組織工程化軟骨分泌蛋白的初步蛋白質(zhì)組學(xué)分析

劉霞 周廣東 劉偉 曹誼林

組織工程化軟骨分泌蛋白的初步蛋白質(zhì)組學(xué)分析

劉霞 周廣東 劉偉 曹誼林

目的通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)篩選組織工程化軟骨分泌的可溶性蛋白中具有軟骨誘導(dǎo)作用的因子。方法分別培養(yǎng)人軟骨細(xì)胞與皮膚成纖維細(xì)胞，接種到PGA上，兩種細(xì)胞-材料復(fù)合物培養(yǎng)2周后，移至無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)6 d，并收集所有培養(yǎng)液，用于差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析。結(jié)果蛋白組學(xué)分析顯示有21個(gè)差異點(diǎn)。對(duì)其中差異最大的點(diǎn)作質(zhì)譜分析，顯示該蛋白與Col2A1異構(gòu)體2最為匹配。結(jié)論用蛋白質(zhì)組學(xué)方法，可以高通量篩選軟骨細(xì)胞分泌的，與軟骨分化相關(guān)的重要蛋白；Col2A1異構(gòu)體2可能與軟骨分化有關(guān)。

組織工程化軟骨蛋白質(zhì)組學(xué)誘導(dǎo)因子

我們的前期研究已證實(shí)，軟骨細(xì)胞提供的組織微環(huán)境能夠誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）向軟骨分化[1－2]，特別是軟骨細(xì)胞分泌的可溶性因子發(fā)揮了重要的誘導(dǎo)作用[3]。但是，尚不清楚究竟是哪些可溶性因子在發(fā)揮作用。

可溶性因子成分種類繁多，需要采用大容量、多因素的方法進(jìn)行分析，蛋白質(zhì)組學(xué)是比較合適的研究手段[4]。因此，我們收集軟骨細(xì)胞-材料復(fù)合物和成纖維細(xì)胞-材料復(fù)合物的培養(yǎng)液，期望通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)分析，比較兩者分泌蛋白的差異，初步篩選可能具有誘導(dǎo)作用的因子。

1 材料與方法

1.1 取材來(lái)源

流產(chǎn)胎兒，4～6月齡，性別不限，由411醫(yī)院提供，獲家屬知情同意。

1.2 三維支架材料制備

[5]的方法，將聚羥基乙酸（PGA）均勻地嵌入圓柱狀硅膠模具內(nèi)定型，消毒后置于六孔板內(nèi)備用。

1.3 胎兒關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增及接種

于無(wú)菌條件下切取胎兒部分關(guān)節(jié)軟骨，切成約2mm×2mm×1mm大小的軟骨塊。加入0.1%膠原酶NB4，37℃下消化2 h，棄上清，換0.05%膠原酶NB4消化過(guò)夜，過(guò)濾、離心、洗滌，以含10%FBS的低糖DMEM培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液。以3×104cells/cm2密度接種于培養(yǎng)皿內(nèi)，置于37℃、5%CO2、100%飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天換液1次。細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到90%融合時(shí)，以0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化、傳代。將第一代細(xì)胞接種到PGA支架材料，每個(gè)培養(yǎng)孔內(nèi)加入5 mL常規(guī)培養(yǎng)液，于37℃、5% CO2、100%飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 胎兒皮膚成纖維細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增及接種

取胎兒背部皮膚組織，去除皮下脂肪后加入0.1%中性蛋白酶，4℃下消化過(guò)夜，揭去表皮層。真皮組織以0.1%膠原酶NB4于37℃下消化8 h，過(guò)濾、離心、洗滌，加入含10%FBS的低糖DMEM培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，以2×104cells/cm2的密度接種于培養(yǎng)皿，置于37℃、5%CO2、100%飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天換液1次，細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)85%融合后傳代。將第二代細(xì)胞接種到PGA支架，每個(gè)培養(yǎng)孔內(nèi)加入5 mL常規(guī)培養(yǎng)液，于37℃、5%CO2、100%飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.5 蛋白質(zhì)組學(xué)分析

1.5.1 培養(yǎng)液收集

細(xì)胞-材料復(fù)合物培養(yǎng)2周后，用PBS沖洗3次，換成無(wú)血清培養(yǎng)液培養(yǎng)，48 h收集一次培養(yǎng)液，收集3次。收集的培養(yǎng)液以2 000 r/min離心8min，取上清置于-80℃冰箱備用。由中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院蛋白質(zhì)組研究分析中心完成蛋白質(zhì)組學(xué)研究。

1.5.2 樣品的蛋白濃縮

樣品經(jīng)超濾、除鹽和濃縮后，進(jìn)行蛋白定量。雙向電泳采用12.5%聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE），上樣量50μg，IEF為pH值3～10非線性膠條（電泳條件：30 V、10 h，500 V、1 h，1 000V、1 h，8 000 V、8 h，500 V、4 h），電泳至溴酚藍(lán)距離膠下沿0.5 cm，然后銀染、掃描，獲得圖譜。對(duì)樣品之間量變情況進(jìn)行分析，采用Image Master軟件分析報(bào)告（C lass report ratio≥1.5），所有差異點(diǎn)比較均為P＜0.05。

1.5.3 質(zhì)譜分析

取分泌差異最大的蛋白點(diǎn)作質(zhì)譜分析。膠內(nèi)胰酶酶解20 h，抽提酶解肽段。Zip Tip脫鹽后，液相色譜-電噴霧離子化質(zhì)譜（ESI-MS）檢測(cè)。全掃描后采集10個(gè)碎片圖譜（MS2 scan），用Bioworkers軟件搜索IPIhuman蛋白庫(kù)，得到鑒定的蛋白質(zhì)結(jié)果。過(guò)濾參數(shù)為：當(dāng)Charge+1，Xcorr≥1.9；當(dāng)Charge+2，Xcorr≥2.2；當(dāng)Charge+3，Xcorr≥3.75；其中DelCN≥0.1。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 胎兒軟骨細(xì)胞與成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)情況

原代軟骨細(xì)胞12～24 h貼壁，貼壁時(shí)呈圓形，伸展后呈多角形，以類似同源細(xì)胞群的生長(zhǎng)方式形成獨(dú)立小群體，5 d左右可達(dá)90%匯合，傳代后成多角形，細(xì)胞增大。

原代成纖維細(xì)胞約48 h貼壁，貼壁時(shí)呈小三角形或長(zhǎng)梭形，約7 d達(dá)到85%以上匯合，傳代后增殖速度加快，呈長(zhǎng)梭形或細(xì)長(zhǎng)紡錘形，細(xì)胞排列有一定方向性（圖1）。

圖1 倒置顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)（40×）

2.2 二維電泳

取50μg蛋白上樣，得到比較理想的二維電泳圖譜，背景較好，蛋白點(diǎn)的遷移也基本穩(wěn)定。取軟骨細(xì)胞-材料復(fù)合物的培養(yǎng)液濃縮蛋白，重復(fù)3次二維電泳實(shí)驗(yàn)，分別分離出1 670、2 194和2 076點(diǎn)；同法處理成纖維細(xì)胞-材料復(fù)合物的培養(yǎng)液濃縮蛋白，分別分離出1 984、2 296和1 847點(diǎn)（圖2）。以軟骨細(xì)胞-材料復(fù)合物分泌蛋白的電泳膠作為參考膠，與成纖維細(xì)胞-材料復(fù)合物分泌蛋白的電泳膠比較，找到21個(gè)差異點(diǎn)。

圖2 二維電泳結(jié)果顯示兩者比較有21個(gè)差異點(diǎn)

2.3 質(zhì)譜分析

取軟骨細(xì)胞較成纖維細(xì)胞分泌差異最大的蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析，顯示該蛋白與Col2A1異構(gòu)體2最為匹配。

3 討論

既往研究證實(shí)，軟骨細(xì)胞-材料復(fù)合物分泌的可溶性因子作為一個(gè)整體誘導(dǎo)因素，能夠單獨(dú)誘導(dǎo)BMSCs向軟骨分化、并形成軟骨組織[3]。我們認(rèn)為，這些可溶性因子是軟骨微環(huán)境發(fā)揮軟骨誘導(dǎo)作用的重要因素之一。軟骨細(xì)胞能夠分泌TGF-β、IGF等多種生長(zhǎng)因子，在軟骨細(xì)胞的增殖與分化中發(fā)揮重要作用[6－7]。但是，尚不清楚這些因子或其他因子，在誘導(dǎo)BMSCs向軟骨分化中是否也發(fā)揮重要作用。

蛋白質(zhì)組學(xué)是對(duì)基因組編碼的所有蛋白質(zhì)，即蛋白質(zhì)組進(jìn)行大規(guī)模研究的一門(mén)科學(xué)[5]。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)具有大規(guī)模、高通量等優(yōu)點(diǎn)，可用于研究復(fù)雜的多種細(xì)胞因子和蛋白質(zhì)的變化，因而已逐漸成為干細(xì)胞和組織工程領(lǐng)域新的研究熱點(diǎn)[8－9]。前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)軟骨細(xì)胞-材料復(fù)合物分泌的可溶性因子能夠誘導(dǎo)BMSCs向軟骨分化，而成纖維細(xì)胞-材料復(fù)合物分泌的可溶性因子卻沒(méi)有成軟骨誘導(dǎo)作用。因此，我們希望通過(guò)對(duì)這兩種細(xì)胞-材料復(fù)合物所分泌可溶性蛋白的差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究，篩選軟骨細(xì)胞分泌的、具有軟骨誘導(dǎo)作用的可溶性因子。

軟骨細(xì)胞高表達(dá)的蛋白對(duì)軟骨分化有正向誘導(dǎo)作用的可能性較大，因此以軟骨細(xì)胞分泌蛋白的2-D膠作為參考膠，與成纖維細(xì)胞分泌蛋白比較，共找到21個(gè)差異點(diǎn)。我們?nèi)≤浌羌?xì)胞較成纖維細(xì)胞高表達(dá)，且分泌水平差異最大的蛋白進(jìn)行質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)其與Col2A1異構(gòu)體2的同源性最高。

Ⅱ型膠原為軟骨細(xì)胞特異性分泌的蛋白。Ⅱ型前膠原根據(jù)不同的剪接方式有兩種表達(dá)形式，Col2A和Col2B。其中Col2A僅在軟骨前體細(xì)胞和軟骨聚集和生長(zhǎng)區(qū)域表達(dá)，而已分化的軟骨細(xì)胞僅分泌Col2B[10-11]。Col2A前膠原的氨基端能夠與BMP-2、TGF-β相結(jié)合，誘導(dǎo)體內(nèi)、外軟骨形成[12-13]。關(guān)于Col2A1異構(gòu)體2在軟骨細(xì)胞中的表達(dá)情況及其在軟骨分化中的作用，迄今尚無(wú)報(bào)道。我們發(fā)現(xiàn)，Col2A1異構(gòu)體2在軟骨細(xì)胞-材料復(fù)合物分泌的蛋白中特異性高表達(dá)，推測(cè)它可能在軟骨分化中也具有一定的誘導(dǎo)作用。

在后續(xù)研究中，我們將對(duì)其他差異蛋白進(jìn)行分析，并在此基礎(chǔ)上通過(guò)誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)和中和抗體阻斷實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步篩選出能誘導(dǎo)BMSCs向軟骨分化的因子。此外，Col2A1異構(gòu)體2在軟骨分化中的作用，也是我們今后的研究重點(diǎn)之一。

參考文獻(xiàn)

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Prelim inary Proteom ic Analysis of Proteins Secreted by Tissue-engineered Cartilage

LIU Xia1,ZHOU Guangdong2, LIUWei2,CAO Yilin1,2.
1 Plastic Surgery Institute,Plastic Surgery Hospital,Chinese Academy of Medical Science,Beijing 100144,China;2 Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People′s Hospital,Shanghai Jiaotong University School ofMedicine,Shanghai200011,China.Corresponding author:ZHOU Guangdong.

ObjectiveTo screen the chondrogenic factors in soluble proteins secreted by the engineered cartilage using proteomic approach.M ethodsHuman chondrocytes and dermal fibroblastswere collected,and then seeded onto the PGA scaffolds.At 2 weeks,the two types of cell-scaffold constructswere cultured in serum-freemedia for 6 days.All the serumfree media were collected for proteomic analysis.ResultsThe proteome maps showed 21 difference spots.On mass spectrometry(MS),the protein showing the most significant difference of expression matched best with alpha 1 typeⅡcollagen isoform 2.ConclusionProteomic approach is a high throughoutmethod to screen the important chondrogenic factors secreted by the tissue-engineered cartilage.Alpha 1 typeⅡcollagen isoform 2 may be related to chondrogenic differentiation.

Tissue engineered cartilage;Proteomics;Inductive factors

book=145,ebook=17

Q816

A

1673－0364（2010）03－0145－03

10.3969/j.issn.1673-0364.2010.03.006

2010年3月3日；

2010年4月10日)

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展規(guī)劃項(xiàng)目（973項(xiàng)目）（2005CB522702）；國(guó)家高技術(shù)發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（863項(xiàng)目）重大專項(xiàng)（2006AA02A126）；高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金（200800231078）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（30801192，30973131，30772264）；上海市曙光計(jì)劃（08SG19）；上海市啟明星跟蹤計(jì)劃（09QH1401600）。

100144北京市中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院整形外科醫(yī)院（劉霞，曹誼林）；200011上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院整復(fù)外科（周廣東，劉偉，曹誼林）。

周廣東。