環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在轉(zhuǎn)基因飼料成分檢測(cè)中的應(yīng)用

內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院 田 芳

農(nóng)業(yè)部飼料生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所基因工程研究室 王秀敏 滕 達(dá) 楊雅麟 敖長(zhǎng)金 王建華＊

目前全球種植面積最廣泛的商業(yè)化轉(zhuǎn)基因作物為大豆、玉米、棉花和油菜，2009年全球轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物播種面積達(dá)3.3億英畝。在美國，約91%大豆作物、85%玉米作物均為轉(zhuǎn)基因品種（Clive James，2009），60% ～70%飼料原料由轉(zhuǎn)基因作物及其副產(chǎn)品組成（OECD，2003）。2009年，美國向中國出口的3130萬噸大豆幾乎全部為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品，隨著轉(zhuǎn)基因作物在飼料領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，研究新的轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)方法對(duì)我國飼料行業(yè)的科學(xué)監(jiān)管、建立轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標(biāo)識(shí)制度、轉(zhuǎn)基因安全評(píng)價(jià)以及國內(nèi)外貿(mào)易都有重要意義。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增 技 術(shù) （loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是Notomi等（2000）建立的一種新型恒溫核酸擴(kuò)增方法，利用自動(dòng)循環(huán)的鏈置換反應(yīng)，在等溫條件下，不到1 h就能擴(kuò)增出109個(gè)靶序列拷貝。該方法不需PCR儀和昂貴試劑，產(chǎn)物可肉眼觀察（肖斌等，2005），已廣泛應(yīng)用于人畜細(xì)菌、病毒等病原體診斷、動(dòng)物胚胎性別鑒定和轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)等領(lǐng)域 （Zablon等，2010）。 本文在綜述LAMP技術(shù)原理和特點(diǎn)的基礎(chǔ)上，展望了其在飼料檢測(cè)中的應(yīng)用前景。

1 LAMP技術(shù)原理和特點(diǎn)

1.1 LAMP的原理 等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)是針對(duì)靶序列上6個(gè)獨(dú)立區(qū)域 （3′端的F3c、F2c和F1c區(qū)以及5′端B1、B2和B3區(qū)）設(shè)計(jì)4種特異引物，包括兩對(duì)特殊內(nèi)引物 （FIP由F1c和F2組成，F(xiàn)2與靶序列 3′端 F2c區(qū)互補(bǔ)，F(xiàn)1c區(qū)與靶序列 5′端 F1c區(qū)序列相同；BIP由B1c和B2組成，B2與靶序列3′端的B2c區(qū)互補(bǔ)，B1c區(qū)與靶序列 5′端的 B1c區(qū)序列相同）和外引物（F3，與靶序列的F3c區(qū)互補(bǔ)；B3，與靶序列的B3c區(qū)互補(bǔ)），利用一種高活性鏈置換DNA聚合酶（Bst DNA polymerase）在恒溫條件（60～65℃）保溫1 h，即可完成靶基因的高效擴(kuò)增，直接靠擴(kuò)增副產(chǎn)物焦磷酸鎂沉淀的濁度或熒光染料染色后的顏色變化來判斷反應(yīng)結(jié)果（Parida等，2006），4條引物與 6個(gè)區(qū)域的配對(duì)確保了該反應(yīng)的較高特異性 （Fukuta等，2004）。LAMP反應(yīng)包括啞鈴狀模板合成階段、循環(huán)擴(kuò)增階段、伸長(zhǎng)和再循環(huán)階段（Notomi等，2000）。反應(yīng)起始階段，內(nèi)引物BIP的B2序列與模板的B2c區(qū)結(jié)合，在Bst聚合酶作用下延伸復(fù)制一條新鏈，隨后外引物B3與模板的B3c區(qū)結(jié)合，一邊延伸形成互補(bǔ)鏈，一邊置換出內(nèi)引物BIP合成的DNA鏈，最終B3引物形成的DNA鏈與模板DNA形成雙鏈，而最初BIP合成的DNA鏈以單鏈形式被置換出來，其5′末端B1c與該鏈B1互補(bǔ)配對(duì)形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。同時(shí)內(nèi)引物FIP以該單鏈為模板與之結(jié)合形成互補(bǔ)鏈，此時(shí)環(huán)狀結(jié)構(gòu)被打開，接著F3引導(dǎo)合成BIP引物合成鏈的互補(bǔ)鏈，置換出FIP引物合成的鏈，該鏈5′末端進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，以3′末端B1區(qū)為起點(diǎn)，自身為模板進(jìn)行DNA合成延伸，形成啞鈴狀結(jié)構(gòu)，此為L(zhǎng)AMP循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)起始物。在循環(huán)擴(kuò)增階段，以莖環(huán)結(jié)構(gòu)為模板，BIP引物B2與啞鈴結(jié)構(gòu)上B2c雜交結(jié)合，開始新一輪鏈置換合成，同時(shí)從環(huán)狀結(jié)構(gòu)3′端F1區(qū)為起點(diǎn)進(jìn)行DNA合成延伸，同樣置換出的單鏈也會(huì)形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，以3′末端的F1區(qū)為起點(diǎn)，自身為模板進(jìn)行DNA合成延伸及鏈置換，形成長(zhǎng)短不一的兩條新莖環(huán)結(jié)構(gòu)的DNA，F(xiàn)IP引物與其F2c區(qū)結(jié)合，開始新一輪的擴(kuò)增，產(chǎn)物長(zhǎng)度增1倍。如此反復(fù)循環(huán)，形成由不同長(zhǎng)度和不同個(gè)數(shù)花椰菜形狀的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的DNA組成的混合擴(kuò)增產(chǎn)物，且產(chǎn)物DNA為擴(kuò)增靶序列的交替反向重復(fù)序列，電泳圖譜為不同大小區(qū)帶組成的階梯式條帶狀。

1.2 LAMP的特點(diǎn) （1）易操作，速度快。LAMP是等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，無需昂貴儀器，水浴鍋即可，適于醫(yī)療機(jī)構(gòu)和檢測(cè)部門。因無熱變性反應(yīng)可在1 h內(nèi)完成，若添加環(huán)狀引物則可在30 min內(nèi)檢測(cè)到擴(kuò)增產(chǎn)物，且產(chǎn)物可用肉眼觀察或濁度儀檢測(cè)。若加入逆轉(zhuǎn)錄酶，則能實(shí)現(xiàn)RNA一步擴(kuò)增。（2）靈敏度高，特異性強(qiáng)。由于4條引物必須與靶序列上的6個(gè)區(qū)域完全匹配才能保證擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行，因此特異性強(qiáng)。在病毒檢測(cè)中，擴(kuò)增模板可達(dá)1～10個(gè)拷貝，靈敏度極高。有研究表明，LAMP比PCR法更具有選擇性和擴(kuò)增效率，DNA產(chǎn)量可達(dá)500 μg/mL （Seki等，2005）。 （3）引物設(shè)計(jì)方便登陸LAMP技術(shù)在線引物設(shè)計(jì)網(wǎng)站http：//primerexplorer.jp/e/，只需導(dǎo)入靶序列即可自動(dòng)生成優(yōu)化引物，同時(shí)遵循引物設(shè)計(jì)的一般原則。（4）局限性靶序列長(zhǎng)度最好控制在300 bp以下，大于500 bp則較難擴(kuò)增。引物設(shè)計(jì)是LAMP技術(shù)的關(guān)鍵，設(shè)計(jì)不當(dāng)即會(huì)出現(xiàn)假陽性或假陰性，出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增且不易鑒別。由于靈敏度高，操作時(shí)要嚴(yán)謹(jǐn)，避免污染。

2 LAMP技術(shù)的改進(jìn)及其在轉(zhuǎn)基因飼料成分檢測(cè)中的應(yīng)用

2.1 LAMP的技術(shù)改進(jìn) 雖然LAMP方法比PCR反應(yīng)速度快，但是與臨床常用的免疫層析等免疫學(xué)技術(shù)相比，所需時(shí)間還是較長(zhǎng)，為了滿足臨床需要，人們從各方面改進(jìn)并完善LAMP技術(shù)。Nagamine 等（2002）研究表明，通過在 F2、F1 之間和B2、Bl之間增加2條環(huán)狀引物可將LAMP所需的反應(yīng)時(shí)間縮短近一半。同樣，Yano等（2007）在對(duì)腸毒素大腸桿菌的檢測(cè)研究中，通過加入環(huán)狀引物的方式使擴(kuò)增時(shí)間從60 min縮至35 min。由于LAMP反應(yīng)產(chǎn)物可通過凝膠電泳、產(chǎn)物染色和反應(yīng)產(chǎn)物是否渾濁來檢測(cè)，Maeda等 （2006）在對(duì)牙齦卟啉單胞菌的檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，瓊脂糖電泳和SYRB Green I的檢測(cè)極限相近，直接沉淀觀測(cè)法則低10倍。LAMP與其他技術(shù)聯(lián)合使用使得檢測(cè)結(jié)果更為有效。申建維等（2006）研究表明，將核酸雜交和LAMP技術(shù)相結(jié)合，建立了多重分子信標(biāo)LAMP快速檢測(cè)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的方法，在反應(yīng)中兩種不同熒光探針分別與mec A和fem A基因的擴(kuò)增產(chǎn)物互補(bǔ)序列結(jié)合，最后檢測(cè)反應(yīng)管中的兩種熒光值。結(jié)果顯示此方法的最低檢測(cè)限為10 CFU/mL，與藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較，靈敏度99.0%，特異度90.9%，證明該方法靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便快速，適用于臨床樣品的直接快速基因檢測(cè)。

2.2 LAMP在轉(zhuǎn)基因飼料成分檢測(cè)中的應(yīng)用目前，LAMP技術(shù)已逐漸運(yùn)用到轉(zhuǎn)基因作物及其成分的檢測(cè)研究上，如對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆的檢測(cè)。Shiro等 （2004）建立了針對(duì)CaMV-35啟動(dòng)子的LAMP檢測(cè)方法，可在轉(zhuǎn)基因大豆及其產(chǎn)品中檢測(cè)到含量為0.5%～5%的轉(zhuǎn)基因成分。由于95%轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)品含35 S啟動(dòng)子，故該法可初檢轉(zhuǎn)基因成分。蘭青闊等（2008）研究了檢測(cè)轉(zhuǎn)基因抗草甘膦大豆的LAMP技術(shù)，針對(duì)CP4-epsps合成酶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4條特異性引物，建立了針對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆CP4-epsps基因的LAMP檢測(cè)方法，熒光顯色結(jié)果表明該方法能特異性檢測(cè)外源基因，靈敏度是常規(guī)定性PCR方法的10倍，具有高度的特異性及穩(wěn)定性，適合轉(zhuǎn)基因抗草甘膦大豆的快速檢測(cè)。劉彩霞等(2009)優(yōu)化LAMP反應(yīng)條件，快速、靈敏、有效地檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆及加工品中整合的EPSPS基因，檢測(cè)下限為0.01%，低于國際現(xiàn)行最低檢測(cè)量0.5%的要求，可對(duì)抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆及加工品進(jìn)行定性檢測(cè)。Lee等（2009）對(duì)轉(zhuǎn)基因油菜的煙草花葉病毒35 S啟動(dòng)子，胭脂堿合成酶基因啟動(dòng)子和終止子進(jìn)行LAMP檢測(cè)，可從單拷貝模板中檢測(cè)到轉(zhuǎn)基因成分，檢測(cè)限也為0.01%，表明該方法適于多種轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)品的檢測(cè)。

3 小結(jié)

綜上所述，LAMP技術(shù)在簡(jiǎn)便性、快速性和敏感性方面均具優(yōu)勢(shì)，可用于飼料中轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)，但由于飼料成分復(fù)雜，提取高純度的DNA難度加大，而各種飼料加工工藝又使DNA片段在高溫高壓下可能發(fā)生降解，且溫度越高，加熱時(shí)間越長(zhǎng)，降解越明顯（Patrizia等，2009），這些對(duì)外源基因產(chǎn)生的影響，都會(huì)延長(zhǎng)檢測(cè)周期，影響檢測(cè)結(jié)果。因此針對(duì)外源基因在飼料加工過程中的變化和多種成分的干擾，優(yōu)化完善檢測(cè)技術(shù)參數(shù)，將有利于推動(dòng)LAMP在轉(zhuǎn)基因飼料快速檢測(cè)中的應(yīng)用。這對(duì)于建立轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標(biāo)識(shí)制度，完善轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品使用、動(dòng)態(tài)監(jiān)控和積累基礎(chǔ)數(shù)據(jù)都具有重要意義。

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