),生長(zhǎng)旺盛,根毛多,愈傷組織小。隨NAA濃度的增加,生根率下降,且不定根根毛較少、不發(fā)達(dá)、根生長(zhǎng)緩慢,短粗,脆而易斷,愈傷組織發(fā)達(dá),根部分泌物增加。因此,添加0.2 mg/L NAA的MS培養(yǎng)基是最適宜于誘導(dǎo)栝蔞試管苗生根的培養(yǎng)基。

    另外,從不同大小外植體誘根效果觀察中發(fā)現(xiàn),當(dāng)外植體幼苗小于3節(jié)時(shí),會(huì)出現(xiàn)和高濃度NAA類似的誘導(dǎo)效果,即愈傷組織發(fā)達(dá),根系短粗而脆,苗生長(zhǎng)緩慢。因此,在進(jìn)行誘根處理時(shí),保證外植體大于3節(jié)是非常必要的。

    2.6 試管苗移栽與大田定植的成活率

    試管生根苗移栽至塑料大棚珍珠巖中,成活率與苗的大小關(guān)系較大。據(jù)觀察,5節(jié)以上健壯植株,只要嚴(yán)格按要求操作,移栽成活率即可高達(dá)95%以上。3節(jié)以下的小苗成活率較低,在50%左右。特別注意的是移栽后前3~5 d,保持濕度是關(guān)鍵。

    移栽的試管苗或扦插苗新根大量發(fā)生后,停止肥水5 d左右煉苗,選擇陰天或晴天傍晚,定植于大田,密度約4 000株/667m2。移栽后15 d左右,植株發(fā)生大量新根,并進(jìn)入快速生長(zhǎng)期,煉苗后,可選擇陰天或晴天傍晚定植于大田,觀察統(tǒng)計(jì)成活率在95%左右。

    育苗大田定植在4~9月皆可進(jìn)行,一般7月前定植者,需要控制肥水以避免藤蔓生長(zhǎng)過(guò)旺。調(diào)查表明,肥水較好的田塊,種根反而較小,而未施肥灌水地塊,種根直徑基本在2.5 cm以上。8~9月后定植的田塊,則應(yīng)保證肥水供應(yīng),種根直徑在2 cm左右。

    2.7 插穗及處理方式對(duì)扦插生根率的影響

    于扦插后10 d,觀察插穗生根狀況,其結(jié)果見(jiàn)表7。

    表7 不同插穗及處理方法對(duì)扦插生根率的影響

    從表7可以看出,不同插穗來(lái)源扦插生根能力差異極為顯著,來(lái)源于組培苗的插穗生根率均高于80%,平均達(dá)91.8%,而來(lái)源于大田兩年生苗的插穗,生根率均低于12%。觀察發(fā)現(xiàn),該類插穗切口少有愈傷組織發(fā)生,易于褐化腐爛,可能是其木質(zhì)化程度高,難以分化,且大田中植株病菌較多所致。

    以0.2%生根粉浸泡組培苗插穗,不同浸泡時(shí)間對(duì)插穗根系發(fā)生亦有較為明顯的影響,其差異主要體現(xiàn)在根量和根系生長(zhǎng)活力上,在生根率方面差異不大,基本在90%以上。其中處理1h的效果最好,生根率達(dá)到94.5%,根系最為發(fā)達(dá),根量多而細(xì)長(zhǎng),根毛著生多,根系活力高。浸泡時(shí)間過(guò)長(zhǎng),發(fā)根量稍少,根系生長(zhǎng)速率緩慢,根變粗,根毛減少。未用生根劑處理的空白對(duì)照(組培苗)生根率也能達(dá)到95%,只是根系比較短,根量比較少。

    3 總結(jié)

    根據(jù)以上試驗(yàn)結(jié)果,就栝蔞無(wú)毒苗組培快繁技術(shù)體系要點(diǎn)總結(jié)如下:

    (1)無(wú)毒苗獲得。選優(yōu)良單株,取0.2 mm莖尖,于MS培養(yǎng)基(不添加激素)中培養(yǎng)45 d后,轉(zhuǎn)到MS+0.4 mg/L 6-BA+0.6 mg/L NAA的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)愈傷組織。將愈傷組織分割成0.5 cm的小塊,接種到MS+3.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA的MS叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上,獲取大量無(wú)毒叢生芽。

    (2)無(wú)毒苗試管苗繼代增殖。將叢生芽按節(jié)切段,以MS+6-BA 2.0 mg/L為培養(yǎng)基,通過(guò)葉芽進(jìn)行重復(fù)繼代增殖。

    (3)生根移栽。將3節(jié)以上的繼代增殖試管苗于1/2MS+NAA 0.2 mg/L培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根。小苗5節(jié)以上時(shí),煉苗2~3 d后,移栽至珍珠巖基質(zhì)中,溫度>15℃,微噴系統(tǒng)噴霧保濕,一周后,隨著幼苗新根發(fā)生,逐步停止噴霧,期間每天噴霧營(yíng)養(yǎng)液5 min(1/2園試無(wú)土栽培配方)進(jìn)行葉面施肥。

    (4)扦插擴(kuò)繁。剪取移栽組培苗帶有2~3葉的莖尖或側(cè)枝作為插穗,用0.2%生根粉浸泡插穗1 h,扦插于珍珠巖基質(zhì)苗床上,管理方式同上。

    (5)大田定植。扦插20 d左右后,選擇陰天或晴天傍晚,帶根定植于大田,密度(株行距)30 cm×30 cm。一般7月前定植者,需要控制肥水以避免藤蔓生長(zhǎng)過(guò)旺,8~9月后定植的田塊,則應(yīng)保證肥水供應(yīng)。待12月地上部枯死后,挖出種根,陽(yáng)光下曬2~3 d 后,室內(nèi)儲(chǔ)存。

    本研究的特點(diǎn)是用莖尖培養(yǎng)脫除病毒后,利用腋芽進(jìn)行繼代增殖,盡可能防止退化變異。組培苗采用扦插擴(kuò)繁,大大降低了成本。目前該栝蔞脫毒苗繁育體系已經(jīng)運(yùn)轉(zhuǎn)4 a,累計(jì)推廣脫毒苗近30萬(wàn)株,田間普遍表現(xiàn)生長(zhǎng)勢(shì)旺盛,單株結(jié)果數(shù)明顯高于多年生苗和實(shí)生苗,受到廣大栝蔞種植戶的歡迎。

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