栝蔞脫毒苗組培快繁技術(shù)體系研究

丁茁荑，鄭明福，楊博智，吳藝飛，周曉波

（湖南省蔬菜研究所，湖南省蔬菜工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410125）

栝蔞又名瓜蔞、藥瓜等，為多年生草質(zhì)藤本的葫蘆科栝蔞屬植物，目前主要利用的有栝蔞（Trichosanthes rosthornii Kirilowii Maxim）及雙邊栝蔞（Trichosanthes rosthornii Harms）。栝蔞的根、籽（果仁）、皮（果皮）均可入藥，具有清涼解熱、止咳、消腫、治療糖尿病等多種疾病的功效[1]。近年來(lái)，因發(fā)現(xiàn)栝蔞籽具有獨(dú)特的風(fēng)味和保健作用，被作為一種高檔食用瓜子開(kāi)發(fā)進(jìn)入市場(chǎng)，使得栽培面積急劇增長(zhǎng)。

近年來(lái)栝蔞在湘南也具有一定的種植規(guī)模，并取得了較好的經(jīng)濟(jì)效益。農(nóng)民及栝蔞加工企業(yè)對(duì)發(fā)展栝蔞產(chǎn)業(yè)積極性很高，但因種苗問(wèn)題，嚴(yán)重制約了生產(chǎn)的發(fā)展。由于栝蔞種子發(fā)芽率低且雌雄異株，種子繁育的苗中只有約30%為可用的雌株，且要在開(kāi)花后才能辨別，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。同時(shí)種子繁殖也易導(dǎo)致品種分離，故主要采取分株無(wú)性繁殖的方法，但該法繁殖速度慢，容易導(dǎo)致品種退化和加快病害的傳播。

為解決生產(chǎn)中的這一問(wèn)題，研究組自2005年開(kāi)始對(duì)栝蔞種苗的快繁技術(shù)進(jìn)行了較為全面的研究，建立了其莖尖培養(yǎng)快繁技術(shù)體系，有效地解決了這一難題。現(xiàn)繁殖的栝蔞幼苗性狀整齊一致，雌株率100%，種苗無(wú)病無(wú)毒，生活力明顯優(yōu)于分根繁殖苗，已大規(guī)模應(yīng)用于生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

本次試驗(yàn)樣品取自湖南省蔬菜研究所試驗(yàn)田，從中選擇人工接種并明顯感染黃瓜花葉病毒的植株，剪取其分枝前端。

1.2 方法

1.2.1 外植體消毒與處理 （1）預(yù)處理：將采回的栝蔞嫩枝條，留腋芽及頂芽，截成2～3 cm長(zhǎng)的莖段，先用自來(lái)水沖洗2～3次，再用蒸餾水沖洗1次，待用。（2）消毒：70%的乙醇滅菌30 s，3%的次氯酸鈉溶液滅菌15 min，無(wú)菌水沖洗3～4次。切去切口端少許。（3）預(yù)培養(yǎng)：將上述消毒處理好的外植材料接種于MS+6-BA 2.0 mg/L培養(yǎng)基中，約15 d后，腋芽或頂芽生長(zhǎng)，形成小苗，備用。

1.2.2 莖尖剝?nèi)∨c培養(yǎng) 切取上述小苗莖尖，在解剖鏡下用解剖針剝?nèi)∑浞謩e為0.2、0.5、0.8 mm莖尖各50個(gè)以上，接種在不添加激素的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)30 d后，轉(zhuǎn)到MS+2.0 mg 6-BA培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。每瓶2～3個(gè)，光照強(qiáng)度為3 000 Lx，光照時(shí)間為每天 10 h，溫度為（28±2）℃。

1.2.3 黃瓜花葉病毒檢測(cè) 采用王麗花等所述RT—PCR 法[2]。

1.2.4 愈傷組織誘導(dǎo)及增殖培養(yǎng)基的篩選 以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加3%白糖（市售）、0.7%瓊脂和不同激素濃度配比，pH 5.8（表1）。

表1 誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基不同激素配比 （mg/L）

以0.5 cm長(zhǎng)莖切段作為外植體接種于上述培養(yǎng)基上，在28℃、光照強(qiáng)度3 000 Lx、光照時(shí)間每天12 h的條件下進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)。

1.2.5 叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的篩選 將帶有芽點(diǎn)的愈傷組織分割成邊長(zhǎng)為0.5 cm的小塊，分別接種到叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，添加3%白糖及0.7%瓊脂以及不同濃度NAA和6-BA，pH 5.8（表2）。每處理接種愈傷組織25瓶，每瓶4塊，培養(yǎng)條件為20℃（夜）～28℃（日）、光照強(qiáng)度3 000 Lx、光照時(shí)間每天12 h。觀察叢芽發(fā)生和生長(zhǎng)情況。

表2 叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基不同激素配比 （mg/L）

1.2.6 繼代培養(yǎng) 將初代培養(yǎng)出的芽取出，按節(jié)切下，接種于繼代培養(yǎng)基中，獲得發(fā)育健壯的栝蔞無(wú)根苗。 繼代培養(yǎng)基設(shè)計(jì)了兩種配方：MS＋6-BA 2.0 mg/L 和 MS＋6-BA 2.0 mg/L＋NAA 0.2 mg/L，培養(yǎng)條件同上。

1.2.7 生根培養(yǎng)基的篩選 以1/MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，3%白糖（市售）、0.7%瓊脂，pH 5.8，分別添加0.2、0.4、0.6 mg/L NAA不同激素濃度配比，對(duì)照中不加任何激素。每種激素濃度配25瓶培養(yǎng)基。

將繼代培養(yǎng)苗按3～4節(jié)長(zhǎng)切下，接入以上生根培養(yǎng)基中，每處理接種25瓶，每瓶接種苗切斷4個(gè)，培養(yǎng)條件為18℃（夜）～28℃（日）、光照強(qiáng)度3 000 Lx、光照時(shí)間每天12 h。觀察統(tǒng)計(jì)根的發(fā)生和生長(zhǎng)情況。

1.2.8 試管苗移栽 15～20 d生根培養(yǎng)后，去培養(yǎng)瓶蓋，在室內(nèi)煉苗2～3 d后，沖洗掉根系上的培養(yǎng)基，移栽至塑料大棚珍珠巖基質(zhì)中。溫度保持23～28℃，白天采用自控微噴系統(tǒng)噴霧保濕，晴天每1～1.5 h噴霧5 min，陰雨天每2～4 h噴霧4 min，3 d后噴霧次數(shù)減半，一周后，隨著幼苗新根發(fā)生，逐步停止噴霧，期間每天噴營(yíng)養(yǎng)液5 min（1/2園試無(wú)土栽培配方）。

1.2.9 栝蔞的扦插 試驗(yàn)用插穗有兩種：一種取自移栽組培苗，另一種取自大田兩年生植株，分別剪取有2～3葉的莖尖或側(cè)枝作為插穗。用0.2%生根粉浸泡插穗，處理時(shí)間分別設(shè)為：0（不泡生根劑直接扦插）、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h。

將上述處理過(guò)的插穗（每處理200個(gè)）分別扦插于珍珠巖基質(zhì)苗床上，管理方式同試管苗移栽。10 d后觀察新根發(fā)生情況，每處理隨機(jī)取樣10株測(cè)量生根數(shù)，取平均值。

1.2.10 育苗大田定植 移栽的試管苗或扦插苗根系發(fā)育良好后，停止肥水5 d左右煉苗，選擇陰天或晴天傍晚，帶根定植于大田，密度約4 000株/667m2。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同莖尖大小成苗率和CMV檢出率

接種于不添加激素的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)30 d后，莖尖大多生成愈傷組織，轉(zhuǎn)到MS+2.0 mg 6-BA培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)30 d左右后，生長(zhǎng)出小苗，其中部分生根。統(tǒng)計(jì)其成苗率和取其葉片檢測(cè)CMV，結(jié)果見(jiàn)表3。其中成苗率=（成苗數(shù)／接種數(shù)）×100%，脫毒率=（1－CMV 檢出數(shù)／成苗數(shù)）×100%。

表3 不同莖尖大小成苗率和CMV檢出率

從表3中可以看出，不同莖尖大小的成苗率和病毒檢出率差異很大，莖尖越小，成苗率越低，但脫毒效果越好。其中0.8 mm大小的莖尖成苗最為容易，成苗率高達(dá)83.7%，但幾乎不能脫除病毒，其中只有一株未能檢出CMV，脫毒率僅為1.4%。0.5 mm的莖尖成苗率為34.8%，脫毒效果較為明顯，達(dá)到了29.2%（見(jiàn)圖1）。而0.2 mm的莖尖成苗率雖然很低，只有13.7%，但脫毒效果最好，沒(méi)有檢出CMV，脫毒率達(dá)到100%。

圖1 部分0.5 mm莖尖培養(yǎng)植株CMV RT-PCR檢測(cè)

為防止連續(xù)無(wú)性繁殖可能導(dǎo)致的病毒積累而退化的問(wèn)題，對(duì)栝蔞進(jìn)行脫毒培養(yǎng)是必要的。但栝蔞的主要病毒種類不是很清楚，本試驗(yàn)以大田中感染較為普遍的黃瓜花葉病毒作為標(biāo)志性病毒，人工接種后，通過(guò)檢測(cè)莖尖培養(yǎng)對(duì)黃瓜花葉病毒的脫除效果，來(lái)評(píng)價(jià)整體脫毒效果。莖尖培養(yǎng)脫毒的原因是小莖尖分生組織尚未形成微管束，病毒無(wú)法移動(dòng)感染，因此，在一定大小的莖尖下CMV不能感染，以至其他病毒也不能感染，表明以CMV作為脫毒標(biāo)志應(yīng)該是可行的。也就是說(shuō)，如果該方法能有效脫除黃瓜花葉病毒，那么同樣也能脫除其他病毒（如果存在的話）。據(jù)此可以認(rèn)為，采用0.2 mm大小的莖尖培養(yǎng)，能有效脫除栝蔞病毒，獲得無(wú)病毒苗。

2.2 不同激素配比對(duì)栝蔞愈傷組織誘導(dǎo)的影響

栝蔞外植體接種在添加如表1所示不同濃度激素MS培養(yǎng)基上，培養(yǎng)約10 d時(shí)，所有培養(yǎng)基上的莖尖和莖切段基部均有淡黃色的愈傷組織形成。繼續(xù)培養(yǎng)約10 d，形成的愈傷組織開(kāi)始分化出淡綠色芽點(diǎn)，但不同激素配比培養(yǎng)基培養(yǎng)的效果不同（見(jiàn)表 4）。

表4 不同培養(yǎng)基接種20 d后愈傷組織誘導(dǎo)效果

培養(yǎng)結(jié)果表明，添加適宜濃度的NAA有利于愈傷組織的形成，但添加0.5 mg/L與1.0 mg/L的6-BA效果并無(wú)明顯差異。觀察發(fā)現(xiàn)，在添加0.4 mg/L和0.6 mg/L NAA的MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)形成的愈傷組織較大，色澤較淡而明亮，是較優(yōu)激素配比。而較高濃度的NAA則抑制愈傷組織的生長(zhǎng)。

2.3 不同激素配比對(duì)栝蔞愈傷組織叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)的影響

將栝蔞0.5 cm大小愈傷組織小塊接種到表2所示不同激素配比的MS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)10 d后，絕大多數(shù)愈傷組織分化出3個(gè)左右小芽，各處理間差異不明顯。培養(yǎng)20 d后的叢生芽誘導(dǎo)情況見(jiàn)表5。結(jié)果表明，Ⅶ號(hào)激素配比培養(yǎng)基（6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L）效果最佳，其誘導(dǎo)的叢芽數(shù)目相對(duì)較多，生長(zhǎng)速度快，植株健壯，長(zhǎng)勢(shì)良好（見(jiàn)圖2）。

圖2 叢生芽誘導(dǎo)效果

當(dāng)培養(yǎng)基中6-BA濃度較低時(shí)，叢生芽生長(zhǎng)速度較慢，節(jié)間較短；而濃度偏高時(shí)，腋芽發(fā)育，也抑制叢生芽的生長(zhǎng)速度。較低濃度NAA（0.2 mg/L）也有促進(jìn)叢生芽生長(zhǎng)的效果，但濃度較高且6-BA濃度偏低時(shí)，愈傷組織生長(zhǎng)并分化出根系，叢生芽生長(zhǎng)緩慢，節(jié)間短縮。

表5 不同激素配比對(duì)栝蔞愈傷組織叢生芽的誘導(dǎo)效果

2.4 繼代培養(yǎng)效果

有研究表明，組織培養(yǎng)通過(guò)愈傷組織分化再誘導(dǎo)成苗，雖然繁殖系數(shù)高，但有變異退化的風(fēng)險(xiǎn)。特別是重復(fù)地進(jìn)行誘導(dǎo)愈傷組織—分化—誘導(dǎo)—分化的過(guò)程，這種風(fēng)險(xiǎn)將顯著增加。

作為工廠化脫毒苗生產(chǎn)，繁殖代數(shù)高，為了避免變異退化的風(fēng)險(xiǎn)，選擇了利用葉芽增殖的方式，即類似于試管扦插，雖然繁殖系數(shù)較低，但加代時(shí)間較短，總體增殖速度與愈傷組織培養(yǎng)途徑基本相當(dāng)。

兩種配方的繼代培養(yǎng)基都表現(xiàn)良好，之間沒(méi)有明顯差異。接種的莖節(jié)沒(méi)有產(chǎn)生大的愈傷組織，而葉芽都萌發(fā)生長(zhǎng)，幼苗及葉芽健壯無(wú)畸變，生活力高（見(jiàn)圖3）。幼苗生長(zhǎng)速度快，在第15天左右可生長(zhǎng)2～3節(jié)，即可按單節(jié)莖段分切繼代，完成一個(gè)繁殖周期。

圖3 MS+6-BA 2.0 mg/L培養(yǎng)基繼代產(chǎn)生的腋芽

因?yàn)閮煞N培養(yǎng)基培養(yǎng)效果無(wú)明顯差異，故選擇較為簡(jiǎn)單的MS+6-BA 2.0 mg/L作為最適繼代培養(yǎng)基。

2.5 生根培養(yǎng)效果

1/2 MS添加不同濃度NAA的培養(yǎng)基對(duì)栝蔞苗根系誘導(dǎo)效果見(jiàn)表6。

表6 不同激素濃度對(duì)栝蔞根系的誘導(dǎo)效果

由表6及圖3可知，將無(wú)根苗接種到1/2MS+NAA 0.2 mg/L培養(yǎng)基上，單株根分化較多，形成的白色根系較發(fā)達(dá)，生長(zhǎng)旺盛，根毛多，愈傷組織小。隨NAA濃度的增加，生根率下降，且不定根根毛較少、不發(fā)達(dá)、根生長(zhǎng)緩慢，短粗，脆而易斷，愈傷組織發(fā)達(dá)，根部分泌物增加。因此，添加0.2 mg/L NAA的MS培養(yǎng)基是最適宜于誘導(dǎo)栝蔞試管苗生根的培養(yǎng)基。

另外，從不同大小外植體誘根效果觀察中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)外植體幼苗小于3節(jié)時(shí)，會(huì)出現(xiàn)和高濃度NAA類似的誘導(dǎo)效果，即愈傷組織發(fā)達(dá)，根系短粗而脆，苗生長(zhǎng)緩慢。因此，在進(jìn)行誘根處理時(shí)，保證外植體大于3節(jié)是非常必要的。

2.6 試管苗移栽與大田定植的成活率

試管生根苗移栽至塑料大棚珍珠巖中，成活率與苗的大小關(guān)系較大。據(jù)觀察，5節(jié)以上健壯植株，只要嚴(yán)格按要求操作，移栽成活率即可高達(dá)95%以上。3節(jié)以下的小苗成活率較低，在50%左右。特別注意的是移栽后前3～5 d，保持濕度是關(guān)鍵。

移栽的試管苗或扦插苗新根大量發(fā)生后，停止肥水5 d左右煉苗，選擇陰天或晴天傍晚，定植于大田，密度約4 000株/667m2。移栽后15 d左右，植株發(fā)生大量新根，并進(jìn)入快速生長(zhǎng)期，煉苗后，可選擇陰天或晴天傍晚定植于大田，觀察統(tǒng)計(jì)成活率在95%左右。

育苗大田定植在4～9月皆可進(jìn)行，一般7月前定植者，需要控制肥水以避免藤蔓生長(zhǎng)過(guò)旺。調(diào)查表明，肥水較好的田塊，種根反而較小，而未施肥灌水地塊，種根直徑基本在2.5 cm以上。8～9月后定植的田塊，則應(yīng)保證肥水供應(yīng)，種根直徑在2 cm左右。

2.7 插穗及處理方式對(duì)扦插生根率的影響

于扦插后10 d，觀察插穗生根狀況，其結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 不同插穗及處理方法對(duì)扦插生根率的影響

從表7可以看出，不同插穗來(lái)源扦插生根能力差異極為顯著，來(lái)源于組培苗的插穗生根率均高于80%，平均達(dá)91.8%，而來(lái)源于大田兩年生苗的插穗，生根率均低于12%。觀察發(fā)現(xiàn)，該類插穗切口少有愈傷組織發(fā)生，易于褐化腐爛，可能是其木質(zhì)化程度高，難以分化，且大田中植株病菌較多所致。

以0.2%生根粉浸泡組培苗插穗，不同浸泡時(shí)間對(duì)插穗根系發(fā)生亦有較為明顯的影響，其差異主要體現(xiàn)在根量和根系生長(zhǎng)活力上，在生根率方面差異不大，基本在90%以上。其中處理1h的效果最好，生根率達(dá)到94.5%，根系最為發(fā)達(dá)，根量多而細(xì)長(zhǎng)，根毛著生多，根系活力高。浸泡時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，發(fā)根量稍少，根系生長(zhǎng)速率緩慢，根變粗，根毛減少。未用生根劑處理的空白對(duì)照（組培苗）生根率也能達(dá)到95%，只是根系比較短，根量比較少。

3 總結(jié)

根據(jù)以上試驗(yàn)結(jié)果，就栝蔞無(wú)毒苗組培快繁技術(shù)體系要點(diǎn)總結(jié)如下：

（1）無(wú)毒苗獲得。選優(yōu)良單株，取0.2 mm莖尖，于MS培養(yǎng)基（不添加激素）中培養(yǎng)45 d后，轉(zhuǎn)到MS+0.4 mg/L 6-BA+0.6 mg/L NAA的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)愈傷組織。將愈傷組織分割成0.5 cm的小塊，接種到MS+3.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA的MS叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，獲取大量無(wú)毒叢生芽。

（2）無(wú)毒苗試管苗繼代增殖。將叢生芽按節(jié)切段，以MS＋6-BA 2.0 mg/L為培養(yǎng)基，通過(guò)葉芽進(jìn)行重復(fù)繼代增殖。

（3）生根移栽。將3節(jié)以上的繼代增殖試管苗于1/2MS+NAA 0.2 mg/L培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根。小苗5節(jié)以上時(shí)，煉苗2～3 d后，移栽至珍珠巖基質(zhì)中，溫度>15℃，微噴系統(tǒng)噴霧保濕，一周后，隨著幼苗新根發(fā)生，逐步停止噴霧，期間每天噴霧營(yíng)養(yǎng)液5 min（1/2園試無(wú)土栽培配方）進(jìn)行葉面施肥。

（4）扦插擴(kuò)繁。剪取移栽組培苗帶有2～3葉的莖尖或側(cè)枝作為插穗，用0.2%生根粉浸泡插穗1 h，扦插于珍珠巖基質(zhì)苗床上，管理方式同上。

（5）大田定植。扦插20 d左右后，選擇陰天或晴天傍晚，帶根定植于大田，密度（株行距）30 cm×30 cm。一般7月前定植者，需要控制肥水以避免藤蔓生長(zhǎng)過(guò)旺，8～9月后定植的田塊，則應(yīng)保證肥水供應(yīng)。待12月地上部枯死后，挖出種根，陽(yáng)光下曬2～3 d 后，室內(nèi)儲(chǔ)存。

本研究的特點(diǎn)是用莖尖培養(yǎng)脫除病毒后，利用腋芽進(jìn)行繼代增殖，盡可能防止退化變異。組培苗采用扦插擴(kuò)繁，大大降低了成本。目前該栝蔞脫毒苗繁育體系已經(jīng)運(yùn)轉(zhuǎn)4 a，累計(jì)推廣脫毒苗近30萬(wàn)株，田間普遍表現(xiàn)生長(zhǎng)勢(shì)旺盛，單株結(jié)果數(shù)明顯高于多年生苗和實(shí)生苗，受到廣大栝蔞種植戶的歡迎。

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