基于線粒體COI及Cytb基因的4種鱚科魚類系統(tǒng)發(fā)育研究3

薛泰強(qiáng),杜 寧,高天翔

(中國海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院,山東青島266003)

研究簡報(bào)

基于線粒體COI及Cytb基因的4種鱚科魚類系統(tǒng)發(fā)育研究3

薛泰強(qiáng),杜 寧,高天翔33

(中國海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院,山東青島266003)

采集中國近海分布的多鱗鱚(Sillago sihamaForskǎl)、少鱗鱚(S.japonicaTemminck and Schlegel)、斑鱚(S. aeolusJordan and Evrmann)及澳大利亞南部海域的銀鱚(S.bassensisCuvier)等4種鱚科(Sillaginidae)魚類樣品,對(duì)其線粒體COI及Cytb基因片段進(jìn)行了擴(kuò)增和序列測(cè)定,分析比較了不同鱚屬魚類種間的序列差異。研究結(jié)果表明,4種鱚屬魚類COI基因片段序列長度均為610 bp,A+T平均含量略大于G+C含量,分別為52.9%和47.1%;Cytb基因片段序列長度均為402 bp,A+T平均含量大于G+C含量,分別為53.7%和46.3%。4種鱚科魚類種內(nèi)沒有序列差異或變異極小,而種間差異遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于種內(nèi)差異;Cytb基因系統(tǒng)樹支持了形態(tài)學(xué)研究的結(jié)果;其種間遺傳距離在0.225～0.286之間。根據(jù)Cytb基因每百萬年2%的分歧速率計(jì)算,多鱗鱚與少鱗鱚的分歧時(shí)間約為1 140萬年,少鱗鱚與斑鱚的分歧時(shí)間約在1 115萬年,其分化事件均發(fā)生在中新世(Miocene)。根據(jù)遺傳距離構(gòu)建的系統(tǒng)樹表明,多鱗鱚與少鱗鱚親緣關(guān)系較近,而與銀鱚較遠(yuǎn)。

鱚科;COI;Cytb;系統(tǒng)發(fā)育;分化年代

鱚科(Sillaginidae)魚類屬于硬骨魚綱(Osteich2 thyes)、鱸形目(Perciformes),主要分布于太平洋西岸及印度洋,屬近岸種。鱚科魚類肉質(zhì)十分細(xì)嫩,深受當(dāng)?shù)鼐用裣矏?許多種類在其分布區(qū)為經(jīng)濟(jì)魚種[1]。中國近海分布的鱚科魚類僅報(bào)道有鱚屬(Sillago)1屬、3種,包括斑鱚(Sillago aeolusJordan and Evrmann)、少鱗鱚(Sillago japonicaTemminck and Schlegel)和多鱗鱚(Sillago sihamaForsk…l)3個(gè)種[2]。到目前為止,國內(nèi)學(xué)者對(duì)多鱗鱚的食性和營養(yǎng)級(jí)、室內(nèi)養(yǎng)殖試驗(yàn)、早期發(fā)育形態(tài)觀察和外周血細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)觀察等進(jìn)行了研究[326],國外學(xué)者主要開展了鱚科魚類的形態(tài)學(xué)分類的研究,日本學(xué)者對(duì)于日本國內(nèi)將少鱗鱚誤認(rèn)為多鱗鱚的錯(cuò)誤進(jìn)行了修正,此外還對(duì)館山灣(Tateyama Bay)少鱗鱚的年齡和生長、纖鱚(S.ciliata)仔魚鰾膨脹系數(shù)等進(jìn)行了研究[729]。關(guān)于鱚科魚類的遺傳學(xué)研究報(bào)道極少,迄今GenBank中尚未見登錄的Cytb基因序列。

動(dòng)物線粒體DNA(mtDNA)具有分子量小、進(jìn)化速度快、結(jié)構(gòu)簡單和母性遺傳等特點(diǎn),已被廣泛應(yīng)用于分子遺傳學(xué)的研究,尤其是在近緣種間和種內(nèi)群體間的遺傳分化研究方面更具優(yōu)勢(shì)[10211]。本文以采自我國近海的斑鱚、少鱗鱚和多鱗鱚及澳大利亞南部海域的銀鱚(Sillago bassensis)作為研究對(duì)象,對(duì)這4種鱚科魚類線粒體DNA的COI及Cytb基因片段進(jìn)行了PCR擴(kuò)增和序列測(cè)定,分析比較了其種間變異程度及親緣關(guān)系,以期為鱚科魚類分類地位及物種多樣性研究提供基礎(chǔ)依據(jù),其研究結(jié)果對(duì)鱚科魚類準(zhǔn)確鑒定及其漁業(yè)管理也具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

斑鱚樣品于2009年4月采自廣東大亞灣,少鱗鱚樣品于2009年6月采自福建廈門近海,多鱗鱚樣品于2009年4月采自廣東大亞灣,銀鱚樣品于2008年7月采自澳大利亞南部海域。實(shí)驗(yàn)中每種各取4尾,取肌肉組織后-70℃以下保存,以備DNA提取。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA提取 取樣品肌肉100 mg左右,用傳統(tǒng)的酚2氯仿法提取基因組DNA,-20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 COI及Cytb片段PCR擴(kuò)增 用于擴(kuò)增COI和Cytb基因片段的引物序列分別為:L59562COI(5’2 CACAAAGACATT GGCACCCT23’)和H65582COI (52CCTCCTGCA GGGTCAAAGAA-3’)、L14734 (5’2AACCAC CGTTGTTATTCAACT23’)和CYTB (5’2CTCAGAATGACATTTGTCCTCA23’)[12]。PCR擴(kuò)增在Biometra擴(kuò)增儀上進(jìn)行,COI基因片段擴(kuò)增反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性4 min;94℃45 s,52℃40 s,72℃45 s,30個(gè)循環(huán);72℃延伸15 min;Cytb基因片段擴(kuò)增反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性4 min;94℃40 s,52℃40 s,72℃50 s,30個(gè)循環(huán);72℃延伸15 min。

反應(yīng)總體積25μL,其中包含10×Buffer 5μL, dNTP 2μL,引物各1μL,Taq DNA聚合酶0.15μL,及DNA模板1μL,其余用去離子水補(bǔ)至25μL。取PCR產(chǎn)物2μL在1.5%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳,紫外燈觀察并拍照記錄。

1.2.3 PCR產(chǎn)物回收測(cè)序 PCR產(chǎn)物使用膠回收試劑盒(Axgen公司)純化,取適量純化產(chǎn)物作為測(cè)序反應(yīng)的模板,送上海桑尼生物科技有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序,以確保序列的準(zhǔn)確。

1.2.4 序列分析 使用Lasergene 7軟件包比對(duì)序列,DNASP[13]軟件檢測(cè)多態(tài)位點(diǎn)(Polymorphic sites)、簡約信息位點(diǎn)數(shù)(Parsimony informative sites)和序列的堿基組成。使用Modeltest 3.7[14]軟件進(jìn)行模型篩選,得到最佳替代模型并計(jì)算相關(guān)參數(shù)。應(yīng)用MEGA 4.1[15]軟件將Cytb蛋白質(zhì)編碼基因核苷酸序列的密碼子轉(zhuǎn)化為氨基酸序列,分析氨基酸組成并計(jì)算遺傳距離?；卩徑臃?NJ)、最大簡約法(MP)[16]和貝葉斯法(Bayes)[17]重建COI及Cytb基因片段的系統(tǒng)樹。

2 結(jié)果

2.1 替代模型選擇和參數(shù)估計(jì)

Modeltest分析結(jié)果顯示,NJ、Bayes法構(gòu)建4種鱚科魚類COI基因片段系統(tǒng)樹的最適核苷酸替代模型均為HKY+G(hLRTs),并得到模型相關(guān)參數(shù),包括模型的似然值自然對(duì)數(shù)的負(fù)數(shù)(-lnL=1847.4840)、K值(5)及Gamma分布的形狀參數(shù)(G=0.2011)。

NJ法構(gòu)建4種鱚科魚類Cytb基因片段系統(tǒng)樹,最適核苷酸替代模型為HKY+I+G(hLRTs),并得到模型相關(guān)參數(shù),包括模型的似然值自然對(duì)數(shù)的負(fù)數(shù)(-lnL=1 276.450 0)、K值(6)、不變位點(diǎn)比率(I= 0.432 0)和Gamma分布的形狀參數(shù)(G=0.158 2)。

Bayes法構(gòu)建4種鱚科魚類Cytb基因片段系統(tǒng)樹,最適核苷酸替代模型為GTR+G(hLRTs),得到的模型相關(guān)參數(shù)為,似然值自然對(duì)數(shù)的負(fù)數(shù)(-lnL= 1 273.326 3)、K值(9)、Gamma分布的形態(tài)參數(shù)(G= 0.148 9)。

2.2 基因序列分析

2.2.1 COI基因序列分析 擴(kuò)增得到4種鱚科魚類的mtDNA COI基因片段長度為610 bp,經(jīng)比對(duì)、校正后的序列提交GenBank,登錄號(hào)為HM1314712 HM131486。

4種鱚科魚類COI基因片段序列中,銀鱚存在3個(gè)單倍型,少鱗鱚存在4個(gè)單倍型,斑鱚和多鱗鱚種內(nèi)個(gè)體間均無堿基差異。共發(fā)現(xiàn)178個(gè)多態(tài)位點(diǎn),約占35.6%;217個(gè)核苷酸替代(Nucleotide substitution),其中158個(gè)為轉(zhuǎn)換(Transition),59個(gè)為顛換(Trans2 version),轉(zhuǎn)換顛換比(Ts/Tv)約為2.68;無插入缺失。平均堿基含量分別為A 30.0%,T 22.9%,C 19.3%, G 27.8%;4種鱚科魚類COI基因片段的A、T、C和G的平均含量分別為銀鱚32.0%,23.6%,18.5%, 25.9%,斑鱚28.4%,22.8%,20.3%,28.5%,少鱗鱚30.5%,23.0%,19.1%,27.5%,多鱗鱚29.0%, 22.5%,19.0%,29.5%。A+T略有差異,但高于G+ C(見圖2)。

利用軟件重建COI基因片段NJ、MP及Bayes系統(tǒng)樹,3種系統(tǒng)樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)一致,多鱗鱚先與斑鱚聚為一支,再與少鱗鱚聚為一支,最后與銀鱚聚類(見圖1)。

圖1 基于COI基因片段序列的4種鱚科魚類系統(tǒng)樹(Bootstrap檢驗(yàn)值依次為NJ/MP/Bayes)Fig.1 Phylogenetic tree of Sillaginidae species based on COI gene sequence(The bootstrap value showed in order of NJ/MP/Bayes)

由Kimura雙參數(shù)法計(jì)算種間遺傳距離,得到斑鱚與銀鱚之間的遺傳距離最大,多鱗鱚與銀鱚之間的遺傳距離最小。

表1 基于Cytb基因序列的4種鱚科魚類種間凈遺傳距離Table 1 Interspecific genetic distances in 4 Sillaginidae species based on COI gene sequences

2.2.2 Cytb基因序列分析 擴(kuò)增得到4種鱚科魚類的線粒體基因片段長度為416 bp,通過同源序列比對(duì),選取長度為402 bp的Cytb基因片段序列進(jìn)行分析。所測(cè)序列均已提交GenBank,登錄號(hào)為HM1314552 HM131470。

圖3 4種鱚科魚類Cytb基因片段核苷酸序列比較Fig.3 Nudeotide alignment of partial Cytbgene of 4 Sillaginidae species

4種鱚科魚類Cytb基因片段序列中,銀鱚存在2個(gè)單倍型,少鱗鱚存在3種單倍型,斑鱚和多鱗鱚種內(nèi)個(gè)體間均無堿基差異。共發(fā)現(xiàn)131個(gè)多態(tài)位點(diǎn),約占32.3%,全部為多變異位點(diǎn);163個(gè)核苷酸替代(Nucle2otide substitution),其中112個(gè)為轉(zhuǎn)換(Transition), 51個(gè)為顛換(Transversion),轉(zhuǎn)換顛換比(Ts/Tv)約為2.20;無插入缺失。平均堿基含量分別為A 23.3%,T 30.4%,C 28.7%,G 17.6%;4個(gè)種類Cytb片段的A、T、C和G的平均含量分別為銀鱚24.5%,31.8%, 26.7%,17.0%,斑鱚22.1%,28.4%,31.3%,18.2%,少鱗鱚24.1%,31.5%,27.5%,17.4%,多鱗鱚22.4%,30.1%,29.9%,17.7%。A+T含量趨勢(shì)與COI基因片段結(jié)果相似,與其他魚種Cytb基因研究結(jié)果一致[18219](見圖3)。

編碼基因部分片段中,大部分突變?yōu)橥x突變(Synonymous substitution),最普遍的核苷酸替換是發(fā)生在密碼子第三位上的轉(zhuǎn)換,131處突變中有117發(fā)生于密碼子第三位點(diǎn),11處位于密碼子第一位點(diǎn),3處位于密碼子第二位點(diǎn)。在Cytb基因134個(gè)氨基酸的序列上,4種間檢測(cè)到7處氨基酸替代(amino acid substitution),其中4處由密碼子第一位點(diǎn)上的核苷酸替代引起,3處由密碼子第二位點(diǎn)上的核苷酸替代引起,不存在由密碼子第三位點(diǎn)上的核苷酸替代引起的氨基酸替代(見圖4)。

圖4 4種鱚科魚類Cytb氨基酸序列比較Fig.4 The amino acid sequences alignment of portial cytbgene of 4 Sillaginidae species

利用軟件重建Cytb基因片段NJ、MP及Bayes系統(tǒng)樹,其拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)一致,多鱗鱚先與少鱗鱚聚類,再與斑鱚聚類,最后與銀鱚聚類,與COI基因片段的系統(tǒng)樹結(jié)構(gòu)不一致(見圖5)。2.3幾種鱚屬魚類種間的分化年代

圖5 基于Cytb基因片段序列(左:Bootstrap檢驗(yàn)值依次為NJ/MP/Bayes)和形態(tài)特征構(gòu)建(右:仿中坊徹次、Mckay等)的鱚科魚類系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic trees of Sillaginidae species based on Cytbgene sequence (left,The bootstrap value showed in order of NJ/MP/Bayes)and morphology data(right,from Nakabo,McKay,et al.)

表2 基于Cytb基因序列的4種鱚科魚類種間遺傳距離Table 2 Interspecific genetic distances in 4 Sillaginidae species based on Cytbgene sequences

由Kimura雙參數(shù)法計(jì)算得到種間凈遺傳距離(見表2),結(jié)果顯示銀鱚與我國的3種鱚魚間的差異較大,最大凈遺傳距離為0.285;多鱗鱚與少鱗鱚的凈遺傳距離為0.228,少鱗鱚與斑鱚間的凈遺傳距離為0.223,多鱗鱚與斑鱚間凈遺傳距離為0.247。將每百萬年2%的核苷酸分歧速率[11]應(yīng)用于4種鱚科魚類的Cytb基因片段上,得到多鱗鱚與少鱗鱚的分歧時(shí)間約為1 140萬年,少鱗鱚與斑鱚的分歧時(shí)間約在1 115萬年,而多鱗鱚與斑鱚的分歧時(shí)間約在1 235萬年。鱚科魚類種間分化事件均發(fā)生在中新世(Micene)。姐妹群的種類作為外群對(duì)照研究,但是鱚科魚類在鱸形目中處于非常特殊的地位,至今無法確認(rèn)其姐妹群[1],因此,僅對(duì)4個(gè)種進(jìn)行了研究。

4種鱚科魚類不同種間的Cytb凈遺傳距離在0.223～0.285之間,銀鱚與多鱗鱚的遺傳距離最大,斑鱚與少鱗鱚之間的遺傳距離最小,種內(nèi)的遺傳距離為0或極小。分子鐘假說認(rèn)為,某一特定大分子(蛋白質(zhì)或DNA分子)在所有的世系(Lineage)中,核苷酸替代速率在時(shí)間上是穩(wěn)定的?；诓溉閯?dòng)物的研究數(shù)據(jù),目前許多研究者將每百萬年2%的核苷酸分歧速率應(yīng)用于Cytb基因片段序列來研究硬骨魚類的分化年代[21223]。推算4種鱚科魚類間的分化事件在1 115～1 425萬年前,成種事件發(fā)生于中新世(Miocene)。Schwarzhans研究指出鱚科魚類很可能于始新世晚期(Lower Eocene)起源于特提斯海(Tethys Sea,古地中海),在中新世,許多印度洋-太平洋的鱚科魚類發(fā)展成為了當(dāng)?shù)胤N。德國及法國發(fā)現(xiàn)的耳石化石可以從中新世晚期(Lower Miocene)追溯到漸新世早期(Upper Oligocene)[1]。本文基于線粒體Cytb基因片段得到的結(jié)果支持了上述結(jié)論。

4種核苷酸在線粒體基因組中分布不均一是動(dòng)物線粒體基因組的共性[24]。本研究得到的Cytb基因片段核苷酸組成中的鳥嘌呤(G)含量普遍較低,4種鱚科魚類的的Cytb蛋白質(zhì)編碼基因第三密碼子位點(diǎn)的核苷酸組成存在較大偏倚(Bias),C的平均含量為41.0%;而G的平均含量只有9.1%。在其他魚類中, Cytb基因片段核苷酸組成分析的結(jié)果也顯示G含量普遍較低,這一點(diǎn)在密碼子第三位點(diǎn)上尤為明顯[25227]。對(duì)于編碼重要功能蛋白質(zhì)的Cytb基因來說,由于在DNA水平上受自然選擇壓力的影響,密碼子第三位點(diǎn)的突變率高于第一和第二位點(diǎn),而且密碼子第三位點(diǎn)的突變絕大多數(shù)是同義突變,受自然選擇壓力較小,突變后易固定,所以密碼子第三位點(diǎn)能夠更清晰地表明線粒體基因組核苷酸組成的不均一性[21],而第一、第二位點(diǎn)則相反。

密碼子第三位點(diǎn)上的突變很少導(dǎo)致氨基酸替代(同義替代),所以比導(dǎo)致氨基酸替代的突變(非同義替代)積累得快得多,最常見的突變是密碼子第三位點(diǎn)上的轉(zhuǎn)換,其次是第一密碼子位點(diǎn)上的無義轉(zhuǎn)換和密碼子第三位點(diǎn)上的顛換[21]。本研究中Cytb作為編碼重要蛋白質(zhì)的基因片段,在編碼的134個(gè)氨基酸序列上,由于密碼子第一位點(diǎn)的非同義替代造成4處氨基酸替代,3處由密碼子第二位點(diǎn)上的核苷酸替代引起,不存在由密碼子第三位點(diǎn)上的核苷酸替代導(dǎo)致的氨基酸替代,與其他學(xué)者的研究結(jié)果基本一致[21]。

目前,不同鱚科魚類的種類鑒定主要依靠形態(tài)學(xué)

3 討論

鱚科魚類僅分布于太平洋西岸及印度洋,共3屬31種,其中最大的為鱚屬,共有29種。本文研究的4種魚類均屬于鱚科、鱚屬[122]。關(guān)于鱚科魚類的分類和系統(tǒng)發(fā)育的研究,目前國內(nèi)及國外的研究都局限于形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)上的分類,如中坊徹次和林公義等對(duì)日本分布的鱚科魚類進(jìn)行了形態(tài)學(xué)研究[20],Mckay等對(duì)全世界鱚科魚類的形態(tài)學(xué)分類進(jìn)行了描述[1],迄今尚未見相關(guān)遺傳學(xué)報(bào)道。本文測(cè)定多鱗鱚、少鱗鱚、斑鱚和銀鱚線粒體DNA的COI及Cytb基因片段序列,分析結(jié)果顯示2個(gè)基因片段在4種鱚科魚類種間的差異均十分明顯,適用于鱚科魚類種類鑒定。

本文使用NJ、MP和Bayes 3種方法構(gòu)建的系統(tǒng)樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)一致,但2個(gè)基因片段系統(tǒng)樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)不完全一致。COI基因片段系統(tǒng)樹顯示,多鱗鱚先與斑鱚聚為一支,再與少鱗鱚聚為一支,最后為銀鱚。而Cytb系統(tǒng)樹則顯示多鱗鱚先與少鱗鱚聚為一支,再與斑鱚聚為一支,然后與銀鱚聚類?；贑ytb基因片段構(gòu)建的系統(tǒng)樹與Mckay和中坊徹次等基于形態(tài)特征建立的系統(tǒng)樹完全吻合,支持了形態(tài)學(xué)分類的結(jié)果[1,20],可能其結(jié)果更加貼近真實(shí)情況,Cytb片段應(yīng)更適合于鱚科魚類的系統(tǒng)發(fā)育研究。實(shí)驗(yàn)中本應(yīng)使用特征,但由于鱚科魚類的外形、體色十分相似,形態(tài)特征差異很小,且生活習(xí)性也基本類似,均為近岸底棲的小型魚類,所以在分類上存在一定的混亂,很多真正存在的種類,極有可能被一些廣布種所掩蓋,成為隱藏種而未被發(fā)現(xiàn)[1]。本文的研究結(jié)果顯示,各種鱚科魚類線粒體COI及Cytb基因均十分保守,能夠很好的區(qū)分這些種類。今后可以作為DNA條形碼應(yīng)用于鱚科魚類的分子分類研究,其準(zhǔn)確度將會(huì)大大提高。

鱚科下屬的種類繁多,目前僅對(duì)這4種鱚魚的兩個(gè)線粒體DNA基因片段進(jìn)行了序列測(cè)定分析。盡可能收集鱚科魚類樣品,從形態(tài)特征和分子生物學(xué)2個(gè)方面進(jìn)行深入研究,結(jié)合鱚科魚類的地理分布,才能更系統(tǒng)、更準(zhǔn)確地探討它們的起源、分化及地理分布格局的成因。

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責(zé)任編輯 于 衛(wèi)

Phylogenetic Relationships of 4 Sillaginidae Species Based on Partial Sequences of COI and Cytochrome b Gene

XUE Tai2Qiang,DU Ning,GAO Tian2Xiang
(College of Fishery,Ocean University of China,Qingdao 266003,China)

In order to identify the differentiation of species of Sillaginidae fishes,sequence comparison of mtDNA COI and cytochromeb(Cytb)gene fragments were employed forSillago sihama,S.jamonica, S.aeolus(from China),S.bassensis(from Australia).Nucleotide sequences of 610 bp were obtained in COI gene;the percentage of A+T content was little higher than C+G,it’s 52.9%and 47.1%respective2 ly.The nucleotide sequences of Cytbgene were 402bp;the percentage of A+T content was higher than C+G,it’s 53.7%and 46.3%respectively.Sequence analysis indicated that the variation level of inter2 species was high.The phylogenetic tree based on Cytbgene supports morphology results;the estimated time of divergence betweenS.sihama and S.japonicawas 11.40 million years ago,betweenS.japonica andS.aeolus was11.15 million years ago.The result indicated a Miocene divergence of the four species. Based on the genetic distances,phylogenetic tree was made and indicated that the genetic distance between S.aeolusandS.japonicawas minimum among 4 species,and the genetic distance betweenS.bassensis andS.sihamawas maximum.

Sillaginidae;COI;Cytb;phylogeny;divergence time

book=40,ebook=13

Q959.483

A

167225174(2010)09Ⅱ2091208

海洋公益性行業(yè)科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目(20090501922)資助

2009201214;

2010204215

薛泰強(qiáng)(19842),男,碩士生。E2mail:jerry_xue@yahoo.cn

33通訊作者:E2mail:gaozhang@ouc.edu.cn